高效液相色譜法檢測(cè)苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體的含量

邱思婕，郭燕玲

（廣東先強(qiáng)藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510000）

苯甲酸阿格列?。╝logliptin benzoate）為絲氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，化學(xué)名為（R）-2- ［（6- （3-氨基哌啶 -1-基）-3-甲基 -2，4-二氧代 -3，4-二氫嘧啶 -1（2H）-基）甲基］芐腈苯甲酸，2010年4月首次在日本獲批上市［1-2］。該藥分子中含有手性中心，因此有必要建立對(duì)映異構(gòu)體的測(cè)定方法。為此，筆者建立了測(cè)定苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體的高效液相色譜法，方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便、靈敏度高，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），BT125D型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品（純度為99%，批號(hào)為121101S），苯甲酸阿格列汀對(duì)照品（純度為 99%，批號(hào)為 121101），苯甲酸阿格列?。ㄅ?hào)分別為121201，121202，121203）均由廣東先強(qiáng)藥業(yè)股份有限公司提供；正己烷、乙醇為色譜純，二乙胺為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Chiralcel OJ-H 手性柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：正己烷 -乙醇 -二乙胺（60∶40∶0.1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；流速：0.8mL /min；柱溫：25 ℃ ；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體50μg的溶液，即得對(duì)映異構(gòu)體貯備液。

精密量取對(duì)映異構(gòu)體貯備液適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體0.5μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

精密稱取苯甲酸阿格列汀適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀100μg的溶液，即得供試品溶液。

精密稱取苯甲酸阿格列汀對(duì)照品和苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀及其對(duì)映異構(gòu)體各20μg的溶液，即得系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20% 。精密吸取系統(tǒng)適用性溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。阿格列汀與對(duì)映異構(gòu)體的保留時(shí)間約為12 min和19min，分離度大于2.0，理論板數(shù)均大于2 500。

檢測(cè)限考察：精密量取對(duì)映異構(gòu)體貯備液，按倍比稀釋法稀釋，取稀釋后溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖。按信噪比S/N＝3計(jì)算，檢測(cè)限約為1.02 ng。

定量限考察：精密量取對(duì)映異構(gòu)體貯備液，按倍比稀釋法稀釋，取稀釋后溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖。按信噪比S/N＝10計(jì)算，定量限約為3.06 ng。

線性關(guān)系考察：精密稱取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成含阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體0.15，0.30，0.50，0.60，0.75μg/mL的溶液，分別進(jìn)樣20μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程為 Y＝143.35X+0.297 9，r2＝0.999 7（n＝5）。結(jié)果表明，對(duì)映異構(gòu)體質(zhì)量濃度在0.15～0.75μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

準(zhǔn)確度考察：取苯甲酸阿格列汀約13.6mg（未檢出對(duì)映異構(gòu)體），共9份，每3份分別加入對(duì)映異構(gòu)體貯備液0.8，1.0，1.2mL，用流動(dòng)相稀釋至100mL，搖勻。分別進(jìn)樣20μL，以外標(biāo)法計(jì)算加入量，結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品溶液，進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果對(duì)映異構(gòu)體峰面積的 RSD＝0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4 樣品檢測(cè)

取3批供試品，照2.1項(xiàng)下的方法配制供試品溶液、對(duì)照品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體含量。3批供試品中均未檢出對(duì)映異構(gòu)體。

表1 準(zhǔn)確度考察結(jié)果（n＝9）

3 討論

色譜柱的選擇：本試驗(yàn)采用2種色譜柱即Chiralpak IC和Chiralcel OJ-H手性柱對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行拆分。結(jié)果顯示，使用Chiralcel OJ-H手性柱時(shí)，保留時(shí)間較短，分離效果好，柱效較高，因此確定為本試驗(yàn)用色譜柱。該色譜柱的固定相為表面涂敷了手性多聚物（直鏈淀粉或纖維素衍生物）的球型硅膠，是目前通用性最廣的正相手性色譜柱之一。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：通過紫外光譜掃描，苯甲酸阿格列汀對(duì)映異構(gòu)體在225 nm和277 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但在277 nm波長(zhǎng)處苯甲酸吸收較強(qiáng)，故測(cè)定波長(zhǎng)定為225 nm。

流動(dòng)相的選擇：在試驗(yàn)過程中，通過調(diào)整正己烷-乙醇的比例，使阿格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體之間能達(dá)到分離要求。綜合考慮分析時(shí)間、柱壓、分離度等因素，最后確定為正己烷-乙醇（60∶40）。在此條件下，對(duì)二乙胺的濃度進(jìn)行考察，結(jié)果表明二乙胺的濃度對(duì)分離幾乎無(wú)影響，但可改善峰形、減小拖尾。因此，確定流動(dòng)相為正己烷-乙醇-二乙胺（60∶40∶0.1）。

參考文獻(xiàn)：

［1］王 珊，范 鳴 .抗 2型糖尿病藥物-Alogliptin［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2008，32（7）：326-327.

［2］張淑芳.治療糖尿病的新藥NESINA獲批在日本上市［J］.中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2010，12（6）：54.