葡萄皮多酚的提取、純化及組成研究

齊　巖，孫金月，程安瑋，檀　昕，謝春陽(yáng)

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春　130118； 2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南　250100；3山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南　250100)

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葡萄皮多酚的提取、純化及組成研究

齊巖1，2，孫金月2，3，程安瑋2，3，檀昕1，2，謝春陽(yáng)1

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南250100；3山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100)

以巨峰葡萄皮為原料，采用超聲波輔助提取法，研究葡萄皮多酚的提取工藝，并用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步通過(guò)HPLC法確定多酚的組成和含量。得出最佳的提取工藝參數(shù)為：料液比1∶40、超聲時(shí)間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%，提取率為29.16mg/g；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)葡萄多酚分離效果良好；在葡萄皮酚類(lèi)物質(zhì)中確定了10種單體酚，其中主要酚類(lèi)物質(zhì)為兒茶素，含量為15.74±0.21μg/mg。

葡萄；多酚；響應(yīng)面法；HPLC

多酚是植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要存在于植物的皮、根、葉、殼及果肉中[1]。多酚是一種天然抗氧化劑，具有防止慢性炎癥、心血管疾病、癌癥和糖尿病等功效[2-4]。葡萄是我國(guó)種植面積較大的水果，產(chǎn)量約占全世界水果總產(chǎn)量的1/4[5]。葡萄中多酚的含量較高，主要存在于葡萄籽和皮中，果肉中含量很少[6]。葡萄中多酚類(lèi)物質(zhì)主要包括花色素、原花色素、黃酮醇類(lèi)等[7]。目前有關(guān)葡萄多酚的研究較多，李鳳英等[8]人采用微波輔助提取法對(duì)葡萄皮中的酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提??；李婷等[9]人采用酶法對(duì)葡萄中的白藜蘆醇進(jìn)行了提取；牟京霞[10]對(duì)釀酒葡萄中的酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了研究，研究表明，表?xiàng)攦翰杷亍翰杷睾捅韮翰杷鼐侵饕煞?。超聲波輔助提取法可通過(guò)超聲波破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，從而提高提取率和縮短提取時(shí)間。鑒于葡萄在我國(guó)產(chǎn)量豐富、使用率高、副產(chǎn)物葡萄皮剩余量大等因素，系統(tǒng)評(píng)價(jià)其葡萄皮中酚類(lèi)的生物活性物質(zhì)對(duì)指導(dǎo)其開(kāi)發(fā)利用、實(shí)現(xiàn)變廢為寶、提高利用率具有重要意義。本文采用超聲波輔助萃取法，對(duì)葡萄皮中的多酚進(jìn)行提取純化，并運(yùn)用HPLC法測(cè)定了多酚的主要組成成分，以期為葡萄皮的利用提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

‘巨峰’葡萄，購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南大潤(rùn)發(fā)超市，獲取其中的葡萄皮，用打漿機(jī)打漿，然后冷凍干燥成粉備用。大孔樹(shù)脂AB-8，購(gòu)于上海摩速科學(xué)有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器

AR423CN型電子天平，奧豪斯(上海)儀器有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新藝生物科技有限公司；1012503型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RF-5301PC型可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；FD-1型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SHY-2A型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；VORTEX-5型漩渦混合器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；1200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent；ZORBAXSB-C18色譜柱，美國(guó)Agilent。

1.3試驗(yàn)試劑

2N福林試劑(Folinreagent)、標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸(gallicacid)Sigma公司；Na2CO3(分析純)天津市登科化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司。沒(méi)食子酸、兒茶素、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸、鞣花酸、蘆丁、鄰香草酸、槲皮素均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。

1.4葡萄皮多酚提取試驗(yàn)方法

黃浩認(rèn)為對(duì)馬克思共產(chǎn)主義的理解存在著價(jià)值理性和科學(xué)理性?xún)煞N模式和兩個(gè)重要維度，其中價(jià)值理性是馬克思共產(chǎn)主義思想形成的邏輯起點(diǎn)，其核心內(nèi)容在于對(duì)人的本質(zhì)和價(jià)值的揭示；科學(xué)理性是馬克思共產(chǎn)主義思想的升華，其核心在于揭示社會(huì)發(fā)展的規(guī)律性和共產(chǎn)主義是歷史發(fā)展的必然過(guò)程。馬克思共產(chǎn)主義思想的本真內(nèi)涵是兩者的辯證統(tǒng)一。[11]

1.4.1葡萄皮多酚的測(cè)定采用Folin-phenol法進(jìn)行測(cè)定[11，12]。取2mL蒸餾水加入200μL福林—酚試劑混勻，加入100μL多酚提取液，吹打均勻后加入20%的Na2CO3溶液900μL，混勻后在暗處放置2h，并在765nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以沒(méi)食子酸為標(biāo)樣，在10～500μg/mL范圍內(nèi)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0032x+0.0431，R2=0.9924)，計(jì)算提取液中多酚的含量。

1.4.2葡萄皮多酚提取工藝條件優(yōu)化稱(chēng)取500mg葡萄皮粉于50mL離心管，每組設(shè)置3個(gè)平行。設(shè)定了提取液濃度、料液比、提取功率、提取時(shí)間等4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.4.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)的因素和水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，每組3個(gè)平行。應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以葡萄皮多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。

1.5葡萄皮多酚的純化

將提取液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮到原體積1/7。將樹(shù)脂進(jìn)行填充，填充的高度為45cm，將濃縮液上柱進(jìn)行吸附，流速為6mL/min，上樣100mL。上樣結(jié)束后停止出樣，讓樹(shù)脂吸附30min，以便樣品能夠被樹(shù)脂完全吸附。吸附結(jié)束后用80%的乙醇進(jìn)行洗脫。將洗脫液再次進(jìn)行旋蒸濃縮，濃縮到原體積的1/4，冷凍干燥成粉。

1.6葡萄皮多酚的組成分析

多酚組成分析采用HPLC法，按照Amico等的方法進(jìn)行，并略有改進(jìn)[13]。檢測(cè)波長(zhǎng)280nm、流速1mL/min、柱溫40℃、進(jìn)樣量10μL，以峰面積外標(biāo)法定量。梯度洗脫：流動(dòng)相A∶水∶甲酸=9∶1、流動(dòng)相B∶乙腈∶甲酸=9∶1。梯度洗脫程序：0～5min，95%A；5～45min，95%A-70%A；45～46min，70%A-55%A；46～66min，55%A-45%A；66～67min，45%A-10%A；67～81min，10%A；81～82min，10%A-95%A；82～87min，95%A。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSSStatistics17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并以Design8.0.5.0進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化。

2　結(jié)果與討論

2.1葡萄皮多酚提取單因素試驗(yàn)

由圖1a可以看出，隨著乙醇濃度的不斷增加，葡萄皮多酚的提取率呈上升趨勢(shì)；濃度在30%～50%之間，葡萄皮多酚的提取率達(dá)最大，并且各組之間沒(méi)有顯著性差異；當(dāng)濃度達(dá)到50%以后，隨著乙醇濃度的不斷增加，葡萄皮多酚的提取率呈下降趨勢(shì)，選擇20%、30%、40%等3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

由圖1b可以看出，隨著料液比的不斷增大，在1/20～1/40之間，葡萄皮多酚的提取率不斷增加，當(dāng)達(dá)到1/40時(shí)，多酚含量基本達(dá)到峰值，再隨著料液比增大，提取率沒(méi)有顯著的升高?？赡苁怯捎谌軇w積的不斷增加，使固液兩項(xiàng)之間的接粗面積不斷增加，有利于多酚化合物的溶出[14]。不會(huì)對(duì)料液比作為響應(yīng)面分析因素，并將料液比固定為1/40。

圖1　葡萄皮多酚提取單因素試驗(yàn)

由圖1c可以看出，在超聲功率100～300W范圍內(nèi)，葡萄皮多酚的提取率并沒(méi)有顯著性差異，而后增加超聲功率，多酚含量開(kāi)始增加，當(dāng)超聲功率到達(dá)400W時(shí)提取率達(dá)到了峰值，為27.42±0.96mg/g，選擇300、400、500等3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

由圖1d可以看出，隨著提取時(shí)間的不段增加，葡萄皮多酚的提取含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為1.5h時(shí)到達(dá)峰值，為30.33±1.45mg/g；隨后隨著提取時(shí)間的再增加，多酚含量呈下降趨勢(shì)，選擇1、1.5、2等3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.2葡萄皮多酚響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1葡萄皮多酚響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)為分析試驗(yàn)、5個(gè)為中心試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)因素及水平安排見(jiàn)表1。根據(jù)Design8.0.5.0進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，回歸方程和方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1　響應(yīng)面分析因素和水平

表2　響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

表3　響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果

注：*P<0.05，影響顯著；**P<0.01，影響極顯著。

使用Design8.0.5.0進(jìn)行響應(yīng)面分析得出葡萄皮多酚提取率回歸方程為：

Y=29.36-0.93X1+0.54X2+1.59X3+0.47X1X2+

(1)

(1)式中，X1為超聲時(shí)間、X2為超聲功率、X3為乙醇濃度、Y為葡萄皮多酚提取含量。

由表3可以看出，除了超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用不顯著外，其他各項(xiàng)之間都具有顯著性?；貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型(P<0.0001)具有高度顯著性，該模型的失擬項(xiàng)(P=0.2985>0.05)并不顯著，這兩者表明該模型的擬合性較好。上述葡萄皮多酚提取率的回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9834，響應(yīng)值的變化有96.48%來(lái)源于所選因素，即來(lái)源于超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度，并且3個(gè)自變量與響應(yīng)值(葡萄皮多酚提取率)之間線性關(guān)系顯著，說(shuō)明說(shuō)明模型與實(shí)際擬合較好，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。變異系數(shù)C.V.(%)是衡量每個(gè)測(cè)量平均值偏離真實(shí)情況的參數(shù)，其值越小，表明重復(fù)性越好，該模型的變異系數(shù)=2.19，在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明該模型的重復(fù)性良好。通過(guò)F值的比較，得出該模型分析得各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性大小為：乙醇濃度>超聲時(shí)間>超聲功率。

2.2.2葡萄皮多酚響應(yīng)面結(jié)果分析

從圖2a中可以看到等高線圖呈圓形，圖2c、e等高線呈橢圓形，而且圖2e橢圓的效果較圖2c更為顯著，說(shuō)明超聲時(shí)間A與超聲功率B兩者之間的交互作用無(wú)顯著性，超聲時(shí)間(A)與乙醇濃度C、超聲功率B與C乙醇濃度這兩組之間的兩兩交互作用顯著，而且交互作用的顯著程度為BC>AC>AB，二次模型方差分析結(jié)果一致。并確定最佳的提取工藝為超聲時(shí)間1.63h、超聲功率431.25W、乙醇濃度32.82%、葡萄皮多酚的提取率為30.26mg/g。

圖2　三因素的交互作用

從圖2b中可以看出，超聲時(shí)間的曲面較超聲功率較陡，說(shuō)明超聲時(shí)間與超聲功率相比，超聲時(shí)間對(duì)多酚的提取率影響較大，即A>B，這與二次模型方差分析結(jié)果一致。從圖2d中可以看出，超聲時(shí)間軸向的等高線較稀疏，說(shuō)明乙醇濃度較超聲時(shí)間對(duì)多酚的提取率影響較大，即C>A，這與二次模型方差分析結(jié)果一致。從圖2f中可以看出乙醇濃度的曲面較超聲功率較陡，說(shuō)明乙醇濃度與超聲功率相比，乙醇濃度對(duì)多酚的提取率影響較大，即C>B；從等高線圖中也可以看出，超聲功率軸向的等高線較稀疏，說(shuō)明乙醇濃度較超聲功率對(duì)多酚的提取率影響較大，即C>B，這與二次模型方差分析結(jié)果一致。

2.2.3葡萄皮多酚最佳提取工藝參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面分析得，最佳的提取工藝為：料液比1∶40、超聲時(shí)間1.63h、超聲功率431.25W、乙醇濃度32.82%，葡萄皮多酚的提取率為30.26mg/g。在本試驗(yàn)中由于實(shí)際條件因素，最終選取超聲時(shí)間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得出葡萄皮多酚的提取率為29.16mg/g，與預(yù)測(cè)值很接近，所以最終確定以該條件進(jìn)行葡萄皮多酚的提取。

2.3葡萄多酚HPLC色譜定性及定量分析

葡萄皮多酚的HPLC色譜定性分析見(jiàn)圖3，定量分析結(jié)果見(jiàn)表4。葡萄皮中含有較多酚類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)和11種標(biāo)樣酚類(lèi)成分保留時(shí)間的對(duì)比，確定含有其中的10種，但含量都偏低，除兒茶素含量稍高外其他都在10μg/mg

圖3　葡萄皮多酚HPLC色譜分析

序號(hào)單體酚葡萄皮游離酚(μg/mg)序號(hào)單體酚葡萄皮游離酚(μg/mg)1沒(méi)食子酸3.39±0.057香豆酸1.34±0.022兒茶素15.74±0.218鞣花酸7.35±0.103原兒茶酸—9蘆丁9.49±0.224綠原酸7.21±0.1210鄰香草酸6.63±0.175咖啡酸1.98±0.0311槲皮素6.10±0.096表兒茶素6.99±0.19總酚66.19±0.82

以下。這與程宇峰[14]在對(duì)葡萄與葡萄酒中單體酚進(jìn)行測(cè)定時(shí)，表明葡萄中主要含有沒(méi)食子酸、兒茶素、咖啡酸、綠原酸、槲皮素、蘆丁等酚類(lèi)物質(zhì)相符。同樣HernánH和焦中高等[15，16]人在對(duì)葡萄皮和梨棗中游離酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，兒茶素和表兒茶素均是最主要的酚類(lèi)物質(zhì)。本文在對(duì)葡萄皮游離酚檢測(cè)中確定的10中單體酚類(lèi)物質(zhì)中含量最高的是兒茶素(15.74±0.21μg/mg)。

3　結(jié)論

本文主要利用有機(jī)溶劑萃取法對(duì)葡萄皮多酚進(jìn)行萃取，通過(guò)對(duì)乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、料液比等4個(gè)單因素對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化確定料液比為1：40、超聲時(shí)間1.6h、超聲功率430W、乙醇濃度33%，葡萄皮多酚的提取率為29.16mg/g。選取AB-8樹(shù)脂對(duì)提取的葡萄皮多酚進(jìn)行純化，并通過(guò)HPLC進(jìn)行了定性以及定量分析，確定了10種單體酚，其中主要酚酸物質(zhì)為兒茶素?！?/p>

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Study on Extraction，Purification and Contents of Phenolic in Grape Peel

QI Yan1，2,SUN Jin-yue2，3,CHENG An-wei2，3,TAN Xin1，2,XIE Chun-yang1(1College of Food Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Institute of Agro-food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China；3Key Laboratory of Agro-products Processing Technology of Shandong Province，Jinan 250100，China)

PolyphenolsinKyohograpepeelwereextractedwithultrasonicmethod，andtheextractionconditionswereoptimizedbyResponseSurfaceMethodology.ThecompositionsandcontentsofphenolicsingrapepeelweredeterminedbyHPLC.Theoptimizedextractionconditionsweresolid/liquid1：30，ultrasonictime1.6h，ultrasonicpower430W，ethanolconcentration33%，andyieldofpolyphenolswas29.16mg/g.AB-8resinhadbetteradsorptionanddesorptionpropertiestopurifythegrapepolyphenols.ByHPLCanalysis, 10kindsofphenoliccompoundsingrapepeelwereidentified，andcatechin(15.74 ± 0.21μg/mg)wasthemainlycompound.

grape；polyphenol；ResponseSurfaceMethodology；HPLC

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題“葡萄全果資源化利用與綠色防腐保鮮關(guān)鍵技術(shù)研究”；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(項(xiàng)目編號(hào)：201303076-06)。

齊巖(1991—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：長(zhǎng)白山野生植物資源開(kāi)發(fā)利用。

謝春陽(yáng)(1965—)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向：長(zhǎng)白山野生植物資源開(kāi)發(fā)利用。

FoodandNutritioninChina