H PLC測定鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中光學異構體

曹天海（昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認證部，云南 昆明 650106）

H PLC測定鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中光學異構體

曹天海
（昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認證部，云南 昆明 650106）

目的：建立高效液相色譜法測定鹽酸帕洛諾司瓊中光學異構體含量的方法。方法：對于非對映異構體，采用C18色譜柱，以乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.1%三乙胺，用磷酸調pH值至4.0）（25∶75）為流動相；對于對映異構體，采用Chiralcel，OD-RH色譜柱，以100 mmol六氟磷酸鉀水溶液-乙腈（70∶30）為流動相；非對映異構體和對映異構體檢測波長分別為217 nm和240 nm。結果：鹽酸帕洛諾司瓊4個異構體線性關系良好，定量限和檢測限、方法回收率滿足要求。結論：本法靈敏、可靠，可用于鹽酸帕洛諾司瓊中光學異構體的質量控制。

鹽酸帕洛諾司瓊；高效液相色譜；光學異構體；測定

鹽酸帕洛諾司瓊（palonosetron hydrochloride），化學名（3aS）-2-［（3S）-1-氮雜雙環(huán)［2.2.2]辛烷-3-基]-2，3，3a，4，5，6-六氫-1-氧代-1H-苯并［de]異喹啉鹽酸鹽（圖1）。鹽酸帕洛諾司瓊注射液是5-HT3受體拮抗劑，用于預防在實施中度或高度致嘔吐性化療方案時所引起的急性和遲發(fā)性嘔吐，2003年由美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準在美國上市。鹽酸帕洛諾司瓊分子中含有2個手性中心，應存在一個對映體（RR-異構體）和一對非對映體（SR-異構體和RS-異構體）。本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測定鹽酸帕洛諾司瓊中光學異構體的方法，采用普通反相色譜法測定非對映異構體，采用手性固定性拆分了對映異構體，結果表明本方法準確、靈敏、可靠。

圖1　　鹽酸帕洛諾司瓊結構式

1儀器與試藥

島津 LC-2010CHT高效液相色譜儀，包括CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；戴安Summit P680高效液相色譜儀，包括Chameleon色譜工作站。

鹽酸帕洛諾司瓊（批號：130901，130902，131001）、鹽酸帕洛諾司瓊SS、RR、SR、RS對照品（均由昆明積大制藥股份有限公司提供）；乙腈為色譜純、水為重蒸餾水、其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1溶液配制

取本品適量，精密稱定，加水制成每1 mL中含0.06 mg的溶液，作為供試品溶液。

取供試品溶液1 mL，加水溶解并稀釋制成100 mL，作為對照溶液。

2.2色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）（Akzo Nobel公司），用于測定非對映異構體，Chiralcel，OD-RH（4.6 mm ×150 mm，5 μm）（大賽璐公司），用于測定對映異構體；流動相：乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.1%三乙胺，用磷酸調pH值至4.0）（25∶75），用于測定非對映異構體，100 mmol六氟磷酸鉀水溶液-乙腈（70∶30）用于測定對映異構體；流速：1.0 mL/min用于測定非對映異構體，0.6 mL/min用于測定對映異構體；柱溫：30℃；檢測波長：217 nm用于測定非對映異構體，240 nm用于測定對映異構體；進樣量：50 μL用于測定非對映異構體，50 μL用于測定對映異構體。理論塔板數(shù)按鹽酸帕洛諾司瓊計算應不低于1 500。測定非對映異構體時，本品與鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體的分離度不得低于1.0；測定對映異構體時，本品及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體的分離度不得低于1.5。

圖2　非對映異構體HPLC圖

圖3對映異構體HPLC圖

2.3波長選擇

取鹽酸帕洛諾司瓊對照品、鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體、鹽酸帕洛諾司瓊 RS-異構體及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體對照品分別加水制備成每1 mL中約含20 μg的溶液，測定各對照品的紫外吸收光譜，結果表明各對照品在240 nm附近處均有較強吸收，考慮到本品非對映異構體測定色譜條件與有關物質測定的色譜條件一致，因此選用有關物質的測定波長217 nm測定非對映異構體，選定240 nm作為對映異構體的檢測波長。

2.4專屬性

2.4.1非對映異構體取鹽酸帕洛諾司瓊對照品、鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體、鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體對照品各適量，加水分別制成0.06 mg/mL的溶液；分別取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，鹽酸帕洛諾司瓊保留時間為9.942 min，鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體保留時間為9.453 min，鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體保留時間為9.391 min。取鹽酸帕洛諾司瓊對照品和鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體對照品各適量，加水制成每 1 mL含鹽酸帕洛諾司瓊對照品0.06 mg和鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體對照品0.000 3 mg的溶液，作為非對映異構體測定系統(tǒng)適用性試驗溶液，取上述溶液50 μL，記錄色譜圖，本品及鹽酸帕洛諾司瓊分離度為1.26，達到基線分離，符合要求。取鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體及SR-異構體溶液各0.5 mL，混勻，取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，得到一個色譜峰，說明鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體及SR-異構體出峰位置相同，可以合并計算。

2.4.2對映異構體取鹽酸帕洛諾司瓊對照品、鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體各適量，加水分別制成0.06 mg/mL的溶液；分別取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，鹽酸帕洛諾司瓊保留時間為23.479 min，鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體保留時間為25.521 min。取鹽酸帕洛諾司瓊及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體溶液各0.5 mL，混勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，取上述溶液50 μL，記錄色譜圖，本品及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體分離度為 1.68，達到基線分離，符合要求。

2.5精密度

2.5.1非對映異構體取“2.4.1”中系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進樣6次，計算鹽酸帕洛諾司瓊對照品與非對映異構體（SR）主峰的RSD值，分別為2.9% 和2.0%，均小于3.0%。

2.5.2對映異構體取“2.4.2”中系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進樣6次，計算鹽酸帕洛諾司瓊對照品與對映異構體（RR）主峰的RSD值，分別為0.3%和0.4%，均小于2.0%。

2.6檢測限與定量限

按信噪比為3∶1得出檢測限，信噪比為10∶1得出定量限。

2.6.1非對映異構體鹽酸帕洛諾司瓊和SR-異構體檢測限分別為0.005 6 μg/mL和0.006 1 μg/mL；定量限分別為0.016 8 μg/mL和0.018 3 μg/mL；鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體檢測限為0.005 5 μg/mL，定量限為0.016 5 μg/mL。

2.6.2對映異構體鹽酸帕洛諾司瓊和鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體定量限分別為0.036 μg/mL和0.036 μg/mL，檢測限為0.012 μg/mL及0.012 μg/mL。

2.7線性和范圍及相對響應因子

2.7.1非對映異構體分別取“2.4”專屬性中鹽酸帕洛諾司瓊對照品及鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體溶液各 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于100 mL量瓶中，以水稀釋至刻度。分別取50 μL進樣，記錄色譜圖，計算各種物質的相關系數(shù)。得出鹽酸帕洛諾司瓊線性范圍為 0.000 122～0.000 732 mg/mL，回歸方程為：

y=1 464.87x+0.006 1，

相關系數(shù)為0.999 0；鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體線性范圍為0.000 112～ 0.000 672 mg/mL，回歸方程為：

y=1 302.09x-0.017，

相關系數(shù)為0.999 9。同法得出鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體線性范圍為0.000 22～0.000 66 mg/mL，回歸方程為：

y=1 489.73x-0.004，

相關系數(shù)為0.998 7。分別以鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體回歸方程的斜率除以鹽酸帕洛諾司瓊回歸方程的斜率，得到鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體對鹽酸帕洛諾司瓊相對響應因子分別為0.9和1.0，均為0.9～ 1.1，說明可以用鹽酸帕洛諾司瓊自身對照溶液代替鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構體作為對照溶液。

2.7.2對映異構體分別精密移取“2.4.2”中鹽酸帕洛諾司瓊對照品溶液、鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體對照品溶液各0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。分別取50 μL進樣，得出鹽酸帕洛諾司瓊線性范圍為0.000 125～ 0.000 752 mg/mL，回歸方程為：

A=108 906 199C-1 979.17，

相關系數(shù)為0.999 6；鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體線性范圍為0.000 124～ 0.000 743 mg/mL，回歸方程為：

A=109 708 146C-2 394.363，

相關系數(shù)為0.999 8。分別以鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體回歸方程的斜率除以鹽酸帕洛諾司瓊回歸方程的斜率，得到鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體對鹽酸帕洛諾司瓊相對響應因子為 1.0，處于0.9～ 1.1之間，說明可以用鹽酸帕洛諾司瓊自身對照溶液代替鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體為對照溶液。

2.8準確度

2.8.1非對映異構體取本品已測定非對映異構體的原料藥 1批（130901），加水制成每1 mL中含有0.6 mg鹽酸帕洛諾司瓊的溶液，分別精密移取 10 mL，置 100 mL量瓶中，共制備 9份，分別加入濃度為0.055 mg/mL的鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構體溶液各0.40，0.50，0.60 mL各3份，依法測定，平均回收率為96.3%，RSD為3.0%。

2.8.2對映異構體取本品已測定對映異構體的原料藥 1批（130901），加水制成每1 mL中含有0.6 mg鹽酸帕洛諾司瓊的溶液，分別精密移取10 mL，置100 mL量瓶中，共制備9份，分別加入濃度為0.048 5 mg/mL的鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構體溶液0.40，0.50，0.60 mL各3份；依法測定，平均回收率為95.7%，RSD為3.2%。

2.9樣品測定

本品 3批樣品（130901，130902，131001）非對映異構體測定結果分別為0.05%，0.05%，0.04%；對映異構體測定結果均未檢出。

3討論

據(jù)文獻報道［1]，鹽酸帕洛諾司瓊的合成路線有4條，無論采用哪條路線，均需測定本品光學異構體的含量。

文獻［2]已經報道了本文中非對映異構體測定方法的色譜條件，但是僅用于本品中有關物質的測定，沒有發(fā)現(xiàn)此色譜條件也可用于非對映異構體的測定。

目前，文獻［3-6]報道的測定鹽酸帕洛諾司瓊光學異構體的方法主要為正相色譜法，方法的檢測靈敏度與本法相比較差。

本方法快速、簡便，所用的色譜條件均為反相色譜條件，也可直接用于本品注射液中光學異構體的測定，無需因注射液輔料中含有大量無機鹽而進行前處理。

［1]楊新華，歐陽強.鹽酸帕洛諾司瓊合成路線圖解［J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（3）：231-233.

［2]沈曦，周慧，王萬青，等.反相高效液相色譜法檢測鹽酸帕洛諾司瓊及其有關物質［J].中國現(xiàn)代應用藥學，2007，24（4）：307-308.

［3]于曉蓉，宋敏，杭太俊.鹽酸帕洛諾司瓊光學異構體的手性HPLC檢查［J].中國新藥雜志，2008，17（10）：870-872.

［4]李霞，高媛，胥娜，等.手性拆分法同時測定鹽酸帕洛諾司瓊光學異構體［J].中南藥學，2015，13（4）：406-409.

［5]趙慧英，李桂萍，吳敬飛，等.鹽酸帕洛諾司瓊3個光學異構體的分離與測定［J].藥物分析雜志，2012，32（6）：978-980.

［6]潘紅娟，楊哲峰，時惠麟，等.鹽酸帕洛諾司瓊注射液中異構體含量的 NP-HPLC測定［J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（8）：610-612.

Determination of Isomers and Enantiomer in Palonosetron Hydrochloride by HPLC

Cao Tianhai（International GMP Certification Department，Kunming Jida Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yunnan Kunming 650106，China）

Objective：To develop a HPLC method for determination of isomers and enantiomer in palonosetron hydrochloride.Methods：Isomers were determined by a C18column with the mobile phase of 25 mmol/L sodium dihydrogen phosphate buffer（containing 0.1%triethylamine，of which pH value was adjusted to 4.0 by phosphoric acid）-acetonitrile（75∶25）.However，enantiomers were determined by a Chiralcel，OD-RH column with the mobile phase of 100 mmol potassium hexafluorophosphate solution-acetonitrile（70∶30）.The wavelengths for detection of isomers and enantiomers were 217 and 240 nm respectively.Results：The calibration curve of isomers and enantiomers of palonosetron hydrochloride showed good linearity，while the LOQ，LOD and accuracy met the relevant requirements.Conclusion：The developed methods was sensitive and reliable，which might be used for the quality control of isomers and enantiomer in palonosetron hydrochloride.

Palonosetron Hydrochloride；HPLC；Optical Isomer；Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.05.007

曹天海，男，碩士，工程師。主要從事藥物研發(fā)工作。E-mail：skyrin_jida@126.com

2016-02-14）