陜南白山羊偽結(jié)核棒狀桿菌分離鑒定及滅活鋁膠疫苗研制

蔡俊波，王愛玲，李海敏，李春燕，焦陽陽,3，張彥明*，郭抗抗*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省安康市石泉縣后柳鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站,陜西石泉 725200；3.陜西省延安市安塞縣真武洞鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,陜西安塞 717400)

?

陜南白山羊偽結(jié)核棒狀桿菌分離鑒定及滅活鋁膠疫苗研制

蔡俊波1,2，王愛玲1，李海敏1，李春燕1，焦陽陽1,3，張彥明1*，郭抗抗1*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.陜西省安康市石泉縣后柳鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站,陜西石泉 725200；3.陜西省延安市安塞縣真武洞鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,陜西安塞 717400)

摘要：羊干酪性淋巴結(jié)炎又稱羊偽結(jié)核病，是由偽結(jié)核棒狀桿菌感染引起的一種人畜共患慢性接觸性傳染病，對山羊危害最為嚴重，目前尚無有效治療措施。陜西省石泉縣陜南白山羊飼養(yǎng)量較大，羊群也存在偽結(jié)核棒狀桿菌的感染，造成較大的經(jīng)濟損失。為篩選對當?shù)貍谓Y(jié)核棒狀桿菌敏感的藥物和研制滅活疫苗，本研究從疑似偽結(jié)核病患羊采取多份新鮮的膿液，進行細菌分離鑒定；對獲得的1株分離菌進行藥物敏感性試驗并用其研制滅活疫苗。結(jié)果顯示，分離菌在固體培養(yǎng)基上形成白色、干燥、扁平、不透明、邊緣整齊的中等大小菌落，革蘭染色陽性，經(jīng)16 S rRNA檢測和序列分析，證實分離到的菌株為羊偽結(jié)核棒狀桿菌。藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，該分離菌對環(huán)丙沙星、頭孢曲松、紅霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、妥布霉素、強力霉素、慶大霉素、氯霉素高度敏感；對四環(huán)素、利福平、鏈霉素中度敏感。以該分離菌為種子菌制備的滅活鋁膠疫苗無菌檢驗合格，試驗接種山羊無不良反應，目前已經(jīng)在采樣羊場進行臨床應用，進一步評價免疫效果。關(guān)鍵詞：偽結(jié)核棒狀桿菌；分離鑒定；藥敏試驗；滅活疫苗

偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)可引發(fā)羊體表及內(nèi)臟出現(xiàn)膿腫，濃汁呈現(xiàn)干酪樣，因其多發(fā)生在局部淋巴結(jié)，故被稱為偽結(jié)核病，也有人根據(jù)發(fā)病癥狀稱其為干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA)。該病對山羊的危害性較大，感染羊雖然不會在短時間內(nèi)出現(xiàn)較高的病亡率，但隨著該病的持續(xù)發(fā)展與傳播蔓延，對羊群的危害逐漸凸顯，患病羊主要出現(xiàn)消瘦，甚至零星死亡，且一旦羊場受到該菌感染后難以清除[1]。因此，堅持羊群臨床檢查，對疑似病羊及早確診，對病羊采取隔離治療或淘汰成為當前解決該病的主流思路[2]。羊偽結(jié)核棒狀桿菌除了感染羊外，也可以引起人及其他動物感染，是一種人畜共患的慢性傳染病病原。有報道稱從一名患有壞死性淋巴結(jié)炎的12歲女孩的病料中擴增到偽結(jié)核棒狀桿菌FRC41的全基因序列[3]；也有豬感染偽結(jié)核棒狀桿菌的報道[4]。因此，對該病的危害應引起足夠的重視。

陜南白山羊是秦巴山區(qū)飼養(yǎng)的主要山羊品種，養(yǎng)殖陜南白山羊是山區(qū)群眾脫貧致富的重要途徑，現(xiàn)有存欄量約140萬只。近期石泉縣陜南白山羊飼養(yǎng)戶多反映飼養(yǎng)的羊群中有部分羊在下頜部淺表淋巴結(jié)、肩部淺表淋巴結(jié)和腹股溝淺表淋巴結(jié)的一處或多處出現(xiàn)一個或者多個較大膿包，形成初期膿包觸之有堅硬感，后期觸之有波動感，病羊自身無痛感。為探明其病因，及時向養(yǎng)殖戶提供有針對性的治療方案，減少對養(yǎng)殖效益的影響，維護公共衛(wèi)生安全，我們從散養(yǎng)戶、規(guī)模場及養(yǎng)殖專業(yè)合作社中選取羊體表出現(xiàn)有膿包的羊場，采集疑似患羊病變部位新鮮的膿液，進行細菌分離鑒定和藥敏試驗，并進行滅活疫苗的研制和初步應用，以期為這些羊場該病的防控提供依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源于石泉縣后柳鎮(zhèn)散養(yǎng)戶、規(guī)模場以及養(yǎng)殖專業(yè)合作社的羊群中病羊的肩部、下頜部、腹股溝處膿包的膿汁共計30份，其中肩部采樣9份，下頜部11份，腹股溝處10份。將無菌采集的病料加入甘油生理鹽水(甘油與生理鹽水按1∶1比例混合)，置-4 ℃保存待檢。

1.1.2主要試劑綿羊血平板培養(yǎng)基按常規(guī)配制；常用藥敏片，杭州天合微生物試劑有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master MiX、Maker D L 2 000，北京康為科技有限公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMDl8-T 載體、DH5α感受態(tài)細胞，TaKaRa公司產(chǎn)品；40 g/L氫氧化鋁凝膠，西安赫特生物科技有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1細菌分離純化在無菌條件下，用接種環(huán)分別挑取保存的病料劃線于血平板培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落的形態(tài)，挑取單個菌落的一半進行革蘭染色鏡檢，根據(jù)鏡檢結(jié)果將疑似菌落的另一半重新接種于血平板培養(yǎng)基進一步進行細菌培養(yǎng)和純化。

1.2.2引物設(shè)計采用通用細菌16 S rRNA 引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物使用濃度為10 μmol/L。引物序列為：

16 S-F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16 S-R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[5]。PCR產(chǎn)物預期大小為1 500 bp。

1.2.3細菌16 S rRNA的PCR檢測將純化的細菌接種于5 mL含有50 mL/L血清LB溶液中，置于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h～12 h。取3 mL菌液按照細菌DNA提取試劑盒說明步驟提取DNA，剩余菌液置-4 ℃保存待用。PCR反應體系包括：2×TaqPCR Master MiX 10 μL，上、下游引物各1 μL，細菌DNA 1 μL，滅菌雙蒸水補至總體積20 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。將PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段按照膠回收試劑盒說明進行回收，將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，純化的重組質(zhì)粒送至北京華大基因公司進行序列測定。

1.2.4分離菌的藥敏試驗根據(jù)分離菌的16 S rRNA序列分析，將培養(yǎng)特性、染色鏡檢及序列分析均符合偽結(jié)核棒狀桿菌的菌液接種到10 mL含有50 mL/L血清LB溶液中，置于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h～12 h。對培養(yǎng)菌進行計數(shù)并保菌，取1 mL菌液調(diào)整細菌數(shù)為0.5麥氏度，再以無菌操作均勻涂布到含50 mL/L綿羊血的血平板培養(yǎng)基上，在每個平板上依次以梅花樁形式放置5片藥敏片，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h～48 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，依照美國臨床實驗室標準化委員會頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》(抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感，直徑在15 mm～20 mm之間為中度敏感，直徑<15 mm為耐藥)判定藥敏試驗結(jié)果。

1.2.5分離菌的鋁膠滅活疫苗試制將分離菌菌液作為制作滅活鋁膠疫苗的種子液，無菌操作均勻涂布在含200 mL/L血清的培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h～72 h。用50 g/L滅菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基，并用涂布棒將菌液收集至已滅菌并帶有玻璃珠的錐形瓶中，充分搖晃使菌液均勻混濁。按收獲菌液體積5 mL/L加入5 mL/L甲醛溶液，置37 ℃、200 r/min搖床中滅活24 h～48 h。然后無菌取滅活后的菌液接種到含50 mL/L綿羊血的血平板上，置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有細菌生長。若無菌落長出說明已完全滅活。通過比濁法將菌液濃度調(diào)整到6×109CFU/mL，最后按等體積加入40 g/L氫氧化鋁凝膠[6]，充分乳化均勻，分裝，密封，貼簽，保存。1.2.6無菌檢查疫苗制備好后，隨機取樣做無菌檢查，即在無菌條件下，從已配制好的疫苗中取出1 mL涂布于50 mL/L血平板上，置37 ℃培養(yǎng)48 h～72 h,觀察是否有菌落生長。

1.2.7安全性檢查隨機選取健康陜南白山羊20只分為2組，每組中各有2只剛斷奶山羊，2只3月齡山羊，6只6月齡以上山羊，一組按疫苗1 mL/只，另一組按2 mL/只肌肉注射免疫，免疫接種后連續(xù)觀察20 d看接種羊有無不良反應，接種部位是否異常。

2　結(jié)果

2.1細菌分離純化

將采集的膿汁分別劃線于含50 mL/L綿羊血的血平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，血平板上出現(xiàn)白色、干燥、扁平、不透明、邊緣整齊、易推動的圓形菌落，將血平板對著光線，可以在菌落周圍清晰的看到溶血環(huán)(圖1)。革蘭染色后鏡檢，可見單個或柵格狀的革蘭陽性球狀短桿菌(圖2)，分離菌從菌落形態(tài)和染色特性上與羊偽結(jié)核棒狀桿菌相似。

2.2分離菌16 S rRNA鑒定結(jié)果

疑似菌的DNA，利用細菌16 S rRNA通用引物進行PCR擴增后，獲得長度為1 500 bp的擴增產(chǎn)物(圖3)，序列分析表明，分離得到1株疑似菌與羊偽結(jié)核棒狀桿菌16 S rRNA序列的同源性為99.5%，可以確定該分離菌為羊偽結(jié)核棒狀桿菌(圖4)。

2.3藥敏試驗結(jié)果

分離菌藥敏試驗結(jié)果如表1。從表1可以看出該菌對環(huán)丙沙星、頭孢曲松、紅霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、妥布霉素、強力霉素、慶大霉素、氯霉素等抗菌藥物高度敏感；對四環(huán)素、利福平、鏈霉素等中度敏感。

2.4滅活疫苗無菌檢測結(jié)果

試制的鋁膠滅活疫苗置37 ℃培養(yǎng)72 h，未見細菌生長。

2.5滅活疫苗安全性檢查結(jié)果

20 d的觀察期內(nèi)，山羊注射部位沒有發(fā)生腫脹，體溫正常，沒有出現(xiàn)體溫升高的現(xiàn)象，山羊采食量沒有明顯變化，精神狀況良好。

圖1　分離菌在血液瓊脂平板上形成的菌落

圖2　革蘭染色鏡檢結(jié)果

M.DNA標準DL 2 000; 1.空白對照；2.分離菌16 S rRNA 擴增片段M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2.16 S rRNA segment in sample

圖3分離菌16 S rRNA PCR擴增電泳結(jié)果

Fig.3Electrophoresis of PCR products ofCorynebacteriumpseudotuberculosis16 S rRNA

3　討論

細菌分離鑒定是及時確診疾病的最直接證據(jù)，但是常規(guī)的細菌鑒定(生化實驗、血清學試驗)存在耗時費力等不足，應用分子生物學方法進行細菌16 S rRNA的克隆和序列分析，可以快速的進行細菌鑒定。

圖4　分離菌16 S rRNA序列進化樹分析

偽結(jié)核棒狀桿菌進入動物體內(nèi)后存在于動物細胞內(nèi)，這使得治療藥物對偽結(jié)核病的療效有限。本病主要經(jīng)由膿包破潰后流出的膿汁接觸健康羊的破損皮膚傳播[7]。因此，治療該病時，人們一般選擇在膿包形成初期或者后期將其割除，并用雙氧水沖洗創(chuàng)口或用民間偏方向割開膿包創(chuàng)口內(nèi)填充紅糖以期達到控制該病在羊群中傳播目的[8-9]。本研究通過對不同羊場分離獲得的1株分離株進行藥敏試驗得到了具有抑制分離菌生長的敏感藥物，為這些羊場分離菌引起的疾病治療提供參考。

疫苗免疫對偽結(jié)核病的防控能起到一定的作用[10]。本次試驗在獲得分離菌的基礎(chǔ)上試制了偽結(jié)核棒狀桿菌鋁膠滅活自家疫苗，通過20 d的安全性試驗，發(fā)現(xiàn)試制的疫苗副作用小，對山羊本身無明顯影響，可以試用于健康羊群以觀察對偽結(jié)核棒狀桿菌感染的預防效果，為探索減少該菌對山羊的危害提供方法。本試驗已經(jīng)將試制自家疫苗應用到了采樣場的健康羊群中，但由于該病在溫熱季節(jié)發(fā)病率較高，且注射羊群中有一些幼齡羊(幼齡動物發(fā)該病幾率較小)，因此疫苗的效果還有待長期觀察。

表1　偽結(jié)核棒狀桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果

參考文獻：

[1]Mujgan I,Mehmet A,Ziya I,et al.Studies on vaccine development for ovine caseous lymphadenitis [J].Ankara Universitesi Veteriner fakultesi Dergisi,2010,57:161-165.

[2]楊雪紅，郭雪潔，馬寧君,等，羊干酪性淋巴結(jié)炎研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008(1):1-2.

[3]Trosit E,Ott L,Schneider J,et al.The complete genome sequence ofCorynebacteriumpseudotuberculosisFRC41 isolated from a 12-year-old girl with necrotizing lymphadenitis insights into gene regulatory networks contributing to virulence[J].BMC Genomics,2010,11:728.

[4]Oliveira M,Barroco C,Mottola C,et al.First report ofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrom caseous lymphadenitis lesions in black Alentejano pig[J].BMC Vet Res,2014,10:218.

[5]羅雯，萬雅各.采用16 S rRNA基因PCR檢測病原菌的研究進展[J].南昌大學學報：理科版，2000,24(3)：302-306.

[6]喬宏興，索江華，邊傳周,等，雞傳染性鼻炎氫氧化鋁佐劑滅活苗的制備及免疫試驗[J].動物醫(yī)學進展，2014,35(6)：157-159.[7]侯萬天，劉界強.羊偽結(jié)核病的防治[J].畜牧與飼料科學，2014,35(9)：116-117.

[8]邢福珊，云世雄，李景河,等.波爾山羊干酪性淋巴結(jié)炎的病原鑒定及防治[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004(5):48.

[9]廖雄，文正常，王璇,等.山羊偽結(jié)核 病的診斷與防治[J].中國畜禽種業(yè)，2013(9)：105-106.

[10]侯宏虎，王志芳，楊增岐.羊偽結(jié)核及大腸埃希菌病二聯(lián)滅活油苗的試制[J].動物醫(yī)學進展，2007,28(10)：116-118.

收稿日期：2016-01-21

基金項目：陜西省重點農(nóng)業(yè)科技示范推廣項目(ZDKJ-2014-33)；西北農(nóng)林科技大學科技推廣示范項目(Z222021411)

作者簡介：蔡俊波(1987-)，男，重慶綦江人，助理畜牧師，獸醫(yī)碩士，主要從事畜牧技術(shù)推廣工作。*通訊作者

中圖分類號:S855.12；S858.26

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0049-04

Isolation and Identification ofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrom White Goat in South Shaanxi and Development of an Inactivated Vaccine with Aluminum Hydroxide Adjuvant

CAI Jun-bo1,2,WANG Ai-ling1，LI Hai-min1,LI Chun-yan1,JIAO Yang-yang1,3,ZHANG Yan-ming1,GUO Kang-kang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;2.ComprehensiveAgriculturalServiceStationofHouliuTown,Shiquan,Shaanxi,725200,China;3.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofZhenwudongtown,Ansai,Shaanxi,717400,China)

Abstract:Caseous lymphadenitis also known as ovine pseudotuberculosis,is a chronic zoonotic infectious disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis.This disease is harmful to goat especially,and there is not yet an effective treatment to prevent this disease.White goat is a main breed in Shiquan county of south Shaanxi,Corynebacterium pseudotuberculosis is an important pathogen in goat population and causes large economic losses in recent years.In order to screen drugs that are sensitive to local Corynebacterium pseudotuberculosis and develop an inactivated vaccine,the fresh pus were collected from the suspected pseudotuberculosis goats,the bacteria were isolated and identified from those samples.And then,drug sensitivity test was carried out with 1 isolate,and then an inactivated vaccine with aluminum hydroxide adjuvant was developed based this isolate.The results showed that the isolated bacteria formed a medium sized white,dry,flat and opaque,neat edge colony at solid agar,showing Gram stain positive.The isolate was confirmed as Corynebacterium pseudotuberculosis by analysis of 16 S rRNA sequences.Susceptibility test results showed this isolate was highly sensitive to ciprofloxacin,ceftriaxone,erythromycin,kanamycin,cefotaxime,moderately sensitive to tobramycin,doxycycline,gentamicin,chloramphenicol; tetracycline,rifampicin,streptomycin.Subsequently,an activated vaccine was developed with aluminum hydroxide adjuvant based on this isolate,no live bacterium was detected in this vaccine.The inactivated vaccine was injected to experimental goats in those herds that the samples were collected,and no abnormal reactions were observed in the goats.Clinical application also was carried out in goat herd and the immune effects will be evaluated later.This study provided an experimental basis for effective drugs and a choice of inactivated vaccine for preventing and controlling caseous lymphadenitis.

Key words:Corynebacterium pseudotuberculosis; isolation and identification; drug sensitivity test；inactivated vaccine