HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定羌活酚酸和香豆素類成分含量*

楊　茜，宮美玲，李　晉，金　華，馬　琳，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193）

?

HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定羌活酚酸和香豆素類成分含量*

楊茜，宮美玲，李晉，金華，馬琳，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

摘要：［目的］建立同時(shí)測(cè)定羌活酚酸（新綠原酸、綠原酸和阿魏酸）和香豆素（羌活醇和異歐前胡素）兩類成分的高效液相色譜-紫外分析法（HPLC-UV），為羌活藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。［方法］Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量5 μL，流速1 mL/min。［結(jié)果］兩類成分具有良好的線性關(guān)系，方法學(xué)驗(yàn)證均符合要求。［結(jié)論］該方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于羌活藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：羌活；高效液相色譜-紫外分析法；含量測(cè)定

羌活，是傘形科植物羌活（裂葉羌活，Ntopterygium incisum Ting ex H.T.Chang）或?qū)捜~羌活（Notopterygium forbesii Boiss.）的干燥根莖及根［1］。味辛、苦，性溫。有散寒、祛風(fēng)、除濕和止痛功能。在臨床上有較廣泛的應(yīng)用，常用于治療風(fēng)寒感冒［2］、頭痛［3］、風(fēng)濕痹痛［4］、肩背酸痛［5］等癥。羌活的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類、酚酸和香豆素類成分［6］。現(xiàn)代研究表明羌活具有抗炎［7］、鎮(zhèn)痛解熱［7］、抗心律失常［8］、抗心肌缺血［9］和抗菌［10］等作用。研究發(fā)現(xiàn)綠原酸具有一定的抗內(nèi)毒素作用［11］，新綠原酸對(duì)補(bǔ)體激活具有顯著的抑制作用［12］，阿魏酸具有抗輻射、抗氧化和抗炎等作用［13-15］，羌活醇和異歐前胡素具有抗腫瘤作用［16-17］、舒張血管作用［18-19］和抗病毒活性［20］。因此，選擇上述5種成分為指標(biāo)，進(jìn)行質(zhì)量控制研究比選擇單一指標(biāo)羌活醇進(jìn)行質(zhì)量控制研究更符合羌活多成分協(xié)同發(fā)揮藥效作用特點(diǎn)，更能全面地、合理地評(píng)價(jià)羌活藥材質(zhì)量。

目前，盡管已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定羌活中阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素和苯乙基阿魏酸酯4種成分的含量測(cè)定的方法［21］，但未見羌活中新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇和異歐前胡素同時(shí)定量的分析方法。本研究擬建立測(cè)定羌活中兩類5種成分（新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇和異歐前胡素）同時(shí)定量的高效液相色譜-紫外分析法（HPLC-UV），并對(duì)不同產(chǎn)地裂葉羌活中含量進(jìn)行測(cè)定，比較不同產(chǎn)地裂葉羌活5種指標(biāo)性成分含量差異，為裂葉羌活羌活藥材的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。

1　儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2487雙波長(zhǎng)UV檢測(cè)器，Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。乙腈和甲醇均為色譜級(jí)，水為超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)），其余試劑均為分析級(jí)。實(shí)驗(yàn)所用其余儀器為超聲提取器，低溫離心機(jī)，十萬(wàn)分之一天平，萬(wàn)分之一天平，中藥粉碎機(jī)。新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品食品檢定所，純度均大于98%。16批次不同產(chǎn)地（四川、青海、甘肅、內(nèi)蒙古、安徽和山西）羌活樣品于秋季采收，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為裂葉羌活（Ntopterygium incisum Ting ex H.T.Chang）干燥根莖及根。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A），0.2%磷酸水（B）；梯度洗脫程序：0～2 min，12%～17% A；2～10 min，17%～17.5%A；10～12 min，17.5%～17.5%A；12～20 min，17.5%～18%A；20～22 min，18%～21%A；22～26 min，21%～24%A；26～28 min，24%～28%A；28～30 min，28%～30%A；30～33 min，30%～38%A；33～80 min，38%～38%A；80～82 min，38%～60%A；82～100 min，60%～60%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱定5.00 mg新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液。

2.3樣品溶液的制備精密稱取不同產(chǎn)地羌活粉末（60目）0.200 g，分別置于錐形瓶?jī)?nèi)，加10 mL 80%甲醇，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷至室溫后補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，將樣品溶液置于離心管中在14 000 r/min下離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性范圍將5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品母液配成適宜濃度的混標(biāo)溶液，然后將此混標(biāo)溶液稀釋至一系列濃度，分別進(jìn)樣5 μL分析，計(jì)算峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2精密度精密稱取同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項(xiàng)下的樣品制備方法制備樣品，在同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積均為5 μL，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的峰面積，分別計(jì)算5成分峰面積的RSD。

2.4.3重復(fù)性精密稱取6份同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項(xiàng)下的樣品制備方法制備6份樣品，在同一色譜條件下分別進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5 μL，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的峰面積，分別計(jì)算5成分峰面積的RSD。

2.4.4穩(wěn)定性精密稱取同一羌活（青海）樣品0.200 g，用2.3項(xiàng)下的樣品制備方法制備1份樣品，在同一色譜條件下，分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，分別計(jì)算5成分峰面積的RSD。

2.4.5加樣回收率精密稱定0.100 g羌活（青海）藥材粉末于10 mL內(nèi)，加入各成分含量與藥材中含量相近的已知量的標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)稱取3份，分別加80%甲醇定容、稱質(zhì)量，超聲30 min后取出放至室溫，補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，將樣品溶液置于離心管中14 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析，記錄各指標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算含量，求出各成分的加樣回收率。

3　結(jié)果

3.1羌活提取條件的優(yōu)化為充分提取出羌活中5種成分，本研究采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)羌活的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以化合物含量為指標(biāo)，選用L9（34）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采用三因素三水平考察了物料比、溶劑的比例、超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素-水平表見表1。

表1　提取因素-水平表

以新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素的質(zhì)量百分含量之和為指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析。直觀分析結(jié)果見表2。

表2　羌活提取實(shí)驗(yàn)直觀分析

通過(guò)直觀分析，發(fā)現(xiàn)影響羌活提取率的因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞溶劑比例＞物料比；確定最佳的提取條件為提取時(shí)間45 min，溶劑比例80%甲醇，物料比1∶50。

3.2方法學(xué)驗(yàn)證5個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)見表3，結(jié)果表明5個(gè)化合物線性關(guān)系良好。

表3　5個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各化合物峰面積的RSD均小于2%，表明儀器的精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各化合物峰面積的RSD均小于5%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各化合物峰面積的RSD均小于4%，表明羌活樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各成分的平均回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，見表5。

表4　精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）　%

表5　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.3含量測(cè)定將2.2和2.3項(xiàng)制備的樣品溶液與混合對(duì)照品溶液進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析，得到混合對(duì)照品溶液和羌活藥材（青海）的HPLC色譜圖，見圖1。

利用所建立分析方法對(duì)16批不同產(chǎn)地的羌活樣品溶液進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含量，結(jié)果見表6。

結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的羌活中，各指標(biāo)化合物的含量變化范圍較大，新綠原酸的含量范圍是0.03～0.29mg/g，綠原酸的含量范圍是0.13～2.98mg/g，阿魏酸的含量范圍是0.10～2.14 mg/g，羌活醇的含量范圍是0～6.32 mg/g，異歐前胡素的大致含量范圍是0.55～16.8 mg/g。

圖1　羌活藥材（1號(hào)）及混合對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖

表6　16批樣品中5個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果　mg/g

4　結(jié)論

不同產(chǎn)地的羌活藥材中酚酸和黃酮兩類成分的含量有顯著差異。表明中藥市場(chǎng)中羌活藥材的質(zhì)量差異較大，原因眾多，可能是由植物基源、生長(zhǎng)環(huán)境、采收加工等，儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)纫蛩卦斐傻摹Ｒ虼?，?duì)羌活藥材中的指標(biāo)成分的含量進(jìn)行控制必不可少。本研究以新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素等成分為指標(biāo)，建立對(duì)這兩類化合物同時(shí)定量的HPLC-UV分析方法，為羌活質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥出版社，2010:205.

［2］朱藝.九味羌活軟膠囊治療感冒（風(fēng)寒挾濕證）的臨床研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

［3］李銳，王蕓，劉大賓.九味羌活湯治療藥物性頭痛39例［J］.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2002，18（8）:12.

［4］李萬(wàn).不同體位牽引結(jié)合羌活勝濕湯治療神經(jīng)根型頸椎病（風(fēng)寒濕痹型）的臨床研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

［5］吳惠明.加味芍藥甘草湯與羌活勝湯治療頸椎病的療效觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2008，16（1）:23-24.

［6］張鵬，楊秀偉.羌活化學(xué)成分進(jìn)一步研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（24））:2918-2921.

［7］陳智煌，廖華軍，劉晨，等.羌活揮發(fā)油的GC-MS分析及其抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用初探［J］.海峽藥學(xué)，2015，27（8）: 20-23.

［8］路新強(qiáng)，胡燕，肖文彬.羌活提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性心律失常的保護(hù)作用［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1992（4）:272-274.

［9］武新華，王北香.自擬芎歸羌活人參湯治療冠心病心絞痛65例［J］.中醫(yī)藥研究，2002，18（2）:19.

［10］李嬈嬈.羌活中的2個(gè)抗菌活性成分［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：中醫(yī)中藥分冊(cè)，2003，25（5）:304.

［11］宋建華.金銀花解熱抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（25）:2552-2553.

［12］宋亞玲，王紅梅，倪付勇，等.金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究［J］.中草藥，2015，46（4）:490-495.

［13］趙文紅，鄧澤元，范亞葦，等.阿魏酸體外抗氧化作用研究［J］.食品科學(xué)，2010，29（1）:219-223.

［14］洪倩.阿魏酸抗輻射活性及其作用機(jī)制研究［D］.北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2012.

［15］吳建良，沈敏敏，楊水新，等.阿魏酸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（1）:97-102.

［16］Kleiner HE，Reed MJ，DiGiovanni J.Naturally occurring coumarins inhibit human cytochromes P450 and block benzo［a］pyrene and 7，12-dimethylbenz［a］anthracene DNA adduct formation in MCF-7 cells［J］.Chemical research in toxicology，2003，16（3）:415-422.

［17］張雪霞.羌活的抗腫瘤活性成分研究［D］.石家莊:河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2009.

［18］李振坤，劉玫琦，楊洪軍.傘形科辛味中藥主要化學(xué)成分對(duì)離體血管作用研究 ［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（1）: 38-40.

［19］Nie H，Meng L，Zhou J，et al.Imperatorin is responsible for the vasodilatation activity of Angelica dahurica var.formosana regulated by nitric oxide in an endothelium dependentmanner［J］.Chinese journalofintegrative medicine，2009，15:442-447.

［20］Tsassi VB，Hussain H，Meffo BY，et al.Antimicrobial coumarins from the stem bark of Afraegle paniculata［J］. Natural product communications，2010，5（4）:559-561.

［21］古麗娜·沙比爾，郭洪祝，郭慧，等.HPLC法測(cè)定羌活中阿魏酸、羌活醇、苯乙基阿魏酸酯和異歐前胡素［J］.中草藥，2006，37（6）:937-940.

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9043（2016）03-0192-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.11

收稿日期：（2016-02-05）

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目（81503213）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃資助（TD12-5033）。

作者簡(jiǎn)介：楊茜（1990-）女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。

通訊作者：常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com。

Simultaneous determination of phenolic acids and coumarins for quality control of Rhizoma et Radix Notopterygii.by HPLC-UV

YANG Xi，GONG Mei-ling，LI Jin，JIN Hua，MA Lin，CHANG Yan-xu
（Tianjin State Kay Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract:［Objective］An HPLC-UV method was established to simultaneously determine the content of phenolic acids（neochlorogenic acid，Chlorogenic acid，F(xiàn)erulic acid）and coumarins（Notopterol，Isoimperatorin）for the quality control of Rhizoma et Radix Notopterygii.［Methods］An Agilent Zorbax SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a guard column was used as the analytical column to separate the multi-ingredients.The mobile phase was acetonitrile and 0.2%（V/V）phosphoric acid solution.The flow rate was set at 1 mL/min.The injection volume was 5 μL and the eluent was measured at 330 nm.［Results］This method exhibited a good linear relationship，and the results of the method validation up to the requirements.［Conclusion］The established HPLC-UV assay could be used to determinate the content of Rhizoma et Radix Notopterygii for the quality control.

Key words:Rhizomaet Radix Notopterygii.；HPLC-UV；content determination