大腸桿菌ABC轉(zhuǎn)運體研究進展

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ABC轉(zhuǎn)運體是所有轉(zhuǎn)運體家族中最大的一類轉(zhuǎn)運體，廣泛分布于從原核生物到人類的幾乎所有的物種中。大部分的ABC家族轉(zhuǎn)運體都是跨膜蛋白質(zhì)，通過偶聯(lián)ATP的水解釋放的能量轉(zhuǎn)移底物。這些蛋白質(zhì)組成了古老的轉(zhuǎn)運體家族，其進化時間超過30億年。系統(tǒng)發(fā)生方面的證據(jù)支持ABC家族的分歧時間早于細菌、古細菌和真核生物的分歧時間，許多人類的ABC轉(zhuǎn)運體與某些細菌如大腸桿菌的ABC同源。

不同類型的ABC轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運不同的底物，從小分子如離子、糖或氨基酸到大分子如抗體、藥物、磷脂和寡肽等。在細菌中ABC轉(zhuǎn)運體參與營養(yǎng)物質(zhì)的攝取或細菌毒素的分泌以及將抗生素泵出細胞使細菌具有抗藥性；在植物中，ABC家族轉(zhuǎn)運體參與對除草劑的抗性[1]；在人類中，ABC家族基因突變會導(dǎo)致功能改變，與一些遺傳病如囊性纖維化有關(guān)，另外ABC家族轉(zhuǎn)運體的上調(diào)表達與腫瘤細胞的耐藥性有關(guān)。ABC家族的蛋白質(zhì)不僅參與物質(zhì)的跨膜運輸，也參與除轉(zhuǎn)運以外的其它功能如mRNA轉(zhuǎn)錄及DNA損傷修復(fù)等[2-3]。

1 大腸桿菌的ABC轉(zhuǎn)運體

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，是包括人類在內(nèi)許多動物的腸道正常菌群。大腸桿菌K-12菌株，是一個非毒力缺乏O-抗原和K-抗原并在實驗室廣泛使用的菌株，常被認為是大腸桿菌培養(yǎng)的標準菌株。1997年大腸桿菌K-12菌株完成全基因組測序，在其基因組中最大的蛋白質(zhì)家族是ABC轉(zhuǎn)運體家族，發(fā)現(xiàn)了至少72個編碼ABC家族蛋白的基因，占整個基因組的5%[3]。這個龐大的轉(zhuǎn)運體對于維持大腸桿菌正常的營養(yǎng)吸收及代謝產(chǎn)物的排出是非常重要的。而在人類基因組中只有48個ABC轉(zhuǎn)運體，金黃色葡萄球菌、果蠅、擬南芥分別有28、56、113個ABC轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)。除植物外，真核生物較原核生物含有較少的ABC系統(tǒng)。如果基因組中ABC系統(tǒng)數(shù)量多，說明這個生物有更多的底物被運進或運出。因此在真核生物中，能運動的生物體如動物較不能運動的生物如植物需要較少的ABC轉(zhuǎn)運體。因為能運動的生物含有較豐富的主動運輸系統(tǒng)保證營養(yǎng)物質(zhì)的供給和代謝產(chǎn)物的排出。

2 大腸桿菌ABC轉(zhuǎn)運體分類

目前大腸桿菌ABC超家族根據(jù)研究進展及功能分為3類。第一類為攝取系統(tǒng)，該類轉(zhuǎn)運體將胞外的物質(zhì)運輸?shù)郊毎麅?nèi)，是大腸桿菌獲取營養(yǎng)的主要途徑，該類轉(zhuǎn)運體包括已經(jīng)被實驗證實的攝取系統(tǒng)共41個(見表1)，其中研究比較清楚的包括大腸桿菌VB12攝取系統(tǒng)BtuCDF轉(zhuǎn)運體，HisJMPQ組氨酸轉(zhuǎn)運體，OppABCDF寡肽轉(zhuǎn)運體等，還有16個預(yù)測的ABC攝取系統(tǒng)，即這16個攝取系統(tǒng)目前為止功能還不清楚(見表2)[4]。第二類為輸出系統(tǒng)，這類轉(zhuǎn)運體的底物主要包括細胞內(nèi)合成的需要或能夠運輸?shù)桨鈭?zhí)行功能的蛋白質(zhì)，例如胞外的外周蛋白，細胞壁的主要成分磷脂及脂多糖等都是依賴ABC轉(zhuǎn)運體外排到胞外的，外排的底物還包括重金屬、大腸桿菌產(chǎn)生的溶血素、小菌肽、大腸桿菌素及抗生素等，大腸桿菌的外排轉(zhuǎn)運體有11個(見表3)[3]，其中有一部分是根據(jù)結(jié)構(gòu)域預(yù)測的。這些ABC外排泵對于大腸桿菌適應(yīng)不良環(huán)境起非常重要作用。大腸桿菌外排系統(tǒng)研究較為清楚的包括LolCED負責(zé)脂蛋白在內(nèi)外膜間的翻轉(zhuǎn)[5]；MsbA在相關(guān)功能研究之前預(yù)測為與細菌抗藥性有關(guān)的外排系統(tǒng)，但是經(jīng)功能研究之后發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)不但與多藥抗性有關(guān)，還負責(zé)將細胞質(zhì)合成的類脂A(lipid A)轉(zhuǎn)運到膜周間隙中[6]；脂多糖的外排系統(tǒng)LptAB[7]；溶血素外排系統(tǒng)HlyAB[8]；大腸桿菌素外排系統(tǒng)CvaAB[9]；亞鐵血紅素外排系統(tǒng)CcmAB[10]；YojI 轉(zhuǎn)運體負責(zé)小抗菌肽J25的外排[11]；以及與大環(huán)內(nèi)酯類藥物外排有關(guān)的macAB等[12]。輸出系統(tǒng)的大部分成員功能還未知；第3類為與物質(zhì)運輸無關(guān)的系統(tǒng)(見表4)。參與mRNA轉(zhuǎn)錄、DNA損傷的修復(fù)等，因此有人將ABC超家族翻譯成ABC系統(tǒng)。因為并不是所有的ABC家族成員都參與一定底物的轉(zhuǎn)運。大腸桿菌的非轉(zhuǎn)運體預(yù)測的有4個，這類轉(zhuǎn)運體典型的代表為UvrA，是目前為止已知的唯一一個與轉(zhuǎn)運沒有關(guān)系的ABC家族成員。UvrA系統(tǒng)在紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷中起到修復(fù)DNA的作用[13]。

3 大腸桿菌ABC轉(zhuǎn)運體的結(jié)構(gòu)

所有的ABC轉(zhuǎn)運體無論是攝取或輸出轉(zhuǎn)運體都有相似的結(jié)構(gòu)，即包含整合膜蛋白構(gòu)成的2個跨膜結(jié)構(gòu)域(MD)和2個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)，在許多細菌中，這4個結(jié)構(gòu)域分別由不同的基因編碼，如大腸桿菌的麥芽糖轉(zhuǎn)運體復(fù)合物MalEFGK[14]和核糖轉(zhuǎn)運體復(fù)合物RbsBCD[15]，而在有些細菌和真核生物中這4個結(jié)構(gòu)域可能由一個基因編碼，同時包含1個NBD結(jié)構(gòu)域和1個MD結(jié)構(gòu)域，2個這樣的蛋白形成二聚體發(fā)揮功能，這樣的ABC轉(zhuǎn)運體稱為半轉(zhuǎn)運體如大腸桿菌的磷脂A和多藥外排轉(zhuǎn)運體MsbA[7]，也有些ABC家族轉(zhuǎn)運體由1個基因編碼同時含有2個NBD結(jié)構(gòu)域和2個MD結(jié)構(gòu)域，這樣的轉(zhuǎn)運體稱為全轉(zhuǎn)運體，如人類的腫瘤抗藥性轉(zhuǎn)運體P-型糖蛋白就是1個典型的ABC家族的全轉(zhuǎn)運體[16]。在過去的10年里來自于不同細菌的45個不同的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有91個ABC晶體結(jié)構(gòu)被報道，其中35個是SBPs結(jié)構(gòu)，另外56個晶體結(jié)構(gòu)是NBD結(jié)構(gòu)和全長的轉(zhuǎn)運體結(jié)構(gòu)。后56個包含5個來自于4個不同的轉(zhuǎn)運體和51個NBD結(jié)構(gòu)域，其中NBD結(jié)構(gòu)域中13個是以二聚體形式存在，另外的38個都是單體[17-27]。

3.1核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 ABC轉(zhuǎn)運體的NBD結(jié)構(gòu)域保守性較強，在幾乎所有的ATP結(jié)合蛋白中都包括保守的Walker A和Walker B結(jié)構(gòu)域，而信號結(jié)構(gòu)域(LSGGQ)只出現(xiàn)在ABC轉(zhuǎn)運體家族中。NBD結(jié)構(gòu)域是ABC轉(zhuǎn)運體的馬達結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合并水解ATP產(chǎn)生的能量誘導(dǎo)NBD構(gòu)象改變，迫使NBD結(jié)構(gòu)域相互靠近并與ATP形成三明治結(jié)構(gòu)，這些改變傳遞給MD結(jié)構(gòu)域，引起其構(gòu)象改變，使其向內(nèi)或向外開放，從而使底物輸入到胞外或胞內(nèi)。

基于已經(jīng)獲得的晶體結(jié)構(gòu)，一般的NBD結(jié)構(gòu)域包含3個部分：α螺旋結(jié)構(gòu)域，1個催化結(jié)構(gòu)域和1個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。而α螺旋結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域在所有的NBD結(jié)構(gòu)域中都存在，只有在CysA,GlcV和MalK轉(zhuǎn)運體中存在額外的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。所有的ABC轉(zhuǎn)運體的NBD結(jié)構(gòu)域包含高度保守的結(jié)構(gòu)域如Walker A (GXXGXGKS/T with X 代表如何氨基酸) 和 Walker B (ΦΦΦΦD with Φ 代表輸水氨基酸殘基)，這2個motif包含了ATP識別和結(jié)合的位點[28]，而信號結(jié)構(gòu)域(signature motif LSGGQ，也叫做C-loop或LSGGQ motif)只出現(xiàn)在ABC轉(zhuǎn)運體中是ABC轉(zhuǎn)運體的標志性結(jié)構(gòu)域，在NBD形成的二聚體中順向NBD的Walker A motif與反向NBD的signature motif 與ATP的□-磷酸結(jié)合形成催化結(jié)構(gòu)域。

表1 大腸桿菌中已經(jīng)被證實的輸入系統(tǒng)(41個)Tab.1 Experimentally confirmed import system

NBD結(jié)構(gòu)域還包含A-環(huán)(A-loop)，Q-環(huán)(Q-loop)，D-環(huán)(D-loop)和H-環(huán)(H-loop也叫做switch loop)僅由一個保守的氨基酸殘基組成。組成A-環(huán)的氨基酸殘基為芳香族的氨基酸殘基，通常是酪氨酸，對于ATP與NBD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合起輔助作用[29-30]；組成Q-環(huán)的氨基酸殘基為谷氨酰胺，與ATP’s的γ-磷酸結(jié)合；組成Q-環(huán)的氨基酸殘基為組氨酸，與ATP’s的γ-磷酸直接結(jié)合。在全長的ABC轉(zhuǎn)運體中Q-環(huán)即與MD結(jié)構(gòu)域結(jié)合又與ATP結(jié)合，在NBD和MD結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象偶聯(lián)中起重要作用[26，31]。

ATP與一個核苷酸結(jié)合位點水解引起NBD的二聚化，但是2個位置的水解需要ATP與NBD形成三明治樣結(jié)構(gòu)[32]。ATP的結(jié)合、水解及ADP的釋放誘導(dǎo)NBD結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的變化，NBD構(gòu)象的變化誘導(dǎo)MD構(gòu)象也發(fā)生變化從而完成底物的轉(zhuǎn)運。

3.2ABC轉(zhuǎn)運體的跨膜結(jié)構(gòu)域 與保守的NBD結(jié)構(gòu)域相比，跨膜結(jié)構(gòu)域(MD)的保守性較差[33]，這與MD結(jié)構(gòu)域參與不同底物轉(zhuǎn)移的功能有關(guān)。在ABC外排轉(zhuǎn)運體中，全長的轉(zhuǎn)運體含有2個MD結(jié)構(gòu)域形成1個二聚體結(jié)構(gòu)，包含12個跨膜的α螺旋，而ABC攝取轉(zhuǎn)運體中，跨膜α螺旋數(shù)量不同，10～12個跨膜螺旋可能是底物跨膜轉(zhuǎn)移的最小數(shù)量。許多ABC外排泵的MDs都有2個位于細胞外的環(huán)和2個位于細胞質(zhì)基質(zhì)的環(huán)。在金黃色葡萄球菌多藥外排轉(zhuǎn)運體Sav1866 同源二聚體結(jié)構(gòu)中，位于細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)有2個短偶聯(lián)螺旋形成的環(huán)(ICL1和ICL2)與細胞膜平行并與NBD結(jié)構(gòu)域相互作用[34]。第一個偶聯(lián)螺旋(ICL1)可以同時與2個NBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而第2個偶聯(lián)螺旋(位于ICL2) 專一的與半轉(zhuǎn)運體對面的NBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合[35]。在NBD結(jié)構(gòu)域中Q-環(huán)提供了與偶聯(lián)螺旋相互作用的氨基酸殘基。NBD結(jié)構(gòu)域中有1個保守的位于X-環(huán)(X-loop)谷氨酸鹽可以同時與兩個偶聯(lián)螺旋結(jié)合被認為在NBDs與MDs的相互作用中起重要作用[35]。NBD和MD偶聯(lián)的確切機理還不清楚。

3.3底物識別結(jié)構(gòu)域 攝取系統(tǒng)而不是輸出系統(tǒng)通常包含可以與底物識別和結(jié)合的底物結(jié)合受體(solute-binding receptors，SBP)，一個系統(tǒng)通常含有一個或多個底物結(jié)合受體，在革蘭氏陰性菌中底物結(jié)合受體位于細胞周質(zhì)(periplasm)，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的原核型ABC轉(zhuǎn)運體的基質(zhì)結(jié)合蛋白和自由狀態(tài)的基質(zhì)結(jié)合蛋白在胞外空間含量較高。其比例遠高于可能與他們結(jié)合的ABC轉(zhuǎn)運體?？赡茴~外的SBPs能夠結(jié)合可能結(jié)合的任何底物，經(jīng)SBPs將底物交給附近的ABC輸入泵完成底物轉(zhuǎn)運。在革蘭氏陰性菌的外排泵中需要確保ABC轉(zhuǎn)運體與外膜蛋白結(jié)合便于穿過膜周間隙的轉(zhuǎn)運，如大腸桿菌外排溶血素系統(tǒng)HlyB[8]。HlyB轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)移溶血素時與外膜蛋白TolC相互作用，在外膜與膜周間隙形成一個跨膜轉(zhuǎn)移溶血素的外排系統(tǒng)。

在革蘭氏陽性菌中缺乏外膜的SBPs暴露在細胞表面，因此底物結(jié)合受體既可以是脂蛋白也可以位于細胞質(zhì)膜外，或細胞表面相關(guān)蛋白，底物結(jié)合蛋白分為6個亞家族[36]。SBP與MT和NBD形成的同源或異源二聚體的N端或C端結(jié)合，因此2個或更多的SBP可以與二聚體結(jié)合可以促進轉(zhuǎn)運效率。而有些特殊的高度親和的ABC家族的攝取系統(tǒng)如維生素、礦物質(zhì)和其他小分子攝取系統(tǒng)叫做ECF系統(tǒng)，缺乏細胞外的受體[37]。

大腸桿菌是最簡單的模式生物，對其它ABC家族轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)進行研究不僅可以了解該物質(zhì)ABC家族轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運機制，同時也可以為其他物種的相關(guān)研究提供理論參考，大腸桿菌的外排泵家族中有一部分與其抗藥性有關(guān)，對這些外排泵的深入研究對于解讀人類的抗腫瘤藥物的外排有一定的幫助。