縫隙連接蛋白及其阻斷劑研究進展

王光亮，吳雪梅

(1.東北國際醫(yī)院第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒神經(jīng)科，吉林 長春 130000)

縫隙連接是細胞間最常見的連接方式，其參與調(diào)控細胞的生長、分化、增殖過程[1]。縫隙連接是位于相鄰細胞膜上的跨膜通道，允許相對分子質(zhì)量小于1 000或直徑小于1.5 nm的分子如環(huán)單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、Ca2+三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate,IP3)、三磷腺苷(adenosine triphosphate,ATP)以及一些小分子通過[2]?？p隙連接是細胞間電活動傳遞的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。心肌細胞間縫隙連接的主要功能是在細胞間起代謝耦聯(lián)與電偶聯(lián)作用，是維持心肌細胞電生理活動的基礎(chǔ)，與多種心臟疾病密切相關(guān)[1-2]。神經(jīng)元縫隙連接通路在癲癇、缺血性腦血管病、腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也扮演著重要角色[3-5]?？p隙連接的通透功能可塑性較高，縫隙連接半通道的開閉可以被多種因素調(diào)控。縫隙連接開放可以促進細胞間電活動，從而引起相關(guān)疾病，應(yīng)用縫隙連接阻斷劑減少縫隙連接的開放可能減輕細胞間電活動，縫隙連接阻斷劑可能成為心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究熱點，為新型藥物的研發(fā)提供思路[6-7]。本文就心肌細胞及神經(jīng)細胞縫隙連接蛋白的典型代表Cx36、Cx43及其阻斷劑的研究進展進行綜述。

1 縫隙連接蛋白的種類、主要功能及調(diào)節(jié)因素

1.1 縫隙連接蛋白的種類縫隙連接是由縫隙連接蛋白構(gòu)成，縫隙連接蛋白一般均成簇分布,數(shù)目為6～1 000個，甚至更多。縫隙連接由相鄰細胞膜上鏡像對稱的半通道組成。該半通道是由6個縫隙連接蛋白組成，為中空六聚體結(jié)構(gòu)[8]?？p隙連接蛋白是多基因家族編碼的一大類膜蛋白?？p隙連接蛋白的種類包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57等[8-9]。根據(jù)縫隙連接蛋白基因相對分子質(zhì)量大小，一般將縫隙連接蛋白分為3大類[2]：Ⅰ組(即β類)的縫隙連接蛋白包括Cx26、Cx30、Cx31、Cx32；Ⅱ組(即α2類)的縫隙連接蛋白包括Cx33、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50、Cx57；Ⅲ 組(即γ2類)的縫隙連接蛋白主要以新近發(fā)現(xiàn)的Cx36為代表[10]。

在心室肌細胞主要表達的是Cx43，在神經(jīng)元細胞主要表達的是Cx36[5]。心肌細胞縫隙連接主要由Cx40、Cx45和Cx43構(gòu)成，心室肌的縫隙連接則主要由Cx43構(gòu)成。縫隙連接蛋白Cx43的數(shù)量、分布、磷酸化水平等出現(xiàn)異常將導(dǎo)致心室肌細胞的整體性異常，使細胞間電信號傳導(dǎo)速度和方向發(fā)生異常改變，心肌產(chǎn)生折返和傳導(dǎo)阻滯，進而發(fā)生心律失常。Cx36相對分子質(zhì)量約36 000，被命名為Cx36[10]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Cx36主要表達于神經(jīng)元上，在星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞幾乎無表達，Cx36在腦的下橄欖核最密集，于海馬的CA1、CA3、CA4等區(qū)高度表達。Cx36構(gòu)成的縫隙連接是神經(jīng)元之間最常見的耦聯(lián)形式，是神經(jīng)元之間電偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Cx36在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛多樣化表達，提示其可能在電信號的傳遞方面發(fā)揮著非常重要的作用[5,10]，由其參與構(gòu)成的縫隙連接對中樞神經(jīng)元動作電位的發(fā)放模式和動作電位發(fā)放的同步化起著重要作用。眾多實驗研究報道，其參與癲癇的發(fā)作過程[11-12]。

1.2 縫隙連接蛋白的功能縫隙連接通過細胞間的直接信號傳導(dǎo)統(tǒng)一協(xié)調(diào)細胞的發(fā)育、形態(tài)、增殖、分化，縫隙連接蛋白功能、結(jié)構(gòu)及數(shù)量改變可以引起多種疾病發(fā)生。

縫隙連接蛋白Cx43是心室肌細胞間隙連接通道，主要功能是在細胞間起代謝耦聯(lián)與電偶聯(lián)作用，是維持心肌細胞電生理活動的基礎(chǔ)，與心房顫動、風(fēng)濕性心瓣膜病等多種心臟疾病密切相關(guān)[3-4]。心室肌細胞的Cx43主要集中在閏盤處，其傳導(dǎo)電化學(xué)信號可以沿縱向和橫向雙向傳導(dǎo)。細胞間相鄰部位的閏盤的一側(cè)Cx43數(shù)量明顯多于另一側(cè)相鄰部位，這使得電傳導(dǎo)方向主要沿細胞縱軸傳播，并且沿縱軸的電信號傳導(dǎo)速度要遠快于沿橫軸方向。若Cx43的正常排列遭到破壞，可導(dǎo)致心肌電信號傳導(dǎo)的不連續(xù)性和不均勻性增加，進而導(dǎo)致心律失常。

神經(jīng)元的主要縫隙連接蛋白Cx36的功能有[13]：(1) 介導(dǎo)神經(jīng)元之間的電傳遞。縫隙連接被稱為神經(jīng)元的電突觸，神經(jīng)細胞之間動作電位的傳遞時間間隔幾乎為零；因此，認為這種傳遞是直接通過縫隙連接，而不是通過化學(xué)突觸?？p隙連接的直接傳遞也被認為是使神經(jīng)元電活動達到同步化的主要因素。(2)促進神經(jīng)元的生長、分化。在不成熟的神經(jīng)細胞以及出生后不久的神經(jīng)元中，神經(jīng)元之間縫隙連接信號傳導(dǎo)表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢；因此，在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)環(huán)路形成、皮層發(fā)育的過程中，縫隙連接間的信號傳導(dǎo)有至關(guān)重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟以后，神經(jīng)元間的縫隙連接逐漸減少，但仍存在一些神經(jīng)元細胞之間的縫隙連接介導(dǎo)的電信號傳導(dǎo)，并參與神經(jīng)損傷后的再生與重塑。(3)介導(dǎo)第二信使的傳遞?？p隙連接蛋白Cx36與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動的調(diào)節(jié)，與第二信使(Ca2+、cAMP及IP3等)以及一些必需代謝產(chǎn)物的交換密切相關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞間縫隙連接通透性強，第二信使及一些必需代謝產(chǎn)物通過縫隙連接在細胞間傳遞，以實現(xiàn)并協(xié)調(diào)其生物效應(yīng)。(4)實現(xiàn)神經(jīng)元的自我識別。如果機械地把存在于同一神經(jīng)元上的兩個生長錐分離下來，那么被分離下來的兩個生長錐之間可以通過自我識別，迅速地在彼此之間再次形成縫隙連接。(5)參與記憶、認知。如果對神經(jīng)元長時間強化刺激，可增加縫隙連接的通透性，同時學(xué)習(xí)和記憶能力得到提升，表明縫隙連接可能參與學(xué)習(xí)和記憶過程。

1.3 縫隙連接蛋白的調(diào)節(jié)因素縫隙連接蛋白半通道的開放可被諸多因素調(diào)控，具有較大的可塑性。細胞間信號傳導(dǎo)可由縫隙連接的數(shù)目、分布、分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)控?？p隙連接調(diào)節(jié)過程主要有變換構(gòu)象、聚集、去聚集、降解等。有研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接通道的變換構(gòu)象、聚集、解體、降解以及通道開閉，可以通過磷酸化的調(diào)控來實現(xiàn)[2]。細胞間信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)可通過改變縫隙連接蛋白的磷酸化狀態(tài)來實現(xiàn)，胞內(nèi)磷脂酶可催化縫隙連接蛋白使其去磷酸化[1]。同時，細胞內(nèi)Ca2+濃度也可以調(diào)控縫隙連接通道的開閉[2]。細胞質(zhì)內(nèi)pH值亦可調(diào)控縫隙連接通道的開閉以影響其電導(dǎo)性?？p隙連接蛋白的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控也參與縫隙連接蛋白開閉的調(diào)節(jié)?？p隙連接通道的形成過程及縫隙連接數(shù)目的改變受一些長時間作用因素的影響，如激素水平失衡等因素均可影響縫隙連接通道的形成及其通透性。激素可通過cAMP作用，增強細胞間縫隙連接的細胞信號傳導(dǎo)程度[14]。

2 縫隙連接蛋白在心臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用研究現(xiàn)狀

2.1 心臟及神經(jīng)系統(tǒng)疾病對縫隙連接蛋白Cx43、Cx36表達水平的影響縫隙連接蛋白Cx43在心肌細胞的表達水平也是近年來研究的熱點。中層心肌與心內(nèi)、外膜下心肌間Cx43蛋白表達不一致，這是左心室存在心肌橫斷面上復(fù)極離散的蛋白基礎(chǔ)[15]。此外，Cx43蛋白的表達下降可能是低溫造成心室復(fù)極不均一性增大的原因之一[16]。

Cx36作為唯一在神經(jīng)系統(tǒng)中優(yōu)先表達的縫隙連接蛋白，參與了癲癇的發(fā)作過程，癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病，發(fā)病率較高，其中難治性癲癇治療效果差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[17-19]。Cx36已逐漸成為神經(jīng)電生理領(lǐng)域的研究熱點[20-22]。目前，Cx36在癲癇患者腦細胞中的表達有爭議，有研究報道，在癲癇發(fā)作過程中Cx36在海馬中的表達水平明顯升高[23]，但是也有學(xué)者認為癲癇過程中Cx36在海馬的表達量沒有改變甚至有所下降[24-25]。WU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Cx36的表達可以呈一系列動態(tài)變化過程，不同時間點表達變化不同，可以隨時間變化呈先升高后降低的動態(tài)變化過程。

2.2 縫隙連接蛋白Cx43、Cx36對細胞間正常電活動的影響在心血管系統(tǒng)中，Cx43是心室肌細胞縫隙連接的主要構(gòu)成蛋白，其數(shù)量、分布、磷酸化水平等因素均影響心肌細胞電活動的傳遞，在維持心肌細胞的正常生理活動中起重要作用，是心肌細胞間電傳遞的關(guān)鍵因素[1-2]?？p隙連接蛋白Cx43在心肌中呈節(jié)律性表達，這種節(jié)律性可能受到生物鐘系統(tǒng)的調(diào)節(jié)?？p隙連接通道異?？蓪?dǎo)致心室肌細胞的整體性異常，使傳導(dǎo)速度和方向發(fā)生異常改變[2]。

有學(xué)者認為，癲癇發(fā)作是由于腦內(nèi)不同部位腦細胞興奮性與抑制性遞質(zhì)的不平衡所致[26]。癲癇發(fā)病機制復(fù)雜多樣，除上述因素以外，離子通道結(jié)構(gòu)功能的異常、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、免疫因素及縫隙連接等因素亦參與癲癇的發(fā)生、發(fā)展及維持。神經(jīng)元異常放電是癲癇的電生理基礎(chǔ)。研究表明，神經(jīng)元之間信息傳遞是以動作電位傳遞為基礎(chǔ)的，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)同步化電活動是信息傳遞的基本方式和神經(jīng)功能實現(xiàn)的基礎(chǔ)，但過度同步化放電是導(dǎo)致癲癇發(fā)生的電生理學(xué)原因[27]。隨著對縫隙連接研究的深入，發(fā)現(xiàn)在癇性電活動中經(jīng)電信號傳遞介導(dǎo)的同步化機制扮演著重要角色，其發(fā)揮作用主要是通過縫隙連接實現(xiàn)[28-30]。

癲癇患者存在相應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的改變，這些改變既可能是癲癇的原因又可能是癲癇的結(jié)果。有關(guān)癲癇患者腦組織結(jié)構(gòu)改變的研究，一直是人們關(guān)注的焦點。某一細胞受到刺激，或者接受到外界某種信息，其離子電位改變并通過縫隙連接迅速將離子或其他調(diào)節(jié)信號傳遞給相鄰細胞，完成機體的整體功能調(diào)節(jié)，這種電緊張突觸聯(lián)絡(luò)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的同步化機制[31]，而同步化在癲癇發(fā)病中具有重要作用。WU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元縫隙連接蛋白Cx36可通過增加電突觸的數(shù)目，增強電傳導(dǎo)性，進而使電突觸耦聯(lián)的數(shù)目增加，促進神經(jīng)元的同步放電，增加癲癇產(chǎn)生的可能性。在病理情況下，縫隙連接參與神經(jīng)元電活動，引起電突觸數(shù)目增加以及電傳導(dǎo)性增強，通過電緊張突觸傳遞，作用于同步化機制，使電突觸耦聯(lián)的神經(jīng)元數(shù)目增加，進一步促使神經(jīng)元的同步化放電，從而增加癲癇產(chǎn)生的可能性。越來越多的實驗表明，神經(jīng)元之間的縫隙連接通道是形成上述同步化放電的重要因素[32]。

2.3 縫隙連接蛋白Cx43、Cx36在心臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病異常電活動中的作用心律失常是循環(huán)系統(tǒng)常見疾病，是危及生命的重要疾病[33-35]，其可單獨發(fā)病，也可并發(fā)其他心血管系統(tǒng)疾病，病因主要是心肌細胞的異常興奮性增加。近年來，隨著對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)心律失常與心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)[36-38]。Cx43是心室縫隙連接通道的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，其分布和表達異?？蓪?dǎo)致心肌細胞興奮性異常，從而引起細胞間傳導(dǎo)速度減慢以及傳導(dǎo)方向發(fā)生改變，導(dǎo)致折返性心律失常[2]。因此，Cx43很可能成為心律失常治療的新靶點。

癲癇病因很復(fù)雜，是一個反復(fù)的病理生理過程，具有以下特點[39]：(1)反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作；(2)海馬、杏仁核等邊緣系統(tǒng)與癲癇密切相關(guān)；(3)癲癇腦部可有病理改變，如海馬硬化；(4)對抗癲癇藥物耐藥。針對癲癇的病因、致癇機制和治療的研究尚需完善。

研究表明，海馬是癲癇的常見起始部位之一，異常放電可從海馬起始并擴散至整個Papez網(wǎng)絡(luò)環(huán)路[40]。海馬是邊緣系統(tǒng)的一個重要結(jié)構(gòu)，不僅與認知、記憶等方面密切相關(guān)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生方面也起到非常重要的作用，可能是由于海馬對缺血、缺氧以及某些興奮性氨基酸毒性等因素較為敏感；除此之外，海馬神經(jīng)元興奮性高亦可能與海馬易受損傷有關(guān)。海馬區(qū)域的神經(jīng)元細胞中Cx36的含量較其他部位更高[41]。隨著相關(guān)研究的進一步深入，海馬與癲癇之間的關(guān)系將會受到進一步的重視。

3 縫隙連接阻斷劑的研究現(xiàn)狀

心肌梗死后大鼠心肌組織Cx43去磷酸化，心室顫動閾值降低，應(yīng)用美托洛爾可促進Cx43的磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)心電傳導(dǎo)異常[42]。Cx36與癲癇相關(guān)性的體外及體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接阻斷劑可以作為新型抗癲癇藥物，盡管其尚未應(yīng)用于臨床[29-31]。

縫隙連接及縫隙連接阻斷劑的研究，有可能成為癲癇發(fā)病機制及治療領(lǐng)域最有價值的研究熱點?？p隙連接可以促進神經(jīng)元之間的超同步化放電而引起癲癇，應(yīng)用縫隙連接阻斷劑可減輕癇性發(fā)作及神經(jīng)元放電的程度，縫隙連接阻斷劑有望成為抗癲癇治療的新藥[43]。目前，常用的縫隙連接阻斷劑有：(1)非選擇性縫隙連接阻斷劑。如丙酸和丙酸鈉，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酸化程度來調(diào)節(jié)縫隙連接的開放。此外，還有庚醇和辛醇，二者屬于長鏈醇類，而乙氟醚屬于麻醉類藥物，甘珀酸和18α-甘草次酸屬于甘草次酸衍生物。研究較多的是甘珀酸，為一種非選擇性廣譜抑制劑，同時具有濃度依賴性，可使Cx43、Cx36表達減低。(2)縫隙連接選擇性阻斷劑。神經(jīng)元的選擇性阻斷劑主要有奎寧、奎尼丁和甲氟奎。奎寧是一種抗瘧藥[43-44]，新近發(fā)現(xiàn)其能選擇性阻斷Cx36介導(dǎo)的縫隙連接細胞間信號傳導(dǎo)，且阻斷作用具有可逆性和劑量依賴性。最近，還有一些體外研究報道了奎寧在不同致癇模型上具有抗驚厥作用[44-45]。因此，縫隙連接阻斷劑有可能成為研究的新熱點。

4 展望

細胞間的縫隙連接有傳導(dǎo)速度快、阻抗小的特點，在細胞間電活動傳遞中起到重要作用，在心肌細胞、神經(jīng)細胞電傳遞相關(guān)疾病中，縫隙連接發(fā)揮了重要作用。因此，縫隙連接通道可能參與心臟、神經(jīng)系統(tǒng)電生理相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展及維持?？p隙連接蛋白Cx43、Cx36可能通過增加電突觸的數(shù)目，使電傳導(dǎo)性增強，促進細胞間電活動，增加疾病產(chǎn)生的可能性。因此，以縫隙連接為靶點，開展對其作用機制及其阻斷劑的研究，有益于新型治療藥物的研發(fā)。