和營安心方抗炎及促進血管再生作用的研究*

賀　偉，李永民，張海霞，陳璽龍，蘇志遠

（河北北方學院，張家口　075029）

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和營安心方抗炎及促進血管再生作用的研究*

賀偉，李永民，張海霞，陳璽龍，蘇志遠

（河北北方學院，張家口075029）

摘要：［目的］研究和營安心方對老化大鼠心血管系統(tǒng)的保護作用。［方法］采用過氧化氫（H2O2）建立大鼠血管平滑肌細胞炎癥損傷模型，實驗分為5組，正常對照組、H2O2（200 μmol/L）模型組、和營安心方高、中、低劑量組，分別加入“和營安心方”提取物100、50、25 mg/L，24 h之后加入與模型組同濃度的H2O2（200 μmol/L），共同作用2 h，觀察血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量。以大鼠頸背部皮下注射125 mg/kg D-半乳糖建立大鼠老化模型，用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測大鼠腦組織及肝臟組織中一氧化氮合酶（NOS）及堿性成纖維因子（b-FGF）的表達，實驗分為6組，分別為正常組、模型組（D-半乳糖125 mg/kg）、和營安心方高劑量組（500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）、和營安心方中劑量組（250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）、和營安心方低劑量組（125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）及青年大鼠組。［結果］和營安心方能顯著性降低大鼠血管平滑肌細胞上清液中NO的含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實時熒光定量PCR法測定結果顯示，相對于模型組，和營安心方能顯著性降低大鼠腦組織和肝臟組織中NOS的表達，提高b-FGF在大鼠腦及肝臟組織中的表達（P＜0.01）。［結論］和營安心方對老化大鼠的心血管再生及抗炎等方面有一定程度的保護作用，提示和營安心方可能通過直接作用于腦及肝臟組織來發(fā)揮促進血管再生及抗炎的功效。

關鍵詞：和營安心方；血管平滑肌細胞；老化大鼠；心血管系統(tǒng)

依據《難經》“損其心者，調其營衛(wèi)”治則，自擬“和營安心方”，用于缺血性心臟病的治療，其具有“調和營衛(wèi)，活血利水”的功效。前期研究已經證實其具有一定的抗氧化、改善心功能、抑制心肌細胞凋亡、降低心肌缺血損傷等作用［1-2］。流行病學調查顯示，炎癥及心血管相關疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而由于老齡化造成的相關心血管疾病的發(fā)病率更高，已經成為危害人類健康的重大疾病。在炎癥過程中損傷因子可以直接或間接造成組織和細胞的破壞，從而影響人類健康。本實驗主要研究“和營安心方”對H2O2致大鼠血管平滑肌細胞炎癥損傷模型及老化大鼠心血管系統(tǒng)的保護作用，并進一步探討其作用機制，具有及其重要的意義。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑 “和營安心方”由桂枝、白芍、茯苓、西洋參、益母草等藥物組成，整個方劑共計500 g，用70%乙醇，按照料液比為1∶6的比例進行提取，每次提取1.5 h，共提取3次，收集3次的提取液，將提取液濃縮為浸膏得到93.5 g，提取率為18.7%。大鼠血管平滑肌細胞（VSMC，購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），DMEM-H液體培養(yǎng)基（Hyclone），新生胎牛血清（Gibco產品，美國），0.25%胰蛋白酶溶液（Dibco產品，美國），3%（W/W）過氧化氫（H2O2），（Sigma公司，美國），一氧化氮（NO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），引物合成（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），SD大鼠（3月齡和5周齡）由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證編號：0029985。

1.2主要儀器二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱（Thermo），HH-S6數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），倒置熒光顯微鏡（Olympus），ALLEGRA-64R高速離心機、DU-530紫外分光光度計（美國Beckman Coulter有限公司），F(xiàn)lex Station3多功能微孔板分析儀（美國Molecular Devices公司），ARKTIK基因擴增儀（Thermo），7300 Real-Time PCR system實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2　實驗方法

2.1血管平滑肌細胞的培養(yǎng)血管平滑肌細胞（VSMC）培養(yǎng)至80%～90%融合時，加消化液（0.25%胰酶含0.03%EDTA）1.5 mL，預洗倒掉，顯微鏡下觀察細胞基本脫離瓶壁分離成單個細胞時，加培養(yǎng)基吹洗混勻，按照1∶3傳代，每瓶加培養(yǎng)基6 mL，37℃5%CO2孵育箱培養(yǎng)。

2.1.1實驗分組將消化后的細胞按照6×105的密度接種于48孔板內進行培養(yǎng)。組別分別為：1）正常培養(yǎng)的血管平滑肌細胞即正常對照組。2）血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中添加終濃度為200 μmol/L的H2O2作用2 h即炎癥損傷模型組。3）血管平滑肌細胞分別用高、中、低3種劑量濃度的和營安心方乙醇提取物（100、50、25 mg/L）培養(yǎng)24 h后，添加終濃度200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。最終收集血管平滑肌細胞及培養(yǎng)上清液用于實驗。

2.1.2NO含量測定通過NO檢測試劑盒測定培養(yǎng)介質中炎癥因子NO（單位：μmol/L）的含量，評價和營安心方對大鼠血管平滑肌細胞的保護作用，測定采用紫外分光光度法。

2.2實時熒光定量PCR法測定實驗大鼠腦組織及肝臟組織中一氧化氮合酶（NOS）、堿性成纖維因子（b-FGF）的表達取40只體質量220～240 g雄性SD大鼠（3月齡）及8只青年SD大鼠（5周齡）適應性喂養(yǎng)1周，老齡大鼠按隨機數字表法隨機分為5組，每組8只，分別為正常組、模型組（D-半乳糖125 mg/kg頸背部皮下注射，造成老化鼠模型［3］）、和營安心方高劑量組（500mg/kg+D-半乳糖125mg/kg）、和營安心方中劑量組（250mg/kg+D-半乳糖125mg/kg）、和營安心方低劑量組（125mg/kg+D-半乳糖125mg/kg），8只青年大鼠為青年組，其中正常組及青年組灌服等容積的5%阿拉伯膠，每組給藥劑量均為100 mL/kg，共給藥及造模42 d，實驗前禁食不禁水18 h，第42天給藥后，將各組大鼠斷頭處死，立即取腦、肝臟等組織，置于-80℃保存。

2.2.1抽提總RNA及cDNA合成用Trizol抽提總RNA：取組織100 mg左右置于經高溫滅菌的研缽中，在研缽中加入1 mL Trizol進行裂解研磨，隨之加入適量液氮于研缽進行反復研磨，至組織完全溶解，裂解液透明，轉入Eppendorf管。4℃12 000 g離心5 min，取上清，轉入一個新的Eppendorf管中，去除不溶物等。加入0.2 mL氯仿，渦旋混合，使溶液充分乳化，室溫放置3min。4℃12000g離心15min，樣品分成3層，上清水相轉移到新管中。加入與上清相同體積的異丙醇混勻，室溫放置5～10 min。4℃12 000 g離心10 min棄上清，白色或淡黃色RNA沉于管底。加1 mL 75%乙醇，振蕩離心管，懸浮洗滌沉淀。4℃8 000 g離心5 min，棄去上清。真空干燥后溶于10 μL無RNA酶水。用紫外分光光度計測定總RNA濃度及A260 nm/A280 nm比值，測定RNA純度。按High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明進行反轉錄，合成cDNA。

2.2.2引物設計及合成根據美國國家生物技術信息中心（NCBI）公布的大鼠基因序列，設計上下游引物。見表1。

表1　基因序列

2.3統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　實驗結果

3.1細胞培養(yǎng)液中NO含量測定結果見表2，和營安心方高、中、低劑量組均能很好的降低造模后的血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中NO的含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.2實時熒光定量PCR測定實驗大鼠腦及肝臟組織中NOS、b-FGF的表達結果見表3、表4。與模型組比較，和營安心方高劑量組（P＜0.05）、中劑量組（P＜0.01）能夠降低大鼠腦組織中NOS的表達，和營安心方高劑量（P＜0.01）、低劑量組（P＜0.05）能夠降低大鼠肝臟組織中NOS的表達。和營安心方中劑量、低劑量組能夠顯著性提高b-FGF在大鼠腦組織中的表達，和營安心方高劑量（P＜0.05）、中劑量組（P＜0.01）能夠顯著性提高b-FGF在大鼠肝臟組織中的表達。

表2　細胞培養(yǎng)液中NO含量（±s）

表2　細胞培養(yǎng)液中NO含量（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.05；與正常組比較，##P＜0.05。

組別正常組模型組和營安心方（高劑量）和營安心方（中劑量）和營安心方（低劑量）n　6 6 6 6 6劑量　NO（μmol/L）-4.93±0.70 200 μmol/L H2O2　14.07±0.47##100 mg/L+200 μmol/L H2O2　5.30±0.41** 50 mg/L+200 μmol/L H2O2　9.85±0.57** 25 mg/L+200 μmol/L H2O2　6.65±0.55**

4　討論

《內經》在闡述“營衛(wèi)致病”時提出了“營氣衰少而衛(wèi)氣內伐”，和“營氣稽留，血澀不行，衛(wèi)氣從之”的病機，據此提出了慢性心力衰竭的中醫(yī)病機假說為“營衛(wèi)不和，營澀衛(wèi)伐，淤結水?！?，并擬定“和營安心方”，本方由西洋參、玉竹、桂枝、白芍、茯苓等組成。西洋參、玉竹益氣生津，充養(yǎng)營氣，益營和陰；桂枝、茯苓疏衛(wèi)通陽，活血化瘀，利水寧心。全方補氣生津，益營通衛(wèi)，調和營衛(wèi)，活血利水?，F(xiàn)代藥理研究表明，西洋參、玉竹、桂枝等都具有一定的抗氧化、抗炎、強心、提高免疫力等功效?！昂蜖I安心方”具有抗氧化、改善心功能、抑制心肌細胞凋亡、降低心肌缺血損傷等作用，H2O2是極強的氧化劑，是體內氧化代謝的中間產物，H2O2很容易穿透細胞膜到達胞內位點，如果H2O2的積累對細胞產生細胞毒性，將會對機體造成及其嚴重的后果。在本實驗中用低濃度（200 μmol/L）H2O2模擬炎癥損傷狀態(tài)，以造成血管平滑肌細胞炎癥損傷，進而來觀察“和營安心方”對血管平滑肌細胞的影響作用，從而推測其對心血管系統(tǒng)的影響［4］。

NO是一個很重要的炎癥因子，在炎癥部位，NO作用于細胞，可使其cGMP水平顯著升高，使血管舒張，通透性增高，利于炎癥介質到達作用部位［5-7］。在多種炎癥性或免疫性的動物實驗模型中，NO濃度顯著增高，抑制NO合成可使典型的炎癥癥狀得到改善，因此本實驗以細胞上清液中NO的含量作為炎癥損傷程度的檢測指標，更能夠準確的反映“和營安心方”對H2O2致大鼠血管平滑肌細胞炎癥損傷的保護作用。

NOS作為NO合成的關鍵酶，可分為3種類型：神經元型（nNOS）、內皮型（eNOS）和誘導型（iNOS），前兩者的激活依賴于鈣離子和鈣調蛋白的作用，iNOS可由炎癥因子、內毒素等誘導激活。大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg）造成的老化大鼠模型，能夠全面模擬老化大鼠的生理狀態(tài)，老化狀態(tài)會造成一定程度的炎癥反應，進而促使NO含量升高，本實驗以合成NO的NOS為檢測指標，探索“和營安心方”對老化大鼠的保護作用。

表3　腦、肝臟組織中NOS基因的表達（±s）

表3　腦、肝臟組織中NOS基因的表達（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別正常組（3月齡）模型組青年組（5周齡）和營安心方（高劑量）和營安心方（中劑量）和營安心方（低劑量）n　8 8 8 8 8 8劑量　NOS（腦）　NOS（肝臟）5%阿拉伯膠　0.52±0.05**　0.47±0.07* D-半乳糖125 mg/kg　1.30±0.23##　0.72±0.10#5%阿拉伯膠　0.68±0.18**　0.63±0.06#500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　0.44±0.05**　0.47±0.06* 250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　0.86±0.09*　0.82±0.15##125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.12±0.06#　0.41±0.02**#

表4　腦、肝臟組織中b-FGF基因的表達（±s）

表4　腦、肝臟組織中b-FGF基因的表達（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別正常組（3月齡）模型組青年組（5周齡）和營安心方（高劑量）和營安心方（中劑量）和營安心方（低劑量）n　8 8 8 8 8 8劑量　b-FGF（腦）　b-FGF（肝臟）5%阿拉伯膠　2.15±0.25**　1.07±0.14** D-半乳糖125 mg/kg　0.46±0.10##　0.19±0.02##5%阿拉伯膠　1.08±0.06##　0.62±0.09*##500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.12±0.23##　1.16±0.20** 250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.51±0.24*　0.67±0.13*##125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.45±0.08*#　0.35±0.05##

b-FGF屬于FGF家族，是一種廣譜的促神經生長因子和促神經細胞分裂因子，其廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經系統(tǒng)內，可刺激成纖維細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞的生長，促進血管新生，對維護中樞神經系統(tǒng)正常功能起重要作用［8］，實驗中以b-FGF為指標檢測“和營安心方”對老化大鼠血管再生的影響作用。

實驗結果顯示，和營安心方高、中、低劑量組均能顯著性降低由200 μmol/L H2O2所造成的大鼠血管平滑肌細胞上清液中NO含量的升高，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）；NOS是合成NO的一種關鍵酶，其含量的高低直接會影響到NO的含量，實時熒光定量PCR結果顯示，和營安心方能夠一定程度上降低大鼠腦及肝臟組織中NOS的表達，對比于模型組有顯著性差異。b-FGF是評價血管新生的一個很好的檢測指標，其能很好的刺激血管新生及血管平滑肌細胞的生長，檢測結果顯示，對比于模型組，和營安心方能夠一定程度上顯著性升高大鼠腦及肝臟組織中b-FGF的表達。和營安心方正是由于這些作用的體現(xiàn)來實現(xiàn)其對炎癥損傷的保護作用及對血管再生的促進作用，提示“和營安心方”可能通過直接作用于腦及肝臟組織來發(fā)揮其抗炎及促進血管再生的作用。

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中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9043（2016）03-0176-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.08

收稿日期：（2016-02-17）

*基金項目：河北北方學院創(chuàng)新人才培育基金課題（CXRC1319）。

作者簡介：賀偉（1985-），女，碩士，講師，主要從事中藥藥理、中藥化學研究工作。

通訊作者：李永民，E-mail:liyongmin2001@sina.com。

Protective effect of Heying Anxin formula on anti-inflammatory and promoting angiogenesis

HE Wei，LI Yong-min，ZHANG Hai-xia，CHEN Xi-long，SU Zhi-yuan
（Hebei North University，Zhangjiakou 075029，China）

Abstract:［Objective］To investigate protective effects and mechanisms of Heying Anxin formula on the cardiovascular system of aging rats.［Methods］Rat vascular smooth muscle cells were incubated by H2O2（200 μmol/L）for 2 h as inflammation model group，same dose of H2O2was administered 2 h after treatment with Heying An xin formula（100 μg/mL，50 μg/mL，25 μg/mL）as therapeutic group and incubated for another 24 h，content of NO were measured.Subcutaneous injection in neck and back of D-galactose（125 mg/kg）to establish aging rats model.Model group:D-galactose（125 mg/kg），Heying Anxin formula（500 mg/kg+D-galactose 125 mg/kg，250 mg/kg+D-galactose 125 mg/kg、125mg/kg+D-galactose 125 mg/kg）as treating groups，as well as normal group and young group.The RTPCR technique was used to measure the expression of relevant genes，such as nitrous oxide system（NOS）and basic fibroblast growth factor（b-FGF）in the tissues of brain and liver.［Results］Heying Anxin formula can significantly decrease the content of NO（P＜0.05 vs control group），also compared with that of control group，He ying Anxin formula can significantly decrease NOS expression and enhance b-FGF expression in rats brain and liver tissues （P＜0.01）.［Conclusion］Heying Anxin formula has greatly protective effects on anti-inflammatory and cardiovascular regeneration of aging rats，and it may be take effect by the brain and liver.

Key words:Heying Anxin formula；vascular smooth muscle cells；aging rats；cardiovascular system