老黑谷米中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

陸　洋，楊士花，黃佳琦，陶　亮，初雅潔，黃勇樺，李華君，李永強(qiáng)

(1 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明　650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院，昆明　650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明　650201；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明　650201)

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老黑谷米中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

陸洋1，楊士花2，黃佳琦3，陶亮4，初雅潔3，黃勇樺3，李華君3，李永強(qiáng)3

(1云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院，昆明650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201)

以老黑谷米面粉為原料，提取分離其中的可溶性多酚、游離多酚、酯化多酚、醚化多酚、鍵合多酚，利用比色法進(jìn)行多酚和類(lèi)黃酮含量測(cè)定，并采用DPPH自由基清除能力、鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定(FRAP)、總抗氧化能力測(cè)定(TEAC)、還原能力測(cè)定(RP)和H2O2清除活性等5種不同的體外抗氧化測(cè)定體系進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。結(jié)果表明：5種多酚中，可溶性多酚含量最高，酯化多酚含量次之，顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚。多酚中類(lèi)黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，顯著高于其他3種多酚。5種多酚均有較高的體外抗氧化能力，鍵合多酚的DPPH自由基清除能力最高，可溶性多酚的H2O2清除能力、FRAP還原能力、RP還原能力和TEAC總抗氧化能力最高。本研究為老黑谷米的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

老黑谷米；多酚；提??；抗氧化活性

自由基在生命系統(tǒng)中天然存在，以活性氧的形式產(chǎn)生，大量的自由基能夠氧化生物大分子，導(dǎo)致組織損傷，細(xì)胞死亡或退化，引發(fā)各種疾病[1]。多酚化合物作為膳食中最豐富的一類(lèi)抗氧化物質(zhì)，能夠清除體內(nèi)自由基[1，2]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，流行病學(xué)研究表明，食物中攝入的多酚化合物能夠促進(jìn)人體健康，預(yù)防各種高發(fā)的慢性疾病[3]。酚類(lèi)物質(zhì)在高等植物組織中廣泛存在，水果、蔬菜和谷物中均含有豐富的多酚化合物[4-8]。谷物中95%的多酚和細(xì)胞壁多糖緊密結(jié)合，研究者提出了“膳食纖維抗氧化劑”和“膳食纖維-多酚復(fù)合物”的概念，認(rèn)為谷物膳食纖維是體內(nèi)傳送多酚化合物的天然功能成分[9-11]。

老黑谷米是云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣攀天閣特有的水稻品種，有近750多年的種植歷史，是高原地區(qū)唯一能完全成熟的谷類(lèi)物種。老黑谷米米殼呈黑，米粒潤(rùn)紅飽滿，煮熟后飯粒為紅色，當(dāng)?shù)厝苏J(rèn)為吃了老黑谷米能夠補(bǔ)足精氣、強(qiáng)健體魄，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前，關(guān)于老黑谷米中多酚化合物的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次采用老黑谷米為原料，提取分離老黑谷米面粉中的可溶性多酚、游離多酚、酯化多酚、醚化多酚、鍵合多酚，對(duì)多酚含量、類(lèi)黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并采用5種不同的體外抗氧化測(cè)定體系進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，為開(kāi)發(fā)利用老黑谷米中多酚化合物提供科學(xué)依據(jù)，也為老黑谷米的深加工提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

老黑谷米：云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、過(guò)氧化氫(H2O2)、2，2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、抗壞血酸：上海晶純生化科技股份有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、Trolox：sigam公司；阿魏酸、兒茶素：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；無(wú)水氯化鋁：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1800CP紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JFS-13A旋風(fēng)式粉碎磨：杭州錢(qián)江儀器設(shè)備有限公司；ZWF-334多功能脫色搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1老黑谷米中多酚化合物的提取[5，10]

(1)可溶性多酚的提取老黑谷米磨粉后過(guò)50目篩，脫脂后，準(zhǔn)確稱取1.5g，用70%丙酮避光振搖提取，料液比為1∶20，提取2h后，4 000g離心10min，提取3次，合并上清，30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到可溶性多酚，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(2)游離多酚的提取可溶性多酚調(diào)節(jié)pH為2后，用乙醚萃取3次，合并有機(jī)相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到游離多酚，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(3)酯化多酚的提取游離多酚水相用2mol/L NaOH室溫下水解4h，調(diào)節(jié)pH為2后，4 000g離心10min，上清用乙醚與乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶劑萃取3次，合并有機(jī)相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25 mL，得到酯化多酚，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(4)醚化多酚的提取酯化多酚水相加入1mol/L HCl 20mL，90℃水浴45min，用乙醚萃取3次，合并有機(jī)相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到醚化多酚，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(5)鍵合多酚的提取提取可溶性多酚后得到的殘?jiān)尤?mol/L NaOH 40mL，室溫下水解4h后，調(diào)節(jié)pH為2，4 000g離心10min，上清用乙醚與乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶劑萃取3次，合并有機(jī)相，于30℃真空濃縮蒸干，用甲醇定容至25mL，得到鍵合多酚，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2多酚化合物含量測(cè)定多酚含量采用Folin-Ciocalteau法進(jìn)行測(cè)定[12]，具體步驟如下：吸取多酚粗提液0.5mL，加入0.5mL Folin-Ciocalteau試劑，充分振搖，加入1mL飽和碳酸鈉溶液，加蒸餾水使總體積至10mL，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)35min，4 000g離心10min，在725nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用甲醇代替多酚粗提液作為空白。以阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品，建立回歸方程為：

y=0.006 6x-0.003 0(7.92-55.44μg /mL，R2=0.998 8)

(1)

(1)式中，y為吸光度、x為阿魏酸濃度(μg/mL)，多酚含量以每g干燥面粉樣品中阿魏酸當(dāng)量(μg)表示。1.3.3類(lèi)黃酮含量測(cè)定[2，5]采用AlCl3比色法進(jìn)行測(cè)定，具體步驟為：吸取2mL多酚粗體液，依次加入4mL蒸餾水、0.3mL 5%亞硝酸鈉溶液，室溫下反應(yīng)5min后；加入0.3mL 10%氯化鋁溶液充分混合，室溫下反應(yīng)1min；再加入2mL 1mol/L NaOH溶液，并加蒸餾水至反應(yīng)體系總體積為10mL，室溫下反應(yīng)15min；4 000g離心10min，上清于510nm處測(cè)定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用兒茶素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：

y=0.0027x-0.0114(7.92-55.44μg/mL，R2=0.999 8)

(2)

(2)式中，y為吸光度、x為兒茶素濃度(μg/mL)，類(lèi)黃酮含量以每g干燥樣品中兒茶素當(dāng)量(μg)表示。

1.3.4抗氧化能力測(cè)定

(1)DPPH自由基清除能力測(cè)定[13，14，17]：分別吸取0.5mL多酚粗提液，添加2mL 0.19mmol/L DPPH溶液，充分振搖后，室溫下暗處放置10min，然后在517nm比色測(cè)定，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：

y=0.940 6x+28.698(23.2-139.2μg/mL，R2=0.969)

(3)

DPPH自由基清除能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(4)

(4)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

(2)鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定(FRAP)[14，18，19]FRAP溶液的配制：乙酸溶液(300mmol/L，pH為3.6)、六水三氯化鐵(20mmol/L)和三吡啶基三嗪(10mmol/L)以10∶1∶1(V∶V∶V)充分混勻。

吸取100μL多酚粗提液加入3mLFRAP溶液充分混合，于37℃反應(yīng)4min，在593nm測(cè)定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用硫酸亞鐵繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：

y=6.24x+0.000 5(0.2-1.2mmol/L，R2=0.998 4)

(5)

(5)式中，y為吸光度、x為硫酸亞鐵濃度(mmol/L)，還原能力表示為每mL多酚粗提液中Fe2+當(dāng)量(mmol)。

(3)總抗氧化能力測(cè)定(TEAC)[13-16]：ABTS·+工作液的配制：將ABTS(7mmol/L)和過(guò)硫酸鉀(2.45mmol/L)兩種溶液等體積混合，于4℃下反應(yīng)16h，得到ABTS·+工作液。

吸取100μL多酚粗提液，加入3.8mLABTS·+工作液，室溫下反應(yīng)6min，于734nm測(cè)定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：

2.在浦東開(kāi)發(fā)區(qū)內(nèi)，進(jìn)口必要的建設(shè)用機(jī)器設(shè)備、車(chē)輛、建材，免征關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅。區(qū)內(nèi)的“三資”企業(yè)進(jìn)口生產(chǎn)用的設(shè)備、原輔材料、運(yùn)輸車(chē)輛、自用辦公用品及外商安家用品、交通工具，免征關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅；凡符合國(guó)家規(guī)定的產(chǎn)品出口，免征出口關(guān)稅和工商統(tǒng)一稅。

y=5.382 7x+3.3472(7.488-37.44μg/mL，R2=0.999 7)

(6)

(6)式中，y為ABTS·+自由基清除能力、x為T(mén)rolox濃度(μg/mL)，自由基清除能力表示為每g干燥樣品中Trolox當(dāng)量(μg)。

ABTS·+自由基清除能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(7)

(7)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

(4)還原能力測(cè)定(RP)[5]：吸取1mL多酚粗提液，加入2.5mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L，pH6.6)，加入2.5mL1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻后于50℃水浴反應(yīng)20min；再加入2.5mL10%TCA溶液，4 000g離心10min；吸取上清1mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1%FeCl3溶液，于700nm測(cè)定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用抗壞血酸(維生素C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：

y=0.045 5x-0.115(80-180μg/mL，R2=0.9916)(8)

(8)式中，y為吸光度、x為維生素C濃度(μg/mL)。還原能力表示為每g干燥樣品中維生素C當(dāng)量(μg)。

(5)H2O2清除活性測(cè)定[1，17]吸取0.6mL多酚粗提液，加入0.9mLH2O2(40mmol/L)，加入磷酸鈉緩沖溶液(45mmol/L，pH7.4)，30℃反應(yīng)40min，于230nm測(cè)定吸光度，用甲醇替代多酚溶液作為空白。用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：y=0.657 1x-11.119(55-275μg/mL，R2=0.994 3)(9)

(9)式中，y為H2O2清除能力、x為阿魏酸濃度(μg/mL)，自由基清除能力表示為每g干燥樣品中阿魏酸當(dāng)量(μg)。

H2O2清除活性(%)=[(A0-A1)/A0]×100(10)

(10)式中，A0為空白吸光度、A1為樣品吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1多酚化合物與類(lèi)黃酮含量測(cè)定

由老黑谷米面粉中各類(lèi)多酚和類(lèi)黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)可知，老黑谷米面粉中可溶性多酚含量最高，為7 876.72±195.82μg/g，顯著高于其他各類(lèi)多酚；酯化多酚含量為1 278.32±349.17μg/g；可溶性多酚和酯化多酚含量顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚；游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚含量差異不顯著。5種多酚的類(lèi)黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，分別為829.99±42.16、800.13±110.18μg/g，顯著高于其他3種多酚；醚化多酚類(lèi)黃酮含量最低，為62.82±14.77μg/g，顯著低于其他4種多酚(表1)。

表1　老黑谷米面粉中各類(lèi)多酚和類(lèi)黃酮含量(μg/g面粉)

2.2多酚抗氧化能力測(cè)定

各類(lèi)多酚5種體外抗氧化能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1DPPH清除能力測(cè)定DPPH·是人工合成的能穩(wěn)定存在的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見(jiàn)光區(qū)517nm處被吸收。當(dāng)多酚加入DPPH溶液中時(shí)，溶液褪色，多酚含量與褪色程度呈正相關(guān)。由表2可知，鍵合多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，顯著高于其他多酚，游離多酚和酯化多酚清除能力次之，醚化多酚和可溶性多酚的清除能力顯著低于其他多酚。

表2　不同多酚的抗氧化能力測(cè)定(以每g面粉計(jì))

2.2.2鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定(FRAP)多酚將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與TPTZ結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)593nm處有最大吸收。吸光度越大，表明還原/抗氧化能力越強(qiáng)。由表2可知，可溶性多酚的還原/抗氧化能力顯著高于其他多酚，F(xiàn)e2+濃度當(dāng)量為54.70±1.17mmol/L；醚化多酚還原/抗氧化能力次之，F(xiàn)e2+濃度當(dāng)量為11.35±0.59mmol/L；游離酚酸、醚化多酚、鍵合多酚還原/抗氧化能力最弱，F(xiàn)e2+濃度當(dāng)量分別為5.25±0.08、4.05±0.10、3.97±0.12mmol/L。

2.2.3還原能力測(cè)定(RP)由表2可知，5種多酚多酚還原能力為可溶性多酚>醚化多酚>游離多酚>酯化多酚>鍵合多酚，其中各種多酚維生素C當(dāng)量分別為453.77±10.27、178.00±11.92、75.02±1.68、72.63±4.05、54.14±0.25μg/g，可溶性多酚和醚化多酚的還原能力顯著高于其他3種多酚。

2.2.4H2O2清除能力測(cè)定由表2可知，可溶性多酚對(duì)H2O2清除能力顯著高于其他多酚，阿魏酸當(dāng)量為389 196.83±8 430.32μg；酯化多酚清除能力次之，阿魏酸當(dāng)量為196 840.57±98 354.23μg；鍵合多酚和醚化多酚的清除能力最低，阿魏酸當(dāng)量分別為55 617.11±6 344.29、51 045.31±8 979.84μg。

2.2.5總抗氧化能力測(cè)定(TEAC)ABTS·+為穩(wěn)定的有機(jī)自由基，多酚抗氧化能力越強(qiáng)，其提供電子的能力也就越強(qiáng)，與該有機(jī)自由基反應(yīng)量越大，反應(yīng)速率也越快，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，直接反應(yīng)出樣品抗氧化能力的大小。由表2可知，可溶性多酚總抗氧化能力最高，相當(dāng)于505 287.97±80 123.49μgTrolox，顯著高于其他4種多酚；其他4種多酚之間總抗氧化能力差異不顯著。

3　結(jié)論

5種多酚中，可溶性多酚含量最高，酯化多酚含量次之，兩者含量顯著高于游離多酚、醚化多酚、鍵合多酚；多酚中類(lèi)黃酮含量最高為鍵和多酚和可溶性多酚，顯著高于其他3種多酚。5種多酚均有較高的體外抗氧化能力，鍵和多酚的DPPH自由基清除能力最高，可溶性多酚的H2O2清除能力、FRAP還原能力、RP還原能力和TEAC總抗氧化能力最高。◇

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Extraction of Polyphenols from Old Black Rice and Its Antioxidant Activity in Vitro

LU Yang1，YANG Shi-hua2，HUANG Jia-qi3，TAO Liang4，CHU Ya-jie3，HUANG Yong-hua3，LI Hua-jun3，LI Yong-qiang3(1Yunnan Plateau Characteristic Agricultural Industry Research Institute，Kunming 650201, China；2College of Foreign Languages，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China；3College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China；4College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201, China)

Soluble，free，esterified，etherified，insolubleboundpolyphenolswereextractedfromoldblackriceandthecontentofphenoliccompoundsandflavonoidsweredeterminedusingcolorimetry.Antioxidantactivitiesofphenolicfractionswereestimatedusing2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)radicalscavengingactivity，ferricreducingantioxidantpower(FRAP)，troloxequivalentantioxidantcapacity(TEAC)，reducingpower(RP)andhydrogenperoxide(H2O2)scavengingactivityin vitro.Resultsshowedthatsolublepolyphenolhadthehighestcontent，esterifiedpolyphenolhadthesecondcontent，thetwofractionsweresignificantlyhigherthanothers.Boundpolyphenolandsolublepolyphenolhadthehighestflavonoidcontent，whereastheotherthreefractionspossessedthelower.Allpolyphenolsshowedhighantioxidantactivities.BoundpolyphenolhadhighestDPPHradicalscavengingactivity，solublepolyphenolhadthehighestferricreducingantioxidantpower(FRAP)，troloxequivalentantioxidantcapacity(TEAC)，reducingpower(RP)andhydrogenperoxide(H2O2)scavengingactivity.Theseresearchresultscouldbeusedasthebaseforfurtherresearchanddevelopmentofoldblackrice.

oldblackrice；polyphenols；extraction；antioxidantactivity

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：31360378)；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013FB042)；云南省教育廳項(xiàng)目(云南省高校食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201510676001)。

陸洋(1984—)，女，碩士，研究方向：功能食品。

李永強(qiáng)(1975—)，男，博士，副教授，研究方向：功能食品與天然產(chǎn)物化學(xué)。