藥用動(dòng)物烏梢蛇線粒體基因組全序列分析*

劉　杰，田曉軒，崔　英，朱　彥

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津　300193）

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·中藥研究·

藥用動(dòng)物烏梢蛇線粒體基因組全序列分析*

劉杰，田曉軒，崔英，朱彥

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津300193）

摘要：［目的］獲取藥用動(dòng)物烏梢蛇線粒體基因組全序列。［方法］采用Ion Torrent PGM技術(shù)，對(duì)烏梢蛇全基因組DNA進(jìn)行提取測(cè)序，采用MIRA方法從頭組裝方法和近緣種mapping方法進(jìn)行組裝拼接，應(yīng)用MITOS等方法進(jìn)行注釋。［結(jié)果］獲得17 162 bp烏梢蛇線粒體基因組全序列。其共編碼22個(gè)tRNA，13個(gè)蛋白編碼基因，2個(gè)rRNA （16S rRNA、12S rRNA）并有1個(gè)輕鏈（L鏈）復(fù)制起始區(qū)。［結(jié)論］獲取烏梢蛇線粒體基因組全序列，并可用于該藥用動(dòng)物的資源調(diào)查與保護(hù)研究。

關(guān)鍵詞：烏梢蛇；線粒體基因組；線粒體DNA；序列分析

烏梢蛇Ptyas dhumnades（Cantor，1842）在分類上屬于蛇亞目（Serpentes）游蛇科（Colubridae）游蛇亞科（Colubrinae）鼠蛇屬（Ptyas）。歷史上，其異名包括Zaocys dhumnad（Cope，1860），Ablabes vittatus（Duméril，Bibron&Duméril，1854）及Coluberdhumnades（Cantor，1842）等，后被歸入Ptyas屬［1-2］。本物種俗名中國(guó)鼠蛇（Chineseratsnake）、大眼鼠蛇（Big-eyedratsnake），或俗稱過(guò)山刀。該物種主要分布于中國(guó)，生存于海拔50～1 570 m的區(qū)域，在河北、河南、山西、陜西、甘肅、四川、湖北、湖南、江西、江蘇、福建、云南、貴州、廣東、廣西、臺(tái)灣等省份均有發(fā)現(xiàn)［3］。烏梢蛇屬無(wú)毒蛇類，其分類除去內(nèi)臟的干燥體，有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，常用于治療風(fēng)濕頑痹、抽搐痙攣、瘰癘惡瘡等癥［4］。其分類特征包括頭部鱗呈黑褐色，脊背聳立成屋脊?fàn)?，背鱗有端窩兩個(gè)，行數(shù)為偶數(shù)等［5-6］。近年來(lái)，基于CYTB及CO1基因序列以及高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的烏梢蛇分子鑒定方法也得到建立與應(yīng)用［7-9］。

動(dòng)物線粒體基因組包含了從分子序列到基因結(jié)構(gòu)的全面信息，其基因組成排列相對(duì)保守，具母系遺傳特征，且易于擴(kuò)增測(cè)序［10］，被廣泛用于動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育，以及種群保護(hù)等領(lǐng)域研究。蛇類的線粒體基因組編碼2個(gè)rRNA、22個(gè)左右的tRNA和13個(gè)蛋白，1～2個(gè)非編碼的控制區(qū)，并常包括1個(gè)輕鏈復(fù)制起始區(qū)。本文采用Ion torrent PGM二代測(cè)序技術(shù)［11］，獲得了烏梢蛇線粒體DNA全序列，此為國(guó)內(nèi)外有關(guān)鼠蛇屬動(dòng)物線粒體基因組的首次公開報(bào)道。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物烏梢蛇購(gòu)于福建福州，并經(jīng)形態(tài)學(xué)及CO1基因分子鑒定。取新鮮肌肉組織立即使用。Voucher ID為wss-1。

1.2總DNA提取參照經(jīng)典的酚氯仿抽提方法，獲得總基因組DNA，并經(jīng)A260/A280粗略估計(jì)濃度及純度。

1.3Ion Torrent PGM高通量測(cè)序

1.3.1鳥槍法建庫(kù)鳥槍法是指將目的DNA隨機(jī)打斷成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來(lái)的測(cè)序方法。

1.3.2OneTouch（油包水PCR） 每個(gè)微小磁珠通過(guò)接頭連接相應(yīng)的DNA片段，然后把含有DNA片段的磁珠和擴(kuò)增試劑的溶液注入礦物油中，形成了油包水的小體系，使得每個(gè)小水滴只含一個(gè)磁珠，每個(gè)小水滴就是一個(gè)微反應(yīng)體系。通過(guò)擴(kuò)增，DNA片段可以增加幾百萬(wàn)個(gè)拷貝，并且都連接在磁珠上。

1.3.3ES富集油包水PCR之后，加入Dynabeads? MyOneTM Streptavidn C1 beads，它通過(guò)親和素-生物素與帶有雙鏈模板的磁珠結(jié)合，最后加入氫氧化鈉（NaOH）使得雙鏈解鏈，制備單鏈模板。

1.3.4PGM上機(jī)測(cè)序?qū)в袉捂溎０宓拇胖?、測(cè)序引物、DNA聚合酶混勻，離心使其進(jìn)入318芯片的微孔中，然后上機(jī)測(cè)序。

1.4序列拼接從測(cè)序服務(wù)器上下載鳥槍法文庫(kù)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)至本地，預(yù)處理過(guò)濾掉低質(zhì)量序列、過(guò)短序列以及錯(cuò)誤序列，根據(jù)目的基因組大小（約16K bp），分割文件，調(diào)整合適的覆蓋倍數(shù)（基因組大小的20X為佳），使用MIRA 4.0進(jìn)行de novo拼接，結(jié)合近緣物種mapping組裝，經(jīng)反復(fù)迭代補(bǔ)全控制區(qū)（重復(fù)區(qū)）后，進(jìn)行最高質(zhì)量堿基合意，得到合意后的完整線粒體全基因組序列。

1.5注釋分析和提交使用MITOS server線粒體在線注釋系統(tǒng)［12］，對(duì)全序列進(jìn)行注釋，結(jié)合tRNAscan-SE 1.21軟件，進(jìn)行tRNA定位。以游蛇亞科Elaphe anomala，Elaphe bimaculata，Oligodon ningshaanensis 和Euprepiophis perlacea的線粒體基因組全序列為參照，對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA、rRNA及控制區(qū)等進(jìn)行注釋，L鏈復(fù)制起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)由RNA structure折疊生成。使用軟件MEGA 4.0及Bioedit等統(tǒng)計(jì)序列總長(zhǎng)、堿基組成和GC含量等。完整的烏梢蛇線粒體基因組全序列經(jīng)Sequin注釋后，提交GenBank，登錄號(hào)為KR812112。

2　結(jié)果

2.1序列拼接結(jié)果獲取烏梢蛇線粒體基因組后，經(jīng)bowtie2比對(duì)［13］，確認(rèn)共189 977條序列（reads）可拼接至該基因組，序列平均長(zhǎng)度214.4 bp，測(cè)序深度達(dá)1 958倍。

2.2整體結(jié)構(gòu)烏梢蛇線粒體基因組結(jié)構(gòu)見圖1、表1。與大多數(shù)脊椎動(dòng)物類似，烏梢蛇共編碼37個(gè)基因，包括了22個(gè)tRNA，13個(gè)蛋白編碼基因，2個(gè)rRNA（16S rRNA、12S rRNA）并有1個(gè)輕鏈（L鏈）復(fù)制起始區(qū)。其中除ND6和8個(gè)tRNA（Ala、Asn、Cys、Gln、Glu、Pro、Ser和Tyr）由L鏈編碼，其余28個(gè)基因均由重鏈（H鏈）編碼。其基因的排布順序與大部分游蛇類動(dòng)物相同。

圖1　烏梢蛇線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖

2.3堿基組成烏梢蛇線粒體基因組全長(zhǎng)17162bp，其中L鏈的堿基含量為：A=5 932 bp（34.6%），C=4 843 bp（28.2%），G=2 139 bp（12.5%），T=4 248 bp （24.8%），GC=6982bp（40.7%），A＞C＞T＞G，AT%＞GC%。且呈AT偏斜（0.165）和CG偏斜（0.387），這也與蛇類普遍情況相同。

表1　烏梢蛇線粒體基因組結(jié)構(gòu)

2.4蛋白編碼基因?yàn)跎疑呔€粒體基因組中蛋白編碼基因全長(zhǎng)11 267 bp，約占全基因組的65.65%。A=3 967 bp（35.2%），C=3 298 bp（29.3%），G=1 267 bp （11.2%），T=2 735 bp（24.3%），GC=4 565 bp（40.5%），A＞C＞T＞G，AT%＞GC%。所有蛋白編碼基因無(wú)內(nèi)含子。除ND1以ATA為起始密碼子，ND2和ND3以ATT起始，CO1以GTG起始外，其余均使用ATG為起始密碼子。除CO1以AGA為終止密碼子，ND5和ND6以TAG終止，其余蛋白均使用T或TA堿基終止，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中3’端的poly A補(bǔ)全，形成完整終止密碼子。氨基酸使用頻率的分析見表2。在一共3 747個(gè)氨基酸中，出現(xiàn)頻率較低的為Cys （0.77%）、Asp（1.52%）和Arg（1.65%），而頻率較高的為L(zhǎng)eu（14.87%）和Thr（12.09%）。

2.5rRNA和tRNA基因?yàn)跎疑叩?2S rRNA和16S rRNA長(zhǎng)度分別為921 bp和1 481 bp，GC含量分別為44.7%和40.2%。22個(gè)tRNA基因中，最短的為tRNA-Ser（anticodon=GCT，57 bp），最長(zhǎng)的為tRNA-Leu（anticodon=TAA，73 bp）。大部分tRNA可折疊成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)，但tRNA-Ser（anticodon= GCT）折疊后缺失D臂，tRNA-Cys缺失TΨC環(huán)，見圖2。

2.6非編碼區(qū)烏梢蛇的 1號(hào)控制區(qū)（control region 1）位于tRNA-Pro與tRNA-Phe之間，2號(hào)控制區(qū)（control region 2）位于tRNA-Ile與tRNA-Leu （anticodon=TAA）之間，長(zhǎng)度分別為1 025 bp和1 022 bp，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)兩者一致堿基為1 018 bp，一致率為99.5%。除控制區(qū)外，烏梢蛇線粒體基因組中有14 bp的6個(gè)非編碼間隔區(qū)域，其中最長(zhǎng)的間隔區(qū)為9 bp，位于ND6和tRNA-Glu之間，顯示該物種線粒體基因組結(jié)構(gòu)較為緊湊。

2.7L鏈復(fù)制起始區(qū)烏梢蛇基因組的L鏈復(fù)制起始區(qū)，長(zhǎng)度為33 bp，可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，見于圖2C。其中莖由9對(duì)堿基組成，環(huán)為11個(gè)堿基。

3　討論

線粒體全基因組測(cè)序方法，在以往多基于PCR技術(shù)［14］，該方法需根據(jù)目標(biāo)物種的近緣物種，設(shè)計(jì)合適引物，進(jìn)行普通PCR或Long-PCR（＞4 kb），并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或步移測(cè)序。而近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的成熟，測(cè)序成本的大幅下降，更多的目光集中在利用總基因組DNA測(cè)序結(jié)果，從中篩選拼接線粒體基因組序列［15-17］。本實(shí)驗(yàn)即采取后者策略，建立了基于高通量測(cè)序結(jié)果的線粒體基因組拼接工作流程。此方法可快速、低成本的得到目標(biāo)物種的高深度線粒體基因組，并避免PCR過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配可能。

表2　烏梢蛇線粒體基因組蛋白編碼基因氨基酸組成分析

圖2　tRNA-Ser（anticodon=GCT），tRNA-Cys及L鏈復(fù)制起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中，線粒體中蛋白編碼區(qū)以及tRNA區(qū)的結(jié)構(gòu)變化應(yīng)用較多。而另一方面，控制區(qū)（重復(fù)區(qū)）序列由于受進(jìn)化壓力較小，其堿基替換速率較快，這對(duì)藥用動(dòng)物的種下研究尤有意義。與其他真蛇類動(dòng)物類似，本研究同樣在結(jié)構(gòu)緊湊的線粒體基因組中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)控制區(qū)序列，其形成原因尚無(wú)定論。但已有研究發(fā)現(xiàn)，蛇類中這兩個(gè)控制區(qū)在同一物種內(nèi)相似度很高，而不同的物種間又有較大的分歧。這提示了其可能是協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果［18］。

中藥資源的研究是目前中藥研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，較多的工作集中在藥用植物上［19-20］，而動(dòng)物上開展較少。通過(guò)線粒體基因組數(shù)據(jù)的累積，研究以上雙控制區(qū)序列在種內(nèi)（種群間）的變化，也可作為研究藥用蛇類種群分化的分子標(biāo)記，為藥用蛇類的資源普查及保護(hù)提供參考。

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中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9043（2016）03-0187-05

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.10

收稿日期：（2016-02-24）

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202874）；高等教育博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20121210120006）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAI29B01）。

作者簡(jiǎn)介：劉杰（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。

通訊作者：朱彥，E-mail:yanzhu.harvard@gmail.com；田曉軒，E-mail:tian_xiaoxuan@tjutcm.edu.cn。

Analysis of mitochondrial genome of Ptyas dhumnades

LIU Jie，TIAN Xiao-xuan，CUI Ying，ZHU Yan
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract:［Objective］To investigate the complete mitochondrial genome of medical animal Ptyas dhumnades （Cantor，1842）.［Methods］The Ion Torrent PGM technique was chosed to sequence genomic DNA of Ptyas dhumnades，and then the strategy of de novo assembly and mapping versu mtgenome of closely related species by MIRA 4.0 was adopted to get the complete mitochondrial sequence.This genome was annotated by Online server MITOS etc.［Results］The 17 162 bp complete mitochondrial genome of Ptyas dhumnade with high coverage contains 22 transfer RNA，13 protein coding genes，2 ribosomal RNA genes and 1 putative L-strand replication origin. ［Conclusion］The mtgenome of Ptyas dhumnades was obtained，and could be furher applied in the resources survey and protection of this medical animal.

Key words:Ptyas dhumnades；mitochondrial genome；mitochondrial DNA；sequence analysis