新疆野生一枝蒿粗多糖對流感疫苗小鼠免疫增強效果的分析

張愛蓮，王丹陽，趙淑述，趙　兵，張富春

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

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新疆野生一枝蒿粗多糖對流感疫苗小鼠免疫增強效果的分析

張愛蓮*，王丹陽，趙淑述，趙兵，張富春

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

用新疆野生一枝蒿粗多糖(wildArtemisiarupestrisL.crude polysaccharides，WARCP)通過肌肉注射免疫小鼠，研究其作為流感病毒疫苗(influenza virus vaccine，IVV)的佐劑效果和節(jié)約流感疫苗抗原用量的作用。WARCP與不同劑量(0.05、0.1、0.5 μg)的IVV配伍，肌肉注射免疫小鼠，觀察小鼠的生長狀態(tài)，通過ELISA法檢測血清中抗體IgG及IgG1、IgG2a的水平；MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖；流式細胞術(shù)檢測細胞因子CD4+IL-4和CD8+IFN-γ以及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達水平。結(jié)果表明WARCP對小鼠的生長狀態(tài)沒有顯著的影響(P>0.05)；WARCP能夠顯著提高不同劑量IVV特異性IgG及其IgG1、IgG2a的抗體水平(P<0.05)；增強淋巴細胞的增殖(P<0.05)；顯著提高IL-4和IFN-γ的分泌水平(P<0.05)；降低Treg細胞的表達水平(P<0.05)；尤其可以提高低劑量IVV的體液和細胞免疫反應，至少減少抗原用量91%。因此，WARCP作為IVV的佐劑通過降低Treg細胞的水平，顯著增強了IVV的免疫效果，尤其是Th1型的免疫反應，能夠很好地節(jié)約抗原用量，具有良好的安全性。

流感疫苗；一枝蒿；多糖；節(jié)約抗原；肌肉免疫

流感是一種最常見的危害人類健康的傳染病，尤其是在高危人群中，如兒童和老人。研制流感疫苗是針對預防流感最有效的一種方法，但是由于流感病毒表面的抗原頻繁突變，在大流感流行的時候，流感疫苗往往不能夠滿足接種人群的用量。而使用疫苗佐劑可以顯著增強流感疫苗免疫效果，減少流感疫苗的抗原用量，使更多的易感人群接種流感疫苗，達到迅速應對流感大流行的目的[1]。流感疫苗的佐劑雖然有鋁佐劑和MF59，但是MF59或AS03僅在歐洲流感大流行時準予使用[2-3]，目前人們使用的流感疫苗中并不含有佐劑，因此尋找安全有效的佐劑用于流感疫苗，降低抗原的用量，擴大流感流行時接種人群的數(shù)量仍然是流感疫苗研究的重要課題。

傳統(tǒng)的中草藥在人類疾病的治療中有悠久的歷史，大量的證據(jù)表明中草藥具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為新型疫苗佐劑的候選資源[4]。多糖是中草藥的主要成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[5-6]。國內(nèi)外研究者們從多種傳統(tǒng)中草藥中提取多糖成分研究其佐劑效果，如黃芪多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、淫羊藿多糖等發(fā)現(xiàn)其具有很好的佐劑活性，達到增強免疫功能的作用而成為新型疫苗的候選佐劑[7-11]。

新疆野生一枝蒿(WARCP)主要含有多糖、黃酮等多種化合物[12]，多糖為其主要活性成分之一。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)WARCP與IVV配伍進行皮下免疫小鼠后，WARCP具有很好的佐劑效果[13]。結(jié)合實際應用中IVV多采用肌肉途徑接種，為此本研究將WARCP作為IVV的新型疫苗佐劑，通過肌肉途徑免疫小鼠，檢測其免疫增強的效果和節(jié)約抗原用量的作用，評價WARCP作為IVV佐劑的可行性，為WARCP作為IVV佐劑的研制提供實驗依據(jù)，并為后期研制禽流感以及其他病毒疫苗的佐劑奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

新疆野生一枝蒿全草(市售)。季節(jié)性流感病毒裂解疫苗(2014/2015株流感病毒裂解疫苗，主要成分：A/加利福尼亞/7/2009(H1N1) pdm09-衍生株(NYMC X-179A)、A/德克薩斯/50/2012(H3N2)-衍生株(NYMC X-223A)、B/馬薩諸塞/2/2012-衍生株(NYMC BX-51B)(血凝素含量均為30 μg·mL-1)(市售)。辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠的IgG、IgG1、IgG2a購自美國Southbiotech公司。刀豆蛋A(ConA)和脂多糖(LPS)為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。噻唑藍(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品。N-四甲基聯(lián)苯胺( TMB) 購自上海藍季科技發(fā)展有限公司。流式抗體PE-CD3e、FITC-CD8a、APC-CD4、FITC-CD4、PE-IL-4、PE-IFN-γ、APC-CD25和PE-Foxp3、Fixation/Permeabilization Solution、Perm/Wash buffer、Golgi stop均購自美國BD公司。 Regulatory T Cell Staining Kit購自eBioscience公司。RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2新疆野生一枝蒿粗多糖的制備

采用水提醇沉法提取新疆野生一枝蒿粗多糖[14]。用Sevag法對新疆野生一枝蒿粗多糖除蛋白質(zhì)，得到除蛋白質(zhì)的新疆野生一枝蒿粗多糖粉末[15]。蒽酮-硫酸法[16]測定新疆野生一枝蒿粗多糖中多糖的含量為30.94%[13]。

1.3實驗動物與免疫

ICR小鼠，雌性，6～8周齡，18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。40只小鼠隨機分為8組(表1)。WARCP 300 μg分別與0.05、0.1、0.5 μg IVV配伍后免疫小鼠為試驗組，以不同劑量的IVV單獨免疫組為試驗對照組，生理鹽水免疫組為空白對照組，IVV與鋁佐劑組為陽性對照組，于0 d和14 d分別進行肌肉免疫，體積為100 μL。免疫后不同時間點稱取小鼠體重并觀察小鼠的生長狀態(tài)。

另取20只小鼠，設(shè)IVV 0.05 μg、IVV 0.05 μg+WARCP 300 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg 4組(n=5)，分別于0 d和14 d進行皮下注射免疫，用于分析不同免疫途徑對抗體滴度的影響。

1.4WARCP免疫后小鼠血清IgG及亞類抗體檢測

初免后7、14、21 d進行小鼠眼眶采血，收集上清，用間接ELISA法測定血清中的抗體水平。簡述如下：將0.125 μg·mL-1的2014/2015株流感病毒裂解疫苗加入96孔板中，4 ℃過夜；37 ℃封閉1 h；每孔加入1∶200稀釋后的血清，37 ℃1 h；每孔分別加入1∶5 000稀釋的HRP標記IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃ 1 h；加入TMB底物避光顯色10 min，終止反應后OD450/655 nm的條件下測定吸光度。

表1免疫小鼠分組表

Table 1The group of immunization

分組Groups動物Animals數(shù)量Number疫苗(或?qū)φ?Vaccine(orcontrol)1ICR小鼠50.9%NaCl2ICR小鼠5IVV(influenzavirusvaccine)0.05μg3ICR小鼠5IVV0.05μg+WARCP300μg4ICR小鼠5IVV0.1μg5ICR小鼠5IVV0.1μg+WARCP300μg6ICR小鼠5IVV0.5μg7ICR小鼠5IVV0.5μg+WARCP300μg8ICR小鼠5IVV0.1μg+Alum100μg

1.5WARCP免疫后小鼠淋巴細胞增殖的檢測

小鼠二免后7 d，在無菌條件下制成脾細胞懸液，將5×106個·mL-1脾細胞懸液加入96孔板，分別加入3.5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的LPS，設(shè)置3個復孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL DMSO后用酶標儀檢測OD570/630 nm條件下的吸光度，計算各組刺激指數(shù)(SI)，SI=(各刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)/(未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞因子CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達

從小鼠分離得到的脾細胞，取2×106個細胞加入到24孔板里，加入IVV抗原0.6 μg，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。加入Golgi stop過夜培養(yǎng)后，收集細胞，用FITC-CD4進行細胞表面染，室溫避光30 mins。每管加入150 μL Cytofix/Cytoperm(BD)重懸細胞，4 ℃，30 min；加入1 mL Perm/Wash buffer (BD)，離心，棄上清。加入1 μL 的PE-IL-4和PE-IFN-γ；室溫避光20 min。每個樣用3 mL 1× Perm/Wash buffer (BD)洗，PBS重懸細胞，流式細胞術(shù)檢測。

1.7流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達

制備小鼠二免后7 d的脾細胞懸液，細胞計數(shù)后將濃度調(diào)整為2×106個，用eBioscience 的Regulatory T Cell Staining Kit進行細胞染色，按照說明書進行，簡述如下：細胞洗滌后，1 200 r·min-1離心7 min，各加入APC-CD4、FITC-CD25進行表面染色，避光室溫 20 min。加固定破膜液120 μL，用1 mL 1× Wash buffer洗一次，各加1 μL PE-Foxp3，室溫孵育20 min。每個樣加入1 mL wash buffer，離心，棄上清。加入300 μL PBS重懸細胞，過銅網(wǎng)，流式上機檢測，用FlowJo軟件進行分析。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結(jié)　果

2.1WARCP對小鼠生長狀況的影響

WARCP與IVV共免疫后，各組小鼠體重增長無顯著差異 (P>0.05)，見表2。表明以WARCP為IVV的佐劑對小鼠機體刺激性較小，對小鼠的生長并無顯著影響。

2.2WARCP對IVV誘導小鼠IgG抗體滴度的影響

用間接ELISA法檢測小鼠初免后不同時期血清中IgG的抗體滴度，結(jié)果如圖1。隨著免疫后時間的增加，各組抗體滴度水平也逐漸增加；隨著流感單獨免疫組IVV劑量的增加，低、中、高劑量組的IgG抗體滴度也逐漸增加；在加入了WARCP300 μg后，流感低劑量、中劑量組的抗體滴度均顯著提高。其中，初免后14 d，低劑量IVV 0.05 μg+WARCP 300 μg與IVV 0.05 μg相比增加了2.5倍，其滴度比高劑量IVV單獨免疫組還高。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與IVV 0.1 μg相比增加了近1.7倍，其滴度與鋁佐劑組相當。但高劑量IVV組加入WARCP300 μg后沒有顯著提高。

g

各組小鼠免疫后相同時間的體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05)

No statistical difference between groups at the same time (P>0.05)

圖1　間接ELISA檢測初免后不同時期小鼠血清中IgG的抗體滴度Fig.1　Detection of IgG titer in serum of different times after immunization by indirect ELISA

比較小鼠肌肉免疫和皮下免疫后14 d的血清中IgG的抗體滴度，結(jié)果如圖2，肌肉免疫的IVV單獨免疫組IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg的抗體滴度均比皮下免疫后的高至少2倍；WARCP300 μg與IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg配伍后，兩種免疫方式各組IgG抗體滴度均比IVV單獨免疫組有顯著增高，肌肉免疫后的滴度比皮下免疫后的高至少2倍。

2.3WARCP對IVV誘導小鼠抗體亞類的影響

用間接ELISA法檢測小鼠初免后14 d血清中抗體亞類IgG1和IgG2a的水平，結(jié)果如圖3，WARCP 300 μg和低、中劑量IVV0.05 μg、IVV0.1 μg配伍后的血清IgG1和IgG2a抗體水平均顯著高于低、中劑量的IVV單獨免疫組(P<0.05)，其中，中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對照組IVV 0.1 μg+Alum相比無顯著差異(P>0.05)；各

圖2　間接ELISA檢測不同免疫途徑初免后14 d小鼠血清中IgG的抗體滴度Fig.2　Detection of IgG titer in serum of 14 d after immunization from different immune pathway by indirect ELISA

免疫組IgG1的抗體水平均高于IgG2a的抗體水平。但高劑量IVV組加入WARCP300 μg后的血清IgG1和IgG2a抗體水平均沒有顯著提高。

2.4WARCP對IVV誘導小鼠淋巴細胞增殖的影響

MTT法檢測初免后21 d各組小鼠淋巴細胞的增殖情況，加入濃度為3.5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的LPS刺激物后各組的刺激指數(shù)如圖4：隨著IVV 0.05 μg、IVV 0.1 μg、 IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，其刺激指數(shù)也不斷升高。ConA和LPS誘導WARCP 300 μg配伍的IVV 低劑量、中劑量組淋巴細胞的增殖活性顯著升高 (P<0.05)，高劑量組無顯著差異(P>0.05)。此外，中劑量IVV 0.1 μg + WARCP 300 μg與鋁佐劑組相比無顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01 Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01 圖3　間接ELISA檢測初免后14 d小鼠血清中抗體分型的水平Fig.3　Detection of antibody subclasses in serum by indirect ELISA in 14 d after first immunization

與IVV單獨免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖4　MTT法檢測初免后21 d小鼠脾中淋巴細胞的增殖Fig.4　Detection of splenocyte proliferation by MTT in 21 d after first immunization

2.5流式細胞術(shù)檢測CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的水平

流式細胞術(shù)檢測初免后21 d各組小鼠的CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達水平，結(jié)果如圖5：隨著單獨免疫IVV 0.05 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，CD4+IL-4、CD8+IFN-γ分泌水平也不斷升高。WARCP 300 μg配伍的低劑量、中劑量組的CD4+IL-4、CD8+IFN-γ分泌水平顯著高于低劑量、中劑量IVV單獨免疫組(P<0.05)，WARCP 300 μg配伍高劑量IVV組無顯著差異(P>0.05)。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對照組IVV 0.1 μg+Alum相比CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的分泌水平無顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖5　WARCP對流感疫苗免疫后小鼠脾分泌CD4+IL-4、CD8+IFN-γ水平的影響Fig.5　The secretion level of CD4+IL-4，CD8+IFN-γ in the spleen of mice immunized with IVV mixed WARCP

2.6流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達

為了檢測免疫后各組小鼠調(diào)節(jié)性T細胞的表達水平，用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達，結(jié)果如圖6：隨著單獨免疫組IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，CD4+CD25+Foxp3+表達水平也不斷降低。WARCP 300 μg配伍IVV低劑量、中劑量組的CD4+CD25+Foxp3+表達水平顯著低于IVV低劑量、中劑量單獨免疫組(P<0.05)，WARCP 300 μg配伍IVV高劑量組無顯著差異(P>0.05)。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對照組Alum相比CD4+CD25+Foxp3+表達水平無顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖6　WARCP對流感疫苗免疫后小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比的影響Fig.6　The percentage of CD4+CD25+Foxp3+Treg cell in the spleen of mice immunized with IVV mixed WARCP

3　討　論

隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，越來越多的中草藥組分被鑒定和分離出來，其中包括多糖、皂素、酚類化合物及類黃酮等，這些組分作為佐劑能促進激活抗原遞呈細胞，促進細胞因子的合成，增強抗腫瘤和抗感染的免疫反應[17]。尤其是補益類中藥的有效成分，能影響機體的免疫功能，很有希望開發(fā)成為新型疫苗佐劑?，F(xiàn)代藥理學研究表明，多糖類作為佐劑不僅可以通過激活T、B淋巴細胞等免疫細胞對機體的免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，還可以通過激活補體，促進干擾素生成，誘生細胞因子等方式得以實現(xiàn)[18]。本研究旨在探討WARCP作為IVV的佐劑，加強IVV的免疫效果和節(jié)約IVV抗原用量的作用。將一定劑量的WARCP與不同劑量的IVV配伍后免疫小鼠作為試驗組，以不同劑量IVV單獨免疫小鼠為無佐劑對照組，鋁佐劑組作為陽性對照組，肌肉途徑進行免疫，檢測WARCP與IVV配伍后對小鼠免疫應答的增強效果。

研究發(fā)現(xiàn)，WARCP配伍IVV肌肉途徑免疫小鼠后，各組小鼠體重均沒有顯著差異，也沒有明顯的過敏反應，表明WARCP并未對小鼠的生長狀況產(chǎn)生影響，WARCP具有一定的安全性。合適的抗原劑量與合適多糖劑量配伍才會起到理想的免疫效果。IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，其含量高低可以反映機體的防御能力[19]?？贵wIgG滴度結(jié)果表明，WARCP可以顯著提高IVV誘導產(chǎn)生的IgG抗體滴度，IVV低劑量組加入WARCP后與IVV高劑量單獨組相比可減少抗原用量91%，WARCP顯著增強了IVV激起的體液免疫應答水平，并節(jié)約抗原的用量，這表明通過本試驗確定了合適的抗原劑量與多糖的劑量配伍，因此起到了很好的免疫增強效果[20-21]。為了比較不同的免疫途徑對小鼠抗體水平的影響，對初免后14 d的IgG滴度進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉途徑免疫后各組的抗體滴度水平均比皮下免疫高至少2倍，說明肌肉免疫途徑效果優(yōu)于皮下免疫。

在小鼠體內(nèi)，IgG1是依賴Th2途徑免疫應答的特征性標志，而IgG2a是依賴Th1途徑免疫應答的特征性標志[22]。初免后14 d小鼠血清抗體亞類IgG1和IgG2a的結(jié)果表明：WARCP配伍低、中、高劑量的IVV后均能同時提高流感低、中劑量IVV的IgG1和IgG2a的水平，說明WARCP作為IVV的佐劑能夠同時促進Th1和Th2免疫反應，尤其可以提高Th1型的免疫反應。

淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的高低可反映機體的免疫功能狀態(tài)，常用淋巴細胞增殖指數(shù)反應機體細胞免疫能力[19]。本研究結(jié)果表明WARCP能顯著性地提高ConA誘導的T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖，WARCP與低劑量IVV配伍組的刺激指數(shù)和高劑量IVV單獨免疫組無統(tǒng)計學差異，說明WARCP能夠顯著提高流感疫苗的細胞免疫水平。

在免疫應答識別和激活階段，有多種細胞因子可刺激免疫活性細胞的增殖，IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，還可以激活CTL[18]。IL-4主要產(chǎn)生于活化T細胞和肥大細胞中，它可以刺激B淋巴細胞的增殖。本試驗通過流式細胞術(shù)檢測CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WARCP均能顯著提高低、中劑量IVV的IL-4和IFN-γ表達水平，表明WARCP與IVV配伍后可以產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫應答。

Foxp3對CD4+CD25+Treg細胞的發(fā)展和功能是至關(guān)重要的，起到免疫抑制的調(diào)節(jié)作用[23]。有研究發(fā)現(xiàn)川牛膝多糖作為佐劑通過抑制CD4+CD25+Foxp3+的表達來增強體液和細胞免疫反應[24]。本研究發(fā)現(xiàn)WARCP作為低、中劑量IVV的佐劑能顯著降低CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達。這些結(jié)果表明，WARCP能夠通過抑制Treg細胞的表達來增強免疫應答。

綜上所述，新疆野生一枝蒿粗多糖通過肌肉途徑免疫后可以增強特異性的體液免疫和細胞免疫反應，效果優(yōu)于皮下免疫途徑，尤其是激發(fā)了Th1型免疫反應并抑制了Treg細胞的表達，可以節(jié)約抗原用量91%。因此，新疆野生一枝蒿粗多糖可以為流感病毒疫苗新型免疫佐劑的研制及用于解決流感大暴發(fā)時流感疫苗供應短缺問題提供重要的研究參考。

[1]TETSUTANI K，ISHII K J.Adjuvants in influenza vaccines[J].Vaccine，2012，30(52)：7658-7661.

[2]KHURANA S，VERMA N，YEWDELL J W，et al.MF59 adjuvant enhances diversity and affinity of antibody-mediated immune response to pandemic influenza vaccines[J].SciTranslMed，2011，3 (85)：85-88.

[3]WALKER W T，F(xiàn)AUST S N.Monovalent inactivated split-virion AS03-adjuvanted pandemic influenza A (H1N1) vaccine[J].ExpertRevVaccines，2010，9(12)：1385-1398.

[4]LV X H，LIU W，LI Z L，et al.Research progress on Chinese traditional medicine as vaccine adjuvants[J].JTraditChinMed，2008，6(2)：64-67.

[5]LI J Y，LI J Y，ZHANG F C.The immunoregulatory effects of Chinese herbal medicine on the maturation and function of dendritic cells[J].JEthnopharmacol，2015，171(2)：184-195.

[6]張寶柱.補益類中藥所含多糖成分的免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J].中國中醫(yī)藥資訊，2011，3(9)：41-42.

ZHANG B Z.Research progress on immunomodulatory effects of Chinese Herbal Polysaccharides composition[J].JournalofChinaTraditionalChineseMedicineInformation，2011，3(9)：41-42.(in Chinese)

[7]CHEN H，JIAO H，CHENG Y，et al.Invitroandinvivoimmunomodulatory activity of Okra (AbelmoschusesculentusL.) polysaccharides[J].JMedFood，2016，19(3)：253-265.

[8]ZHU F J，LIU X SUN Z H，et al.Immune-enhancing effects of taishan pinus massoniana pollen polysaccharides on DNA vaccine expressingBordetellaaviumompA[J].FrontMicrobiol，2016，66(7)：1-8.

[9]董娜，李倩，張貴強，等.淫羊藿多糖對甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的免疫佐劑作用[J].國際藥學研究雜志，2013，40(1)：63-68.

DONG N，LI Q，ZHANG G Q，et al.Adjuvant effect of Epimedium polysaccharide for H1N1 influenza viruses split vaccine[J].JournalofInternationalPharmaceuticalResearch，2013，40(1)：63-68.(in Chinese)

[10]謝國秀，王芙艷，楊忠東，等.茯苓多糖對流感滅活疫苗的免疫增強作用[J].生命科學研究，2009，13(3)：246-250.

XIE G X，WANG F Y，YANG Z D，et al.Enhanced immune effects of pachymaran on inactivated influenza virus vaccine[J].LifeScienceResearch，2009，13(3)：246-250.(in Chinese)

[11]YI Y，ZHANG M W，LIAO S T，et al.Structural features and immunomodulatory activities of polysaccharides of longan pulp[J].CarbohydPolym，2012，87(1)：636-643.

[12]GU D Y，ABDULLA R，AISA H A，et al.Characterization and identification of chemical compositions in the extract ofArtemisiarupestrisL.by liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J].RapidCommunMassSp，2012，26(2)：83-100.

[13]王丹陽，楊雨，張愛蓮，等.新疆野生一枝蒿粗多糖作為流感病毒疫苗佐劑的免疫效果[J].中華微生物學與免疫學雜志，2016，36(6)：230-234.

WANG D Y，YANG Y，ZHANG A L，et al.Efficacy of using Xinjiang wildArtemisiarupestrisL.crude polysaccharides as a immunologic adjuvant for influenza virus vaccine[J].ChineseJournalofMicrobiologyandImmunology，2016，36(6)：230-234.(in Chinese)

[14]王如濤，吳綿斌，林建平，等.植物多糖分離提取技術(shù)的研究進展[J].中國生物工程志，2013，33(7)：118-123.

WANG R T，WU M B，LIN J P，et al.Research progress on the extraction technology of plant polysaccharide[J].ChinaBiotechnology，2013，33(7)：118-123.(in Chinese)

[15]劉玉佳，孔繁東，劉兆芳，等.桔梗多糖Sevag法除蛋白工藝的研究[J].中國調(diào)味品，2014，39(4)：5-7.

LIU Y J，KONG F D，LIU Z F，et al.Research on technology of deproteinization from polysaccharide of platycodon grandiflorum by Sevag method[J].ChinaCondiment，2014，39(4)：5-7.(in Chinese)

[16]DUBOIS M，GILLES K，HAMILTON J K，et al.A colorimetric method for the determination of sugars[J].Nature，1951，168(4265)：167.

[17]LAI C Y，HUNG J T，LIN H H，et al.Immunomodulatory and adjuvant activities of a polysaccharide extract of Ganoderma luciduminvivoandinvitro[J].Vaccine，2010，28(31)：4945-4954.

[18]JIANG M H，ZHU L，JIANG J G.Immunoregulatory actions of polysaccharides from Chinese herbal medicine[J].ExpertOpinTherTar，2010，14(12)：1367-1402.

[19]董耀澤，李曉云，張晉強，等.復方中藥對豬嗜血支原體感染預防作用的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2016，47(2)：404-410.

DONG Y Z，LI X Y，ZHANG J Q，et al.Prophylactic effect of compound Chinese herbal medicine onMycoplasmasuisinfection[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2016，47(2)：404-410.(in Chinese)

[20]RUPP R，LUCKASEN G J，KIRSTEIN J L，et al.Safety and immunogenicity of different doses and schedules of a live attenuated tetravalent dengue vaccine (TDV) in healthy adults：A Phase 1b randomized study[J].Vaccine，2015，33(46)：6351-6359.

[21]HONDA Y，SAADE F，PETROVSKY N.AdvaxTM，a polysaccharide adjuvant derived from delta inulin，provides improved influenza vaccine protection through broad-based enhancement of adaptive immune responses[J].Vaccine，2012，30(36)：5373-5381.

[22]HUBER V C，MCKEON R M，BRACKIN M N，et al.Distinct contributions of vaccine induced immunoglobulin G1(IgG1) and IgG2aantibodies to protective immunity against influenza[J].ClinVaccineImmunol，2006，13(9)：981-990．

[23]ZARAGOZA B，CHEN X，OPPENHEIM J J，et al.Suppressive activity of human regulatory T cells is maintained in the presence of TNF[J].NatMed，2016，22(1)：16-17.

[24]FENG H，F(xiàn)AN J，DU X，et al.Sulfated Radix Cyathulae officinalis polysaccharides act as adjuvant via promoting the dendritic cell maturation and suppressing Treg frequency[J].ImmunolInvest，2015，44(3)：288-308.

(編輯白永平)

The Analysis of Immune Enhancement Effect of Xinjiang WildArtemisiarupestrisL.Crude Polysaccharides on Influenza Viruses Vaccines in Mice

ZHANG Ai-lian*，WANG Dan-yang，ZHAO Shu-shu，ZHAO Bing，ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering，CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China)

The immune effects of Xinjiang WildArtemisiarupestrisL.crude polysaccharides (WARCP) as an adjuvant and sparing antigen on different doses of influenza virus vaccine (IVV) were explored.ICR mice were intramuscularly immunized respectively with different doses (0.05，0.1，0.5 μg) of the IVV alone or co-administered with 300 μg WARCP at 0 d and 14 d.The growth state of mice were observed，antibody level of IgG and IgG1，IgG2ain serum were tested by ELISA；splenocyte proliferations were tested by MTT；The expression levels of CD4+IL-4，CD8+IFN-γ and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells were tested by flow cytometry.The results showed that no significant differences in the body weight were observed between mice from different groups (P>0.05)；WARCP can significantly improve the antibody level of influenza-specific IgG and IgG1，IgG2a(P<0.05)；WARCP can significantly promote lymphocyte proliferation，the secretion level of IL-4 and IFN-γ (P<0.05),and significantly reduce the level of expression of Treg cells (P<0.05)；In particularly，it can enhance the humoral and cellular immunity responses of low-dose IVV,indicating an at least 91% reduction in vaccine dosage by adding WARCP as adjuvant.These results indicated that adding WARCP to IVV enhanced the immune efficacy of IVV by reducing the level of Treg cells，significantly promote Th1-type immune response particularly，it can be an adjuvant with the advantages of high safety and dose-sparing.

influenza virus vaccine；ArtemisiarupestrisL.；polysaccharides；antigen sparing；intramuscle immunity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.018

2016-05-16

自治區(qū)自然科學基金(201404061219)

張愛蓮(1968-)，女，山東東明人，副教授，博士，主要從事疫苗佐劑方面的研究，Tel：0991-5523400

張愛蓮，副教授，E-mail：xjzal@163.com

S852.52

A

0366-6964(2016)10-2089-09