一種改良的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體活性化合物高內(nèi)涵篩選方法*

劉艷庭，應(yīng)樹(shù)松，武藝靜，董鵬志，吳紅華，徐硯通

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津　300457）

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一種改良的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體活性化合物高內(nèi)涵篩選方法*

劉艷庭1，2，應(yīng)樹(shù)松1，2，武藝靜1，2，董鵬志1，2，吳紅華1，2，徐硯通1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

摘要：［目的］建立一種改良的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）活性化合物高內(nèi)涵篩選（HCS）方法，包括構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT細(xì)胞株和優(yōu)化SERT活性化合物HCS條件。［方法］應(yīng)用聚乙烯亞胺（PEI）將質(zhì)粒hSERT-pcDNA3轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，采用遺傳霉素（G418）篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）和蛋白免疫印跡（Western blotting）方法分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗(yàn)證hSERT表達(dá)，采用SERT熒光底物4-（4-二甲氨基）苯基-1-甲基吡啶（APP+）在高內(nèi)涵系統(tǒng)上驗(yàn)證SERT攝取功能并優(yōu)化其檢測(cè)條件，應(yīng)用選擇性SERT抑制劑Fluoxetine和SERT增強(qiáng)劑Tianeptine驗(yàn)證SERT HCS方法可靠性。［結(jié)果］經(jīng)PEI轉(zhuǎn)染和G418篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞株。與HEK293細(xì)胞相比，hSERT-HEK293細(xì)胞中hSERT mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著性增加，APP+攝取實(shí)驗(yàn)表明hSERT-HEK293細(xì)胞攝取APP+顯著性增加，并可被Fluoxetine特異性抑制。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了高內(nèi)涵檢測(cè)APP+攝取實(shí)驗(yàn)中APP+濃度、孵育時(shí)間、數(shù)據(jù)分析方法等條件。Fluoxetine顯著地抑制hSERT-HEK293對(duì)APP+的攝取，Tianeptine顯著地增強(qiáng)hSERT-HEK293對(duì)APP+的攝取，證實(shí)此HCS方法的可靠性。［結(jié)論］本研究首次優(yōu)化了應(yīng)用APP+檢測(cè)SERT活性的HCS條件，顯著提高了SERT熒光檢測(cè)方法靈敏度，并首次證實(shí)此HCS方法適用于SERT促進(jìn)劑篩選，因此，建立了一種改良的SERT活性化合物HCS方法。

關(guān)鍵詞：5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；APP+；hSERT-HEK293細(xì)胞系；高內(nèi)涵篩選

5-羥色胺（5-HT）是一種高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)分子，化學(xué)性質(zhì)屬于吲哚胺，主要存在于大腦和消化道中，在運(yùn)動(dòng)、睡眠、攝食、生殖、認(rèn)知以及情感等生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［1］。在生理?xiàng)l件下，5-HT發(fā)揮作用后需要及時(shí)清除或滅活，以免產(chǎn)生中毒反應(yīng)及5-HT受體脫敏現(xiàn)象，其中5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）在5-HT清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。SERT是一種對(duì)5-HT具有高度親和力的Na+-Cl-依賴(lài)性神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，廣泛分布在大腦邊緣系統(tǒng)、胃腸道嗜鉻細(xì)胞膜、肥大細(xì)胞和五羥色胺能神經(jīng)突觸前膜上，SERT將細(xì)胞間的5-HT重?cái)z取入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)控制5-HT量及其與5-HT受體作用時(shí)間實(shí)現(xiàn)對(duì)信息傳遞精細(xì)調(diào)控［3］。研究表明，SERT在維持神經(jīng)、精神和心理功能正常中發(fā)揮重要作用，腦內(nèi)5-HT系統(tǒng)功能失調(diào)可導(dǎo)致強(qiáng)迫、抑郁、焦慮、驚恐等精神疾患，而且SERT功能異常與藥物成癮性密切相關(guān)［4-6］。在消化道中，SERT功能異?？蓪?dǎo)致胃腸道動(dòng)力及分泌功能異常，內(nèi)臟敏感性提高，與慢性便秘、腹瀉、腸道易激綜合征（IBS）及功能性消化不良等胃腸道功能性疾病密切相關(guān)［7-12］。因此，研發(fā)SERT活性新藥對(duì)治療神經(jīng)精神疾病和胃腸道功能性疾病具有重要意義。

傳統(tǒng)SERT活性藥物篩選方法采用了放射性同位素標(biāo)記技術(shù)［13-17］。為了考察化合物對(duì)SERT親和力，放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用3H標(biāo)記選擇性SERT抑制劑（SSRI）如Fluoxetine、Citalopram等，應(yīng)用液體閃爍技術(shù)考察待測(cè)化合物與3H標(biāo)記SSRI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SERT能力；為了考察化合物對(duì)SERT攝取功能影響，采用3H標(biāo)記5-HT作為SERT攝取底物，檢測(cè)待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞/神經(jīng)突觸體SERT攝取3H標(biāo)記5-HT能力影響。放射性同位素標(biāo)記方法有其優(yōu)越性，如3H標(biāo)記對(duì)化合物自身結(jié)構(gòu)和生物活性影響小，利于準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)SERT蛋白親和力和對(duì)SERT攝取5-HT功能影響，但使用放射性元素具有很多不足，包括生物危害、環(huán)境污染、實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻、放射性廢料處理費(fèi)用高昂等，導(dǎo)致在高通量藥物篩選應(yīng)用方面受到很多限制，因此有必要發(fā)展安全可靠的SERT活性藥物篩選方法。

熒光檢測(cè)是放射性同位素標(biāo)記的常見(jiàn)替代方法，目前已報(bào)道了應(yīng)用熒光檢測(cè)SERT攝取功能的方法。熒光檢測(cè)方法雖然靈敏度比放射性同位素低，但是它不僅可以觀(guān)察SERT對(duì)熒光底物轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)過(guò)程，而且適用于高通量化合物篩選，屬于SERT活性化合物發(fā)現(xiàn)的重要方法?，F(xiàn)有SERT攝取功能熒光檢測(cè)方法包括：一是采用MDS Analytical Technologies公司神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取試劑盒在酶標(biāo)儀FLIPRTETRA上檢測(cè)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，此方法通用于SERT、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（NET），由于酶標(biāo)儀檢測(cè)不能區(qū)分胞內(nèi)、外熒光染料，試劑盒采用了細(xì)胞膜不通透染料來(lái)遮蓋胞外熒光染料以降低背景干擾信號(hào)；二是采用熒光分子4-［4-（dimethylamino）-styrl］-N-methylpyridinium（ASP+）作為底物在高內(nèi)涵系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)展了NET和DAT高內(nèi)涵檢測(cè)方法［18-19］，高內(nèi)涵方法基于細(xì)胞影像信息考察細(xì)胞功能改變，能夠直觀(guān)便捷地確定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度并且可以觀(guān)察SERT對(duì)APP+轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)過(guò)程。

由于SERT對(duì)ASP+轉(zhuǎn)運(yùn)效率低，導(dǎo)致SERT高內(nèi)涵檢測(cè)方法應(yīng)用受到限制。近年新合成了熒光染料4-［4-（dimethylamino）phenyl］-1-methylpyridinium （APP+），實(shí)驗(yàn)證實(shí)SERT對(duì)APP+轉(zhuǎn)運(yùn)效力比ASP+強(qiáng)數(shù)倍，電生理研究發(fā)現(xiàn)APP+屬于SERT底物，但ASP+屬于SERT抑制劑，且APP+對(duì)細(xì)胞膜不著色，進(jìn)一步提高了細(xì)胞內(nèi)熒光特異性，可見(jiàn)APP+在SERT活性檢測(cè)方面明顯優(yōu)于A(yíng)SP+［16］，但至今尚未見(jiàn)應(yīng)用APP+熒光染料優(yōu)化高內(nèi)涵系統(tǒng)篩選SERT活性化合物的報(bào)道，本研究從構(gòu)建hSERT-HEK293細(xì)胞株入手，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化APP+在高內(nèi)涵系統(tǒng)檢測(cè)條件，為發(fā)現(xiàn)SERT活性化合物提供工具。

1　材料與方法

1.1材料HEK293細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）、hSERT-pcDNA3（Addgene公司，15483）見(jiàn)圖1。LB培養(yǎng)基（生物生工公司，SD7002）、大提質(zhì)粒試劑盒（Transgene公司，H10105）、PEI（Polysciences，23966-2）、G418（Merck Millipore公司，D00117999）、Anti-SERT antibody和Anti-Tubulin antibody（Abcam公司）、Super Signal WestPico化學(xué)發(fā)光底物（Thermo公司）、RT-PCR試劑盒和 Faststart Universal SYBR Green Master為Roche公司產(chǎn)品、MEM培養(yǎng)基（41500034）和胎牛血清（10099-141）為Gibco公司產(chǎn)品，Trizol、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均為碧云天公司產(chǎn)品，Ampicillin、APP+、Fluoxetine、D-多聚賴(lài)氨酸、Tianeptine均為Sigma公司產(chǎn)品。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar 3925）美國(guó)Corning公司。

圖1　hSERT-pcDNA質(zhì)粒圖譜

1.2hSERT-pcDNA3質(zhì)粒的提取選取含有質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)菌接種到含有Ampicillin的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃、220 rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)。吸取100 μL菌液，涂布到含有Ampicillin的固體LB培養(yǎng)上，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種到含有Ampicillin的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，采用大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3質(zhì)粒的測(cè)序?qū)⒑心康幕虻腄H5α菌液送由生物生工公司以T7和BGH為引物測(cè)序，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物：CTGGGGCAAGAAGGTGGATT，下游引物：CCAGTGCGAGCTCCATGTAA，引物由上海生物生工公司合成。

1.4建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞系

1.4.1HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)為了確定G418最佳篩選濃度，將HEK293細(xì)胞與濃度在0～1 200 mg/L 間G418共培養(yǎng)，每3～4 d更換培養(yǎng)基，14～15 d后導(dǎo)致HEK293完全死亡的最低G418濃度為篩選用最佳濃度［20-21］。

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照PEI試劑轉(zhuǎn)染法操作，在HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染（PEI體積∶DNA質(zhì)量=3∶1）4～6h后，將轉(zhuǎn)染試劑換成MEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h后，換用含800mg/LG418 的MEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3 d更換培養(yǎng)基，經(jīng)14～15 d篩選后換成含400 mg/L G418的MEM完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)［22-23］。

1.4.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系hSERT mRNA表達(dá)的鑒定采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）方法驗(yàn)證hSERT mRNA表達(dá)，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定RNA濃度，RNA純度判斷依據(jù)A260/280比值在1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶明亮清晰且28S條帶亮度在18S條帶的兩倍以上，電泳無(wú)拖尾現(xiàn)象。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作獲取cDNA，然后進(jìn)行Realtime PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系包括：cDNA模板1μL，上下游引物各1.25 μL（hSERT fwd:CTGGGGCAAGAAGGTGGATT，hSERT rev：CCAGTGCGAGCTCCATGTAA；GAPDH fwd：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，GAPDH rev:TGAGCGATGTGGCTCGGCT）Supermix 12.5 μL，RNase-free water 9.0 μL。反應(yīng)程序設(shè)定：95℃3 min預(yù)變性，95℃30 s變性，60℃40 s退火，72℃40 s延伸，共42個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)條件設(shè)定：95℃10 s，65℃5 s，95℃。采ΔΔCt法分析Real-time實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞系hSERT蛋白表達(dá)的鑒定采用蛋白免疫印跡（Western blotting）方法驗(yàn)證hSERT蛋白表達(dá)，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。Western blotting遵循常規(guī)程序操作，其中抗體稀釋倍數(shù)分別為：SERT抗體（1∶2 500），Tubulin抗體（1∶4 000），二抗均采用羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000），使用ECL檢測(cè)試劑盒顯色，在暗室曝光顯影，采用Image J軟件對(duì)掃描后顯影條帶進(jìn)行光密度值分析，計(jì)算SERT/Tubulin蛋白光密度值的比值，并對(duì)HEK293細(xì)胞組值進(jìn)行均一化后表示。

1.4.4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系hSERT功能的驗(yàn)證為了驗(yàn)證hSERT-HEK293細(xì)胞SERT攝取功能并優(yōu)化APP+攝取高內(nèi)涵檢測(cè)條件，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照HEK293細(xì)胞接種至96孔板培養(yǎng)24 h，細(xì)胞同步化培養(yǎng)12～16 h，棄除培養(yǎng)基后加入0、1、2、5、10、20、30、40 μmol/L熒光染料APP+，避光孵育20 min，洗去APP+加入1 μg/L Hoechst 33342染色細(xì)胞核，在37℃避光孵育20 min，采用Krebs Ringers HEPES （KRH）緩沖液（130 mmol/L NaCl，1.3 mmol/L KCl，2.2 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L HEPES，1.8 g/L葡萄糖pH 7.3）洗去染料進(jìn)行高內(nèi)涵檢測(cè)，熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

表1　熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)　nm

1.5Fluoxetine和Tianeptine對(duì)hSERT-HEK293細(xì)胞重?cái)z取功能的影響為了驗(yàn)證SERT高內(nèi)涵篩選（HCS）方法的可靠性，分別采用選擇性SERT抑制劑（SSRI）Fluoxetine和SERT增強(qiáng)劑（SSRE）Tianeptine進(jìn)行驗(yàn)證。hSERT-HEK293細(xì)胞培養(yǎng)24 h后同步化12～16 h，棄除培養(yǎng)基加入Fluoxetine 10.0、2.0、1.0、0.1、0.01、0.001 μmol/L或Tianeptine 20.0，10.0，1.0，0.1，0.01，0.001 μmol/L在37℃孵育2 h，加入終濃度為2 μmol/L APP+輕輕混勻，避光孵育20 min，棄除反應(yīng)液，加入終濃度為1 μg/L Hoechst 33342在37℃避光孵育20 min，KRH洗去染料進(jìn)行高內(nèi)涵檢測(cè)。

1.6數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中Western blotting實(shí)驗(yàn)hSERT蛋白表達(dá)量結(jié)果采用兩獨(dú)立樣本T-tert檢驗(yàn)，hSERT功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnett’s Multiple Comparison Test進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean±S.E.M表示。

2　結(jié)果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞系的獲得質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GeneBank比對(duì)表明，目的基因SERT序列與Human Na+/Cl-dependent serotonin transporter mRNA，complete cds，L05568.1一致，說(shuō)明該質(zhì)?？梢杂糜诩?xì)胞轉(zhuǎn)染。G418濃度篩選結(jié)果顯示在800～1 200 mg/L條件下HEK293細(xì)胞全部死亡，表明HEK293細(xì)胞的G418最佳篩選濃度為800 mg/L，用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G418維持濃度為400 mg/L。經(jīng)PEI轉(zhuǎn)染和G418篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hSERTHEK293細(xì)胞系。

2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系hSERT mRNA和蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證Real-time PCR結(jié)果經(jīng)ΔΔCt法分析顯示hSERT-HEK293細(xì)胞（Ct=27.12±0.16）比HEK293細(xì)胞（Ct=38.38±0.87）hSERT表達(dá)量提高了約5 422倍（n=3）。Western blotting結(jié)果證實(shí)hSERT蛋白表達(dá)量在hSERT-HEK293細(xì)胞系比未轉(zhuǎn)染HEK293顯著增加，見(jiàn)圖2。

圖2　hSERT蛋白在轉(zhuǎn)染/未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)（n=3）

2.3hSERT-HEK293細(xì)胞對(duì)APP+攝取功能驗(yàn)證及HCS條件優(yōu)化APP+攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí) hSERTHEK293細(xì)胞具有SERT轉(zhuǎn)運(yùn)功能，且隨APP+濃度增高呈飽和趨勢(shì)；在相同條件下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光強(qiáng)度比HEK293細(xì)胞顯著增高，見(jiàn)圖3。Fluoxetine 2.0 μmol/L顯著降低了hSERT-HEK293胞內(nèi)APP+熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖4，證實(shí)hSERT攝取APP+具有特異性，以上結(jié)果從功能學(xué)角度驗(yàn)證了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞系的質(zhì)量。

為了優(yōu)化hSERT-HEK293細(xì)胞攝取APP+活性HCS條件，首先考察了 APP+濃度對(duì) hSERTHEK293細(xì)胞染色效果的影響，結(jié)果顯示APP+為1.0 μmol/L時(shí)，hSERT-HEK293細(xì)胞熒光強(qiáng)度已經(jīng)比HEK293細(xì)胞顯著增高，在A(yíng)PP+為2.0 μmol/L時(shí)，兩者間差異最大，隨著APP+增高至10 μmol/L，兩種細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均趨向飽和，見(jiàn)圖3。為了盡量降低干擾熒光同時(shí)獲得較高特異熒光信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示APP+2.0 μmol/L可作為HCS優(yōu)化濃度。

圖3　hSERT-HEK293和HEK293對(duì)APP+攝取效率

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，APP+熒光強(qiáng)度對(duì)溫度具有明顯依賴(lài)性，在37℃孵育后胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最高，因此HCS優(yōu)化條件選擇在37℃孵育。為了優(yōu)化APP+孵育時(shí)間，在37℃條件下比較了2.0 μmol/L APP+在10～40 min內(nèi)hSERT-HEK293胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示20 min孵育時(shí)間能夠達(dá)到胞內(nèi)熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)態(tài)，為了實(shí)驗(yàn)節(jié)省時(shí)間，因此HCS優(yōu)化條件選擇20 min作為APP+孵育時(shí)間。

圖4　hSERT攝取APP+功能特異性驗(yàn)證

2.4應(yīng)用陽(yáng)性藥物驗(yàn)證SERT HCS方法的可靠性為了考察SERT HCS方法可靠性，應(yīng)用SSRI Fluoxetine和SSRE Tianeptine作為工具藥進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Fluoxetine和Tianeptine均顯示良好量效關(guān)系，見(jiàn)圖5。其中Fluoxetine IC50=11.1 nmol/L，與文獻(xiàn)中采用同位素3H標(biāo)記5-HT測(cè)得值IC50= 7.3 nmol/L接近，比ASP+方法測(cè)得值IC50=24.7 nmol/L靈敏度明顯提高［8］。Tianeptine在0.1～20.0 μmol/L范圍內(nèi)顯著促進(jìn)了hSERT對(duì)APP+攝取，驗(yàn)證了Tianeptine對(duì)SERT促進(jìn)作用，但當(dāng)濃度達(dá)到50～100 μmol/L，細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度反而降低。由此可見(jiàn)，該高內(nèi)涵方法不僅可以用于篩選hSERT抑制劑還可以篩選hSERT促進(jìn)劑，為發(fā)現(xiàn)hSERT活性化合物提供了便捷實(shí)用的方法。

圖5　Fluoxetine和Tianeptine對(duì)SERT攝取APP+活性的影響

3　討論

本研究目標(biāo)是建立一種改良的hSERT活性化合物HCS方法。鑒于放射性同位素標(biāo)記方法的諸多不便，選擇了熒光檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)已報(bào)道的hSERT活性HCS方法采用了ASP+為熒光底物，由于靈敏度低限制了其應(yīng)用；近年新合成的熒光底物APP+克服了ASP+在SERT活性檢測(cè)方面的不足，但至今未見(jiàn)應(yīng)用APP+為熒光底物優(yōu)化hSERT活性化合物HCS條件的報(bào)道。本研究首先建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERTHEK293細(xì)胞系，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗(yàn)證了hSERT表達(dá)，在高內(nèi)涵系統(tǒng)驗(yàn)證了hSERT對(duì)APP+攝取功能；為了優(yōu)化SERT活性化合物高內(nèi)涵篩選條件，考察了APP+濃度、孵育時(shí)間和公認(rèn)工具藥物Fluoxetine和Tianeptine在此系統(tǒng)上的藥效，驗(yàn)證了此篩選系統(tǒng)的可靠性。

本研究確立的hSERT活性化合物HCS方法包括以下特征：1）優(yōu)化了以APP+為熒光底物的hSERT活性化合物HCS條件，比ASP+方法靈敏度有明顯提高。2）首次驗(yàn)證了SSRE Tianeptine在HCS檢測(cè)效果，證實(shí)此方法不僅可用于篩選hSERT抑制劑，而且可用于篩選hSERT促進(jìn)劑。3）采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSERT-HEK293細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，存在隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加hSERT活性會(huì)隨之降低問(wèn)題，本研究采用了兩種方法來(lái)克服這種不足，一是限制細(xì)胞使用傳代次數(shù)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)hSERT-HEK293細(xì)胞在15代內(nèi)熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定，可以用于高內(nèi)涵篩選，防止由于細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)高導(dǎo)致hSERT活性降低，從而影響HCS實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性；二是采用計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度方法（公式1）分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)論是不同轉(zhuǎn)染批次細(xì)胞或者是同批相隔代數(shù)較多細(xì)胞間APP+絕對(duì)熒光強(qiáng)度會(huì)存在較大差別，采用對(duì)照組熒光強(qiáng)度作為參照來(lái)消除這種細(xì)胞批次/代數(shù)本底的影響，能夠更客觀(guān)地反映化合物活性。4）APP+熒光強(qiáng)度會(huì)隨著時(shí)間增長(zhǎng)而淬滅，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)APP+絕對(duì)熒光強(qiáng)度在30 min內(nèi)能夠維持穩(wěn)定，因此在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中需要注意以下兩方面，一是同一張多孔板內(nèi)的樣品數(shù)量不宜過(guò)多，樣品數(shù)量多會(huì)導(dǎo)致高內(nèi)涵系統(tǒng)掃描時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而影響APP+熒光強(qiáng)度；二是在同一張多孔板內(nèi)設(shè)立多個(gè)對(duì)照組，在高內(nèi)涵系統(tǒng)掃描過(guò)程中隨著時(shí)間推移都有相應(yīng)對(duì)照組用于相對(duì)熒光強(qiáng)度計(jì)算，從而減少誤差。5）總體而言，該方法快速高效，實(shí)驗(yàn)成本低，安全性高，適用于高通量藥物篩選。

公式1：Flu（相對(duì)）=Flu（藥物組）/Flu（對(duì)照組）

本方法適用于考察化合物對(duì)hSERT攝取功能的影響，但不能確定化合物與hSERT蛋白間是否存在直接相互作用，因?yàn)橛绊慼SERT活性的途徑既可能通過(guò)直接相互作用也可能通過(guò)間接步驟實(shí)現(xiàn)，如果需要進(jìn)一步確定化合物對(duì)hSERT蛋白直接相互作用，可采用傳統(tǒng)放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法考察進(jìn)行驗(yàn)證。

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中圖分類(lèi)號(hào)：R282.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9043（2016）03-0180-07

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.09

收稿日期：（2016-01-28）

*基金項(xiàng)目：國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX093 04007）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81403132）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20140203）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（12JCYBJC32400）

作者簡(jiǎn)介：劉艷庭（1989-），女，碩士研究生，主要從事中藥抗抑郁神經(jīng)藥理研究。

通訊作者：徐硯通，E-mail:tonyxu2015@sina.com。

An improved high content screening method for compounds on activity of serotonin transporters

LIU Yan-ting1，2，YING Shu-song1，2，WU Yi-jing1，2，DONG Peng-zhi1，2，WU Hong-hua1，2，XU Yan-tong1，2
（1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese MateriaMedica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Research and Development Center of Chinese MateriaMedica，Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China）

Abstract:［Objective］To establish an improved high content screening（HCS）method for compounds on activity of serotonin transporter（SERT），a stably transfected human SERT cell line will be obtained and the test conditions of HCS method for SERT activity will be optimized.［Methods］To obtain the stably transfected SERT cell line，plasmid hSERT-pcDNA3 was transfected into the HEK293 cell line by polyethylenimine（PEI）and then the cells were screened by antibiotic G418.To verify the quality of this stably transfected cell line，expression of hSERT mRNA and protein was tested by Real-time PCR and Western blotting，respectively.To test the SERT reuptake activity，4-（4-（Dimethylamino）phenyl）-1-methylpyridinium（APP+），a fluorescent substrate of SERT，was used and the test conditions of HCS assay were optimized.The positive drugs including selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine and enhancer tianeptine were used to confirm the reliability of this HCS assay.［Results］The stably tansfected hSERT-HEK293 cell line was obtained by PEI transfection and G418 screening.Compared to the HEK293 cells，expression of hSERT mRNA and protein in hSERT-HEK293 cells was significantly increased，and its transport ability of APP+was also significantly increased，which could be specifically blocked by fluoxetine.The test conditions of HCS for SERT activity were optimized including the concentration of APP+，its incubation time and the method for data analysis.The SERT activity of hSERT-HEK293 cells were significantly inhibited by fluoxetine while significantly enhanced by tianeptine，which confirmed the reliability of this HCS method.［Conclusion］This study firstly optimized the HCS assay with APP+in testing SERT activity，which obviously improved the sensitivity of HCS method for SERT activity，and it is the first time to show this HCS method suitable for screening SERT enhancers，so this study established an improved HCS method for compounds on hSERT activity.

Key words:SERT；APP+；hSERT-HEK293 cell line；HCS