PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生中的作用

張韞佼 姜兆磊 司逸 馬南 梅舉

基礎(chǔ)研究

PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生中的作用

張韞佼 姜兆磊 司逸 馬南 梅舉

目的 探討PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中的作用。方法 選取8～10周齡的雄性C57BL/6小鼠20只，體重23～28 g，隨機(jī)分為2組，每組各10只，分別施以主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC組）和假手術(shù)（Sham組）。術(shù)后4周應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)小鼠的心臟功能，應(yīng)用心臟重量與體重之比（HW/BW）定量評(píng)價(jià)心肌肥厚程度。Real-time PCR檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志物Nppa、β-MHC（Myh7）的mRNA水平，同時(shí)檢測(cè)PCBP2 mRNA水平。Western blot方法檢測(cè)Nppa、β-MHC及PCBP2的蛋白水平。比較分析兩組之間的差異。結(jié)果 與Sham組相比，TAC組小鼠的心肌肥厚程度明顯增加［TAC組（8.23±1.88）mg/g比Sham組（4.89±0.68）mg/g］，左心室射血分?jǐn)?shù)［TAC 組（41.38±2.22）%比 Sham 組（59.15±3.58）%］及短軸收縮率［TAC 組（33.61±0.92）%比 Sham 組（43.87±1.37）%］明顯降低（P＜0.05）。TAC 組的心肌肥厚標(biāo)志物 Nppa、β-MHC 的mRNA水平及蛋白水平均明顯高于Sham組（P＜0.05）。然而，TAC組PCBP2 mRNA水平及蛋白水平卻明顯低于Sham組（P＜0.05），與心肌標(biāo)志物Nppa、β-MHC的變化趨勢(shì)相反。結(jié)論 PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用，上調(diào)PCBP2表達(dá)可能會(huì)抑制心肌肥厚的發(fā)展。

PCBP2； 心肌肥厚； Nppa； β-MHC

肥厚型心肌病被認(rèn)為是一種心血管遺傳疾病，跟基因突變密切相關(guān)[1-3]。在一般人群中，肥厚型心肌病的發(fā)病約1/500。研究已證實(shí)，在胎兒心臟發(fā)育過(guò)程中，一組主要以編碼心肌肌節(jié)蛋白基因發(fā)生突變是導(dǎo)致心肌肥厚的重要遺傳基礎(chǔ)。PCBP2是多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白家族成員之一，能特異性結(jié)合富含胞嘧啶RNA片段，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在心肌組織中有表達(dá)，表明PCBP2可能在心臟發(fā)育過(guò)程中也起著一定的調(diào)控作用[6]。那么，PCBP2在心肌肥厚過(guò)程中起著怎樣的作用，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)應(yīng)用主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型，觀察PCBP2與心肌肥厚標(biāo)志物心房鈉尿肽前體A（natriuretic peptide precursor-A，Nppa）及 β 肌球蛋白重鏈（β-Mysion Heavy Chain，β-MHC，由基因 Myh7編碼）的表達(dá)情況，探討PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6小鼠20只，體重23～28 g，8～10周齡，隨機(jī)分為2組，每組各10只。主要儀器與試劑：小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海軟龍科技發(fā)展有限公司BW-BM1103），顯微外科手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠），手術(shù)顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠），超凈工作臺(tái)（蘇州 SW-CJ.IFD），Real-time PCR儀（美國(guó)Bio-Rad），蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad），Western blot成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），戊巴比妥鈉，異氟烷，蛋白定量試劑盒，定量PCR試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建小鼠心肌肥厚模型 TAC組：將小鼠麻醉，氣管插管后，平臥，固定在手術(shù)操作板上，消毒、鋪巾。經(jīng)左胸第2肋間進(jìn)胸，用濕棉簽撥開(kāi)左肺組織，用鑷子分離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過(guò)分離出的間隙。在主動(dòng)脈弓降支上方，平行插入一段26G的注射器針頭，用穿過(guò)的7-0手術(shù)縫線將主動(dòng)脈血管及針頭一并結(jié)扎。最后拔出針頭，關(guān)胸，即得到小鼠主動(dòng)脈縮窄模型，用于構(gòu)建壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型。Sham組：分離主動(dòng)脈弓降支后，穿線但不結(jié)扎；最后抽出縫線，關(guān)胸。

1.2.2 測(cè)定小鼠的心臟功能及心肌肥厚情況 用異氟烷將小鼠麻醉后，取仰臥位，剃去左前胸部的毛，涂抹耦合劑。應(yīng)用超聲心動(dòng)圖準(zhǔn)確測(cè)量小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左室短軸收縮率（fractional shortening，F(xiàn)S）。心肌肥厚定量：處死小鼠，測(cè)量小鼠的心臟重量及體重，應(yīng)用心臟重量與體重之比（HW/BW）定量評(píng)價(jià)其心肌肥厚程度。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè) 使用Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。取小鼠心肌組織50 mg，按TrIzol Reagent（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)的步驟，抽提心肌組織RNA（100 ng），使用one-step RT-PCR kit（Qiagen）RT-PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過(guò)Real-time PCR 分別檢測(cè)心肌組織中 Nppa、β-MHC（Myh7）及PCBP2 mRNA水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè) Western blot檢測(cè)小鼠心肌組織中 Nppa、β-MHC（Myh7）及 PCBP2 蛋白水平：將100 mg小鼠心肌組織勻漿后，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加樣，電泳，免疫印跡，定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Real-time PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 心肌肥厚情況及心臟功能測(cè)定結(jié)果 心臟超聲評(píng)估小鼠的心臟功能，結(jié)果顯示，與Sham組相比，TAC組術(shù)后4周小鼠的HW/BW明顯增加（P＜0.05），而 LVEF、FS 則明顯下降（P＜0.05，見(jiàn)表 2），表明壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型構(gòu)建成功。

表2 兩組心肌肥厚情況及心臟功能測(cè)定結(jié)果（±s）

表2 兩組心肌肥厚情況及心臟功能測(cè)定結(jié)果（±s）

注：HW/BW：心臟重量與體重之比；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；FS：左室短軸收縮率。與Sham組相比，aP＜0.05

組別 HW/BW（mg/g） LVEF（%） FS（%）Sham 組 4.89±0.68 59.15±3.58 43.87±1.37 TAC 組 8.23±1.88a41.38±2.22a33.61±0.92a

2.2 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果 與Sham組相比，TAC組的Nppa、Myh7 mRNA水平明顯升高。然而，TAC組PCBP2 mRNA水平則明顯低于Sham組，與Nppa、Myh7 mRNA水平的變化趨勢(shì)相反，表明PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)圖1。

圖1 Nppa、Myh7、PCBP2 mRNA相對(duì)表達(dá)情況

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 與Sham組相比，TAC組的Nppa、Myh7蛋白表達(dá)明顯增加。然而，TAC組PCBP2蛋白水平則低于Sham組，與Nppa、Myh7蛋白表達(dá)的變化亦呈相反趨勢(shì)，也表明PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)圖2。

圖2 Myh7、Nppa、PCBP2 蛋白表達(dá)情況

3 討論

肥厚型心肌病早期患者可以沒(méi)有任何癥狀和不適，但是到了晚期可能會(huì)出現(xiàn)惡性心律失常、心衰甚至猝死，是導(dǎo)致年輕人猝死的首要原因[7]。然而，目前臨床上仍缺乏治療肥厚型心肌病的有效方法。因此，進(jìn)一步深入研究肥厚型心肌病的發(fā)病機(jī)制、優(yōu)化其治療方案，對(duì)改善肥厚型心肌病的療效及預(yù)后具有十分重要的意義。心臟負(fù)荷的增加被認(rèn)為是引起心肌肥厚的主要原因。心肌細(xì)胞由于受到負(fù)荷的刺激，細(xì)胞核內(nèi)DNA含量增加，RNA/DNA比值增大，蛋白質(zhì)合成增加、線粒體體積變大。而由于哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞已喪失有絲分裂能力，所以細(xì)胞數(shù)量不增，但每個(gè)細(xì)胞中的肌節(jié)數(shù)目增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞變粗、變長(zhǎng)，進(jìn)而發(fā)生心肌肥厚。心肌肥厚是心臟力學(xué)改變引起的一系列生理生化的適應(yīng)性反應(yīng)，高血壓、心肌缺血以及神經(jīng)體液的激活，都可導(dǎo)致病理性的心肌肥厚。在心肌肥厚過(guò)程中，不僅心肌細(xì)胞的體積增大，細(xì)胞肌節(jié)數(shù)目也增加[8]。

目前，肥厚型心肌病被認(rèn)為是遺傳性疾病，與基因突變密切相關(guān)[1-3,9,10]。通過(guò)基因檢測(cè)可以早期確診肥厚型心肌病。心房鈉尿肽前體A（Nppa）及β肌球蛋白重鏈（β-MHC）是常用的心肌肥厚標(biāo)志物[11,12]。Nppa基因定位于染色體1p36，編碼心房鈉尿肽（ANP）的前體[12]。ANP是由心房肌細(xì)胞合成并分泌的肽類激素，主要作用是使血管平滑肌舒張和促進(jìn)腎臟排鈉、排水。β-MHC是肌球蛋白的重要組成部分，在心臟收縮功能中起著至關(guān)重要的作用[11]。Myh7基因是編碼心臟β-MHC的基因，該基因?qū)π募》屎窈托呐K功能有著重大影響，是公認(rèn)的能引起心肌肥厚的主要致病基因[2,9]。以往的研究已證實(shí)，在心肌肥厚發(fā)生中，Nppa及β-MHC表達(dá)明顯增加[11-13]。本研究通過(guò)應(yīng)用主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力負(fù)荷成功構(gòu)建出小鼠心肌肥厚模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，TAC組小鼠的心肌肥厚程度明顯增加，左心室射血分?jǐn)?shù)及短軸收縮率明顯降低；TAC組的心肌肥厚標(biāo)志物Nppa、Myh7 mRNA水平及蛋白水平均明顯增加，這與以往的研究結(jié)果相一致，從分子水平進(jìn)一步驗(yàn)證了心肌肥厚模型構(gòu)建成功。

PCBP2作為多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白家族成員之一，可以特異性地與單鏈polyC富含區(qū)結(jié)合，可參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白相互作用等過(guò)程，對(duì)RNA的復(fù)制和翻譯起著重要的調(diào)控作用[4,5]。有圍繞PCBP2的研究報(bào)道，主要集中于PCBP2調(diào)控病毒RNA的復(fù)制過(guò)程及與病毒之間的關(guān)系[14,15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在腫瘤的調(diào)控中也起著重要作用[16,17]。此外，在心肌發(fā)育過(guò)程中，PCBP2也表達(dá)于心肌組織中，表明PCBP2可能在心臟發(fā)育過(guò)程中起著一定的調(diào)控作用[6]。但PCBP2在心肌肥厚過(guò)程中究竟起著促進(jìn)作用還是抑制作用，目前仍不清楚。在本研究中，我們?cè)趬毫ω?fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)小鼠心肌中PCBP2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAC組小鼠PCBP2 mRNA水平及蛋白水平明顯低于Sham組，與心肌標(biāo)志物Nppa、Myh7的變化趨勢(shì)相反。因此我們推測(cè)，PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用，上調(diào)PCBP2表達(dá)可能會(huì)抑制心肌肥厚的發(fā)展。

綜上所述，主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立的壓力負(fù)荷可成功誘導(dǎo)構(gòu)建出小鼠心肌肥厚模型，PCBP2在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其可能成為心肌肥厚治療的新靶點(diǎn)，上調(diào)PCBP2的表達(dá)可能是治療心肌肥厚的新策略。

［1］ Maron BJ， Maron MS.Hypertrophic cardiomyopathy.Lancet，2013，381：242-255.

［2］楊忠偉，徐艷萍，馮秀麗，等.用變性高效液相色譜檢測(cè)和脫氧核糖核酸測(cè)序方法對(duì)三個(gè)肥厚型心肌病家系β肌球蛋白重鏈基因突變的分析結(jié)果.中國(guó)循環(huán)雜志，2011，26：442-445.

［3］孔德華，王愛(ài)玲，陳多學(xué)，等.家族性肥厚型心肌病患者M(jìn)YBPC3基因突變篩查.臨床心血管病雜志，2010，26：93-96.

［4］Makeyev AV，Liebhaber SA.The poly（C）-binding proteins：a multiplicity of functions and a search for mechanisms.Rna，2002，8：265-278.

［5］Han W，Xin Z，Zhao Z，et al.RNA-binding protein PCBP2 modulates glioma growth by regulating FHL3.J Clin Invest，2013，123：2103-2118.

［6］Chan SY，Chan AK，Cheung BP，et al.Identification of genes expressed during myocardial development.Chin Med J（Engl），2003，116：1329-1332.

［7］Hershberger RE，Hedges DJ，Morales A.Dilated cardiomyopathy：the complexity of a diverse genetic architecture.Nat Rev Cardiol，2013，10：531-547.

［8］Dorn GW 2nd.Physiologic growth and pathologic genes in cardiac developmentand cardiomyopathy.Trends Cardiovasc Med，2005，15：185-189.

［9］Gómez J，Reguero JR，Morís C，et al.Mutation analysis of the main hypertrophic cardiomyopathy genes using multiplex amplification and semiconductor next-generation sequencing.Circ J，2014，78：2963-2971.

［10］潘齊川，徐潮，馮建忠，等.一個(gè)家族性肥厚型心肌病大家系致病基因的定位研究.中國(guó)醫(yī)藥，2013，8：1527-1530.

［11］Van Driest SL，Jaeger MA，Ommen SR，et al.Comprehensive analysis of the beta-myosin heavy chain gene in 389 unrelated patients with hypertrophic cardiomyopathy.J Am Coll Cardiol，2004，44：602-610.

［12］Deschepper CF，Masciotra S，Zahabi A ，et al.Functional alterations of the Nppa promoter are linked to cardiac ventricular hypertrophy in WKY/WKHA rat crosses.Circ Res，2001，88：223-228.

［13］Blair E，Redwood C，de Jesus Oliveira M，et al.Mutations of the light meromyosin domain of the beta-myosin heavy chain rod in hypertrophic cardiomyopathy.Circ Res，2002，90：263-269.

［14］Sean P，Nguyen JH，Semler BL.The linker domain of poly（rC）binding protein 2 is a major determinant in poliovirus capindependent translation.Virology，2008，378：243-253.

［15］Sean P，Nguyen JH，Semler BL.Altered interactions between stem-loop IV within the 5′noncoding region of coxsackievirus RNA and poly （rC） binding protein 2：effects on IRES-mediated translation and viral infectivity.Virology，2009，389：45-58.

［16］Molinaro RJ，Jha BK，Malathi K，et al.Selection and cloning of poly（rC）-binding protein 2 and Raf kinase inhibitor protein RNA activators of 2′，5′-oligoadenylate synthetase from prostate cancer cells.Nucleic Acids Res，2006，34：6684-6695.

［17］Chang JS，Santhanam R，Trotta R，et al.High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha -driven myeloid differentiation.Blood，2007，110：994-1003.

The effect of PCBP2 on the development of cardiac hypertrophy induced by pressure overloading in mice

ZHANG Yun-jiao，JIANG Zhao-lei，SI Yi，et al.Department of Cardiothoracic Surgery，Xinhua Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China

Objective The pressure overload cardiac hypertrophy was constructed by transaortic constric－tion（TAC）in mice.To explore the effect of PCPB2 on the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Methods 20 male C57BL/6 mice（age 8-10 weeks，weight 23-28 kg）were used to construct the model.The mice were divided into 2 groups：TAC group（TAC surgery） and Sham group（Sham surgery）.Cardiac function was evaluated by echocardiography at postoperative 4 weeks.Also，the degree of cardiac hypertrophy was assessed with the ratio of heart weight/body weight（HW/BW）.Real-time PCR was used to detected the mRNA of PCBP2 and cardiac hypertrophic marker（Nppa，β-MHC）.Western blot was used to examined the protein of PCBP2 and cardiac hypertrophic markers（Nppa，β-MHC）.The differences between the two groups were analyzed.Results Compared with Sham group，cardiac hypertrophy and HW/BW ratio were significantly higher in TAC group［TAC group（8.23±1.88）mg/g vs Sham group（4.89±0.68）mg/g］，but cardiac function was lower in TAC group［LVEF：TAC group（41.38±2.22）%vs Sham group（59.15±3.58）%；LVFS：TAC group（33.61±0.92）%vs Sham group（43.87±1.37）%（P＜0.05）］.The mRNA or proteins of Nppa and β-MHC of TAC group were higher than those of Sham group（P＜0.05）.However，both the mRNA and protein of PCBP2 were significantly lower than those of Sham group（P＜0.05）.Conclusion PCBP2 was a negative factor for the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Upregulation of PCBP2 may be able to inhibit the development of cardiac hypertrophy.

PCBP2； Cardiac hypertrophy； Nppa； β-MHC

MEI Ju，E-mail：ju_mei63@126.com

國(guó)家臨床重點(diǎn)?？祈?xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：）；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心新興前沿技術(shù)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：SHDC12014107）；上海新華醫(yī)院院級(jí)科研課題（項(xiàng)目編號(hào)：15YJ13）

200092 上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科

梅舉，E-mail：ju_mei63@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）10-0944-04

2016-05-07）