缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注后心房肌Cx43和Cx40的影響

韓勁松 歷志 王輝山 尹宗濤 薛曉東

基礎(chǔ)研究

缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注后心房肌Cx43和Cx40的影響

韓勁松 歷志 王輝山 尹宗濤 薛曉東

目的 探討缺血預(yù)處理（IPC）對大鼠缺血再灌注（I/R）后心房肌縫隙連接蛋白43（Cx43）和縫隙連接蛋白40（Cx40）表達和分布的影響。方法 30只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組（或?qū)φ战M，n=5）：只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支；缺血再灌注組（I/R組，n=5）：給予前降支結(jié)扎30 min，再灌注120 min；早期缺血預(yù)處理組（IPC組，n=5）：行IPC處理后，余處理同I/R組；延遲IPC組（L-IPC組，n=5）：在IPC處理24 h后，余處理同I/R組；早期遠程缺血預(yù)處理組（RIPC組，n=5）：給予RIPC后，余處理同I/R組；延遲RIPC組（L-RIPC組，n=5）：RIPC處理24 h后，余處理同I/R組。測量心房組織Cx40、Cx43的mRNA表達，Cx40、Cx43蛋白表達，以及用免疫組化法測定Cx40、Cx43的分布。結(jié)果 I/R組Cx43和Cx40在mRNA水平和蛋白水平均明顯降低，分布無規(guī)律且側(cè)面分布相對增加。而各種IPC方式（IPC、L-IPC、RIPC、L-RIPC）在I/R后，心房Cx43和Cx40 mRNA水平和蛋白水平下降不明顯，其分布多于心肌細胞閏盤處，僅少量分布于心肌細胞側(cè)面。結(jié)論 IPC能維持I/R后心房肌Cx43和Cx40的較高表達，并維持其空間分布相對穩(wěn)定。

缺血預(yù)處理； 縫隙連接蛋白； 心房； 心律失常

缺血預(yù)處理（IPC）是目前所知的最強大的內(nèi)源性心肌保護機制。遠程預(yù)處理（RIPC）是另一種形式的IPC。最近研究表明，IPC和RIPC可能降低心房顫動的發(fā)生率[1-3]。心房顫動是臨床上常見的心律失常，目前正呈現(xiàn)全球性爆發(fā)的趨勢[4]?？p隙連接蛋白 43（Cx43）和縫隙連接蛋白 40（Cx40）與心房顫動的發(fā)生關(guān)系密切[5,6]。本研究擬通過研究系列IPC和RIPC方法對大鼠心房肌Cx43和Cx40表達和分布的影響，探尋一種非藥物干預(yù)心房肌的方法，為進一步干預(yù)心房顫動提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 體重200 g的Wistar大鼠，麻醉后接呼吸機，接心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)。逐層鈍性分離肌肉，沿胸骨左緣0.5 cm剪斷2～4肋骨，用線牽拉兩側(cè)肋骨暴露胸腔。剪破心包，暴露肺動脈圓錐與左心耳之間的左冠狀靜脈。以其為標(biāo)志,在左冠狀靜脈下縫線，線兩端共穿一根聚乙烯小管以形成閉環(huán)。拉緊閉環(huán)并用止血鉗固定造成心肌缺血，放松閉環(huán)使線放松后即行再灌注。以左室前壁發(fā)紺或呈藍紫色及同步心電圖ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志。IPC方法：手術(shù)穿線平衡10 min后，缺血5 min，再灌注5 min，反復(fù)4次。RIPC方法：以止血帶捆綁雙下肢阻斷血流5 min，放松5 min，反復(fù)4次。每次捆綁以觀察到雙下肢皮色變紫及超聲多普勒在捆綁下方聽不到動脈波動為準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器 動物組織總RNA提取試劑盒（DP431），天根生化科技（北京）有限公司；One Step SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ（Perfect Real Time）為Takara公司產(chǎn)品；引物序列由沈陽博洋生物技術(shù)有限公司合成?？偟鞍滋崛≡噭┖校╒azyme）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4XSDS-PAGE分離膠緩沖液、10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、6×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）、預(yù)染次高分子量蛋白 Marker為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，貨號32109，Invitrogen公司產(chǎn)品。Thermal Cycler Dice Real Time System Single（熒光定量 PCR 儀），TP850，Takara；Allegra 25R 臺式高速冷凍離心機，美國Beckman（貝克曼）公司；Micro 17R微量臺式離心機，美國Thermo（賽默）公司；微量可調(diào)移液器，德國Eppendorf公司；低溫高速離心機，型號3-18K，德國SIGMA公司產(chǎn)品；電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra MP4電泳槽、785型真空轉(zhuǎn)印儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；IKA T10高速組織勻漿機為德國IKA/艾卡公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀ECL800為美國寶特公司產(chǎn)品；水平搖床IS系列美國精騏產(chǎn)品；切片機（LEICA RM 2145）/冷臺（LEICA EG 1150C）/攤片機（LEICA HI 1220）/烤片機（LEICA HI 1210）。

1.3 實驗動物分組 30只大鼠分為6組，每組5只。假手術(shù)組（或?qū)φ战M）只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支；缺血再灌注組（I/R組）前降支結(jié)扎30 min，再灌注120 min；早期缺血預(yù)處理組（IPC組）行IPC處理后，余處理同I/R組；延遲IPC組（L-IPC組）在IPC處理24 h后，余處理同I/R組；早期遠程缺血預(yù)處理組（RIPC組）給予RIPC后，余處理同I/R組；延遲RIPC組（L-RIPC組）RIPC處理24 h后，余處理同I/R組。實驗結(jié)點完畢，取左、右心房肌組織保存待查。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 Real-time PCR方法檢測心房組織Cx40、Cx43的mRNA表達 根據(jù)Gen Bank中報道的基因序列，應(yīng)用DNASTAR軟件設(shè)計引物，采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA，用Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒配伍反應(yīng)體系，放置熒光定量PCR儀中，設(shè)置PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s收集熒光信號，40個循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。

1.4.2 Western-blot方法檢測心房組織Cx40、Cx43蛋白表達 分離缺血的心房肌組織，用PBS液（預(yù)冷）進行洗滌，稱取100 mg放在液氮中研磨為粉末，4℃裂解，12 000 rpm 4℃ 離心30 min，取上清，-20℃凍存?zhèn)溆?。采用BCA蛋白定量試劑盒完成心肌組織蛋白定量。分別取待測蛋白樣品50 μg完成SDS-PAGE，轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)稀釋的Cx40、Cx43抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌后加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，洗滌瀝干后加入ECL Plus試劑進行ECL顯影。最后用圖像分析軟件測定圖片上每個特異性條帶灰度值。

1.4.3 免疫組化法（SP法）測定Cx40、Cx43分布將石蠟切片脫蠟水化，組織抗原微波修復(fù)（置0.01 M枸櫞酸緩沖液，pH=6.0，煮沸 95 ℃，15～20 min）；滴加一抗，置濕盒中37℃溫箱孵育20 min；上述步驟之間均以磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗片3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；脫水，中性樹脂封片。取已知含有待檢抗原的切片經(jīng)上述步驟染色，作為陽性對照。用磷酸鹽緩沖液代替第一抗體經(jīng)上述步驟染色，作為陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析。計量資料以±s表示，使用方差結(jié)合post-Hoc檢驗，不同時間點應(yīng)用重復(fù)方差檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心房組織Cx43、Cx40的mRNA表達 與其他組比較，I/R組在左心房和右心房中mRNA表達最低（P＜0.05），IPC 組、L-IPC 組、RIPC 組和 L-RIPC組與對照組比較，未見明顯降低（P＞0.05）。見圖1。

2.2 心房組織Cx43、Cx40蛋白表達 與其他組比較，I/R組在左心房和右心房中mRNA表達最低（P＜0.05），IPC 組、L-IPC 組、RIPC 組和 L-RIPC 組與對照組比較，未見明顯降低（P＞0.05）。見圖2。

2.3 Cx43、Cx40的分布 對照組：線性規(guī)律分布于心肌細胞閏盤處，僅少量分布于心肌細胞側(cè)面。I/R組：分布無規(guī)律且側(cè)面分布相對增加。IPC組、LIPC組、RIPC組和L-RIPC組與對照組類似，僅少量分布于心肌細胞側(cè)面。

圖1 心房組織Cx43、Cx40的mRNA表達

圖2 心房組織Cx43、Cx40蛋白表達

3 討論

IPC對心肌保護作用呈雙相過程，包括即刻出現(xiàn)的早期保護（早期預(yù)處理或經(jīng)典預(yù)處理）和IPC后24 h出現(xiàn)的延遲保護（又稱第二保護窗口或延遲預(yù)處理，即L-IPC），前者一般持續(xù)1～3 h，后者可持續(xù)數(shù)天。心外組織如腎臟、小腸及骨骼肌短暫缺血不僅能減輕局部組織的再灌注損傷，對心臟也有保護作用，并將這種現(xiàn)象稱為RIPC。IPC和RIPC對心肌的保護作用已被廣泛接受，但均是針對心室肌的研究，對心房肌的影響尚不清楚。本研究結(jié)果初步提示，各種IPC方式包括經(jīng)典IPC、L-IPC、RIPC和L-RIPC均對缺血再灌注后心房肌的Cx43和Cx40的表達及分布產(chǎn)生了影響，即維持Cx43和Cx40相對高表達，并維持其空間分布相對穩(wěn)定。

縫隙連接結(jié)構(gòu)是介導(dǎo)相鄰細胞間電耦連的一種通訊連接方式，是實現(xiàn)心肌細胞之間電和化學(xué)信息交換的重要結(jié)構(gòu)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，縫隙連接組成了心肌細胞之間的低電阻通路，成為心臟電傳導(dǎo)的主要決定因素。連接蛋白表達水平的改變、更新、重新分布及結(jié)構(gòu)異常是引起心律失常的重要解剖學(xué)基礎(chǔ)?？p隙連接通道的重新分布和密度改變會導(dǎo)致相應(yīng)傳導(dǎo)速度和各向異性傳導(dǎo)發(fā)生改變，產(chǎn)生傳導(dǎo)減慢和單向阻滯，從而形成引起心律失常的環(huán)路。

心肌細胞縫隙連接通道的特異性蛋白包括Cx40和Cx43[7,8]，其正常表達和分布是縫隙連接通道電耦聯(lián)和正常電活動以及協(xié)調(diào)心臟心肌舒縮的重要保證[9]。Cx43大部分在閏盤內(nèi)。閏盤是由非特化肌膜、黏著膜、橋粒和間隙連接共同組成的，它是特化的心肌組織的傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)?？p隙連接結(jié)構(gòu)同時也是相鄰細胞間傳遞化學(xué)信息、調(diào)節(jié)細胞分化和增殖的一種通訊連接方式，在心肌細胞中更具有傳遞電沖動的作用。而電信號在相鄰心肌細胞間迅速傳播是心室傳導(dǎo)的重要決定因素，它使整個心臟肌肉細胞成為一個合胞體形式的完整的功能單位。Cx43表達量的減少及非均勻化可改變電傳導(dǎo)的同向性，使電傳導(dǎo)速率降低，且易形成折返，造成心律失常。而縫隙連接蛋白的側(cè)面化，可使Cx43形成的半通道增多，可導(dǎo)致Na+內(nèi)流和ATP外流，引起延遲后去極化。病理條件下，心肌Cx43的這些重構(gòu)是構(gòu)成心律失常的基礎(chǔ)之一。

心房Cx40端-端分布減少，縱向的傳導(dǎo)速度降低，也使心肌傳導(dǎo)減慢，導(dǎo)致總的心房除極時間延長。同時，Cx40的異質(zhì)性分布也使相鄰細胞具有明顯不同的阻抗和傳導(dǎo)速度，因而產(chǎn)生許多微小的傳導(dǎo)阻滯區(qū)，促使形成微小折返環(huán)路，導(dǎo)致房顫的發(fā)生和持續(xù)。Cx40表達量減少時，細胞間電耦聯(lián)發(fā)生障礙，使心房的縱向傳導(dǎo)速度減慢，而橫向傳導(dǎo)速度相對增加，復(fù)極離散度增加，多個子波沿異常的傳導(dǎo)徑路擴布，有利于微折返的形成，導(dǎo)致房顫的發(fā)生和持續(xù)[10]。Cx40量的改變、分布的變化、磷酸化狀態(tài)的變化可引起縫隙連接重構(gòu)，影響心房肌傳導(dǎo)速度，并可能與心肌細胞炎性反應(yīng)、纖維化等病理改變有關(guān)，在房顫等心律失常的發(fā)生中具有一定作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，IPC和RIPC方式可能影響到Cx43和Cx40的表達和分布，即減少量的減少，以及減少其側(cè)向分布，以消除或降低心房肌細胞間電信號的傳導(dǎo)方向及速度，因此，對房性心律失常尤其是心房顫動的干預(yù)可能具有重要的意義。

本研究僅屬于初步的探索研究，尚有很多的局限性。第一，以鼠為研究對象，與人差距甚大，不能證明IPC或RIPC對人類心房肌有同樣的作用。第二，實驗方法簡單，僅提示存在這種可能的現(xiàn)象，尚需要結(jié)合多種實驗方法或多種模型進一步證實。第三，選用的大鼠為健康大鼠，與病理狀態(tài)下的情況完全不同，尚不能表明IPC系列方法對病理狀態(tài)下如心房顫動心房肌Cx43和Cx40的影響，下一步應(yīng)在心房顫動動物模型的基礎(chǔ)上進行研究。

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Effect of ischemic preconditioning on atrial Cx43 and Cx40 after ischemia-reperfusion

HAN Jin-song，LI Zhi，WANG Hui-shan，et al.Department of Cardiac Surgery，General Hospital of Shenyang Command，Shenyang 110016，China

Objective To study the impact of ischemic preconditioning（IPC）on atrial gap junction protein connexin 43（Cx43） and 40（Cx40）and their distribution after ischemia-reperfusion.Methods 30 Wistar rats were randomly divided into sham group （or a control group，n=5）：only thread but not ligated left anterior descending coronary artery.Ischemia-reperfusion group（I/R group，n=5）：ligated anterior descending artery 30 min，and then reperfusion 120 min.Early ischemic preconditioning group （IPC group，n=5）：Line IPC after treatment，other deal with the same I/R group.Delayed IPC group（L-IPC group，n=5）：In the IPC after treatment 24 h，other deal with the same I/R group.Early remote ischemic preconditioning group（RIPC group，n=5）：After giving RIPC，other deal with the same I/R group.Delay RIPC Group（L-RIPC group，n=5）：RIPC treatment after 24 h，deal with the same I/R group.MRNA expression measurements Cx40，Cx43 of atrial tissue，protein expression and assay Cx40，Cx43 by immunohistochemical staining distribution.Results I/R group Cx43 and Cx40 mRNA levels and protein levels were significantly reduced，irregular distribution and the relative increase in side profile.The variety of ways IPC（IPC，L-IPC，RIPC，L-RIPC）after I/R，atrial Cx43 and Cx40mRNA no significant decline in levels and protein levels，and its distribution more than intercalated disk myocardial cells，only a small amount distributed in cardiomyocytes side.Conclusion IPC can maintain atrial Cx43 I/R after Cx40 expression and higher，and to maintain their spatial distribution is relatively stable.

Ischemic preconditioning； Connexin； Atrium； Arrhythmia

HAN Jin-song，E-mail：hanjs0216@sina.com

2014年遼寧省自然科學(xué)基金項目（項目編號：2014020065）；

2015年遼寧省自然科學(xué)基金項目（項目編號：2015020407）；

110016 遼寧省沈陽市，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科

韓勁松，E-mail：hanjs0216@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．022

Q95-33；R541.7

A

1672-5301（2016）10-0948-04

2016-04-18）

2014年中華醫(yī)學(xué)會胸心血管外科分會厄爾巴肯獎學(xué)金科研項目