基于特異質(zhì)大鼠膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能抑制探討首烏藤肝損傷機制

李紅品 朱虹宇 高興 馬鵬凱 陳建華 畢欣寧 汪祺 張玉杰

[摘要]考察全粉及提取物對正常和特異質(zhì)（LPS）大鼠膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運體Oatp1a1，Oatp1b2和MRP2活性及mRNA表達(dá)的影響，探討首烏藤致肝損傷的可能機制。正常及LPS大鼠分別連續(xù)灌胃首烏藤全粉及提取物7 d后，靜脈注射轉(zhuǎn)運體底物磺溴酞鈉（BSP），測定其藥動學(xué)參數(shù)，考察各轉(zhuǎn)運體的活性，同時取肝組織檢測轉(zhuǎn)運體mRNA的表達(dá)。結(jié)果首烏藤全粉及提取物可使BSP的t1/2和AUC顯著升高，CL顯著降低；AST和ALT顯著性降低；Oatp1a1，Oatp1b2及MRP2的mRNA表達(dá)水平明顯下降（P<005），但未見二者與LPS的協(xié)同作用。綜上首烏藤及其提取物對膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能的抑制作用，可能是其是否造成肝損傷的原因之一。

[關(guān)鍵詞]首烏藤； 膽紅素； 轉(zhuǎn)運體； 特異質(zhì)； 肝毒性

Study on mechanism of hepatotoxicity of Ploygoni Multiflori Caulis based on

function inhibition of bilirubinassociated transporters in idiosyncratic rat

LI Hongpin1， ZHU Hongyu1， GAO Xing1， MA Pengkai1， CHEN Jianhua1， BI Xinning1， WANG Qi2*， ZHANG Yujie1*

（1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

[Abstract]To explore the possible mechanism of liver injury， the effects of Ploygoni Multiflori Caulis and its extractive on the function of bilirubinassociated transporters were investigated in normal （N） and idiosyncratic （LPS） rats （M） The normal and LPS rats were respectively administrated powder of Ploygoni Multiflori Caulis， its extractive and same volume of 05% CMCNa solution for 7 d BSP， a substrate of the transporters of Oatp1a1 and Oatp1b2 was selected， and its pharmacokinetic parameters of intravenous injection were determined to examined the activity these transporters Meanwhile the mRNA expressions of transporters were detected Compared with Nblank control group， besides Mpowder group， the Cmax has no significantly different from other groups， t1/2， AUC0t and AUC0∞ were significantly increased， and CL were significantly decreased However， compared with N blank control group， AST and ALT decreased significantly The expression of Oatp1a1， Oatp1b2 and MRP2 mRNA was significantly decreased （P<005）， but there was no act synergistically when Ploygoni Multiflori Caulis and extractive were combined with LPS The function of Oatp1a1， Oatp1b2 and MRP2 in rats were significantly inhibited by Ploygoni Multiflori Caulis and extractive， which may be an important cause of hepatotoxicity.

[Key words]Ploygoni Multiflori Caulis； bilirubin； transporter； idiosyncratic； hepatotoxicity

首烏藤Ploygoni Multiflori Caulis為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥藤莖，用于失眠多夢，血虛身痛等[1]。所含化學(xué)成分與何首烏類似，主要為蒽醌類、二苯乙烯苷、鞣質(zhì)和二蒽酮等幾類化合物[2]。近年來首烏藤肝毒性作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，引起各界的關(guān)注，但其毒性物質(zhì)成分及肝損傷機制尚不明了。

臨床上，首烏藤的毒性癥狀主要表現(xiàn)為膽管上皮細(xì)胞受損，肝細(xì)胞功能紊亂及膽汁瘀積 [34]。膽紅素作為膽汁的主要成分，有結(jié)合膽紅素（BG）和非結(jié)合膽紅素（UCB）之分，生理濃度的UCB具有抗氧化活性，高濃度則容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性，是膽汁瘀積性肝損傷的重要原因。血液中的UCB主要通過轉(zhuǎn)運體Oatp1b1和Oatp1b3（大鼠為Oatp1a1和Oatp1b2）攝取入肝臟，在肝臟中經(jīng)過代謝酶作用成為BG，再經(jīng)轉(zhuǎn)運體MRP2外排致膽汁中。若膽紅素相關(guān)代謝酶或轉(zhuǎn)運體的功能出現(xiàn)障礙，都將導(dǎo)致UCB在肝細(xì)胞和血液內(nèi)蓄積，引發(fā)肝毒性，產(chǎn)生黃疸[5]。為此有人推測何首烏可能具有抑制膽紅素（膽汁酸）相關(guān)轉(zhuǎn)運體的作用，從而造成膽紅素轉(zhuǎn)運肝細(xì)胞受阻，進(jìn)而形成瘀積，使肝組織受損。目前這一推論已在體外細(xì)胞模型上獲得證實[6]，研究表明何首烏中的多種化學(xué)成分對膽汁酸轉(zhuǎn)運體存在抑制作用。由于轉(zhuǎn)運體在體內(nèi)較之體外所受影響因素的復(fù)雜性，以及體內(nèi)多種代償調(diào)控作用的客觀存在，體外結(jié)果不能完全反映何首烏對轉(zhuǎn)運體的實際作用情況，體內(nèi)驗證實驗研究是十分必要的。此外，最近王伽伯等[7]通過大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)何首烏及其制劑所致肝損傷的總體發(fā)病率較低，可能存在高危人群，類似于特異質(zhì)性肝損傷。并且目前對于首烏藤缺乏研究。endprint

為此，本研究采用底物清除法，以磺溴酞鈉（BSP）為 Oatp1a1，Oatp1b2和MRP2的底物，考察首烏藤及其總二蒽酮提取物對正常和特異質(zhì)（LPS）大鼠轉(zhuǎn)運體活性的影響，并采用RTPCR技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)運體mRNA表達(dá)的變化，為首烏藤對膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能影響提供體內(nèi)實驗依據(jù)，為探索其致肝損傷的機制奠定基礎(chǔ)。

1材料

11儀器

FW100高速萬能粉碎機（北京市中性偉業(yè)儀器有限公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TU1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TGL20M臺式高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；DKZ450B型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；VOTEX GENIVS渦旋混勻儀（IKA）。

12試藥

首烏藤飲片（北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號20160523）；磺溴酞鈉（BSP，北京伊諾凱科技有限公司，批號A0357281）；脂多糖（LPS，北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號046M4045V）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（ALT試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20161019）；谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（AST試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20161017）；其他試劑均為分析純。

13動物

SpragueDawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證號SCXK20110004。標(biāo)準(zhǔn)動物房中飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，濕度55%～60%，光照12 h時明暗交替，塑料盒飼養(yǎng)，喂以SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2方法

21溶液的制備

211首烏藤粉供試液的制備精密稱取首烏藤粉末（過8號篩）適量，加05%的CMCNa溶液混懸并定容，制成生藥質(zhì)量濃度為250 g·L-1的首烏藤粉混懸液，置于4 ℃，備用。

212首烏藤提取物供試液的制備[8] 取首烏藤飲片800 g，用10倍量70%乙醇加熱回流提取3次，提取時間分別為2，15，1 h，濾過，合并提取液，減壓回收溶劑，得浸膏8769 g。將浸膏按1∶10的比例分散于水中混懸，用二氯甲烷萃取2次，水溶液部分減壓除去有機溶劑，然后過AB8型大孔吸附樹脂，按1 g藥材/5 mL樹脂上樣，用95%乙醇2倍柱體積洗脫，將得到的部分濃縮、干燥，得總二蒽酮提取物，得率為616%。精密稱取提取物粉末適量，加05%的CMCNa溶液混懸并定容，制成質(zhì)量濃度為50 g·L-1的混懸液（相當(dāng)首烏藤生藥質(zhì)量濃度800 g·L-1），置于4 ℃，備用。

213BSP儲備液的配制精密稱取BSP適量，加生理鹽水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為50 g·L-1的BSP儲備液，置于4 ℃，備用。

214LPS靜脈注射溶液的配制精密稱取LPS適量，加生理鹽水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為28 g·L-1的LPS溶液，置于4 ℃，備用。

22分組及給藥

221LPS大鼠模型的復(fù)制[9]36只大鼠隨機分為6組，特異質(zhì)模型（LPS）3組分別為：M全粉組、M提取物組、M空白對照組，每組于第1天經(jīng)大鼠股動脈注射LPS（28 mg·kg-1）造模；正常3組分別為：N全粉組、N提取物組、N空白對照組，于第1天股靜脈注射同體積的生理鹽水。參照文獻(xiàn)[9]對各組的炎性細(xì)胞因子IL1β，IL6，TNFα進(jìn)行檢測，結(jié)果與正常大鼠比較，LPS模型大鼠的IL1β，IL6，TNFα均有不同程度的上調(diào)（P<005），說明大鼠處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，但其表達(dá)上調(diào)量尚未達(dá)到引起肝損傷的程度，表明模型復(fù)制成功。

222給藥2 h后各組分別灌胃首烏藤粉混懸液（5 g·kg-1·d-1，給藥體積20 mL·kg-1），首烏藤提取物混懸液（1 g·kg-1·d-1，給藥體積20 mL·kg-1），同體積的05%的CMCNa溶液。每日1次，連續(xù)給藥7 d。實驗期間，記錄大鼠每日攝食攝水量，體質(zhì)量、臨床觀察動物體征及糞便。

23BSP藥代動力學(xué)試驗[10]

231樣品采集和處理給藥結(jié)束后，大鼠禁食24 h，分別由股動脈注射轉(zhuǎn)運體特異性底物BSP，劑量為2 mL·kg-1（100 mg·kg-1）。分別在注射后0，2，5，10，20，25，30，40，50，60 min，由眼眶取血06 mL，置于肝素化的離心管中，15 000 r·min-1離心15 min，取上清血漿，存于-20 ℃，待測。待血液收集完，即60 min后，處死大鼠，取肝臟存于-80 ℃冰箱中，待測。

232大鼠血漿BSP的測定分別取各組血漿樣品50 μL于EP管中，各加蒸餾水250 μL，01 mol·L-1氫氧化鈉300 μL進(jìn)行顯色。并取A，B 2管，各加空白血漿50 μL，蒸餾水250 μL。于A管中加01 mol·L-1氫氧化鈉300 μL進(jìn)行顯色，于B管中加01 mol·L-1鹽酸300 μL作為對照，于580 nm測定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血漿BSP濃度。

24轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的檢測[11]

稱取100 mg大鼠肝臟組織剪碎，經(jīng)RNA提取，RNA濃度、純度及其完整性的測定，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增等過程。用PCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出Ct值，待測樣本目的基因表達(dá)數(shù)的計算方法用2-ΔΔCt法決定目標(biāo)基因Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2表達(dá)的相對水平。

25血清生化指標(biāo)的檢測

取各組血漿樣品根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用TU1901紫外分光光度計測定血清生化指標(biāo)AST和ALT，并將所測定的結(jié)果與N空白對照組比較分析。

26數(shù)據(jù)處理

大鼠的血藥濃度時間數(shù)據(jù)釆用DAS 211藥代動力學(xué)軟件分析，并計算藥代動力學(xué)參數(shù)。各組數(shù)據(jù)均采用SAS統(tǒng)計軟件處理，所用的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)t檢驗，P<005將被認(rèn)為所檢驗的差別有統(tǒng)計意義。endprint

3結(jié)果

31方法學(xué)考察

311線性關(guān)系取試管5只，分別取不同體積BSP儲備液，然后依次加入空白血漿使總體積均成200 μL，搖勻，使各管中BSP質(zhì)量濃度為002，025，050，075，10 g·L-1。再取試管5只，分別加入上述各管BSP儲備液50 μL，按照232項方法顯色，測定吸光度。以BSP的含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，BSP對照品含量與吸光度之間滿足關(guān)系式y(tǒng)=1094 2x+0024 7（r=0999 5）。BSP在002～10 g·L-1與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢測限為0006 g·L-1。

312精密度取線性關(guān)系中低、中、高3個濃度的血漿BSP對照品溶液，連續(xù)顯色測定6次，記錄吸光度，分別求得吸光度的RSD<10%，符合生物樣本測定的要求。

313重復(fù)性分別準(zhǔn)確吸取稀釋后樣品液各5份，按照232項的方法進(jìn)行測定，計算含量。求得RSD=017%，表明該方法重復(fù)性良好。

314加樣回收率向空白血漿中分別加入低、中、高3個濃度的BSP對照品，每組3份，再按照232項的方法測定吸光度。結(jié)果3 組的平均加樣回收率分別為9986%，9923%，9826%，RSD分別為0090%，034%，059%。說明加樣回收率良好，符合方法學(xué)測定要求。

32首烏藤及提取物對Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2活性的影響

各組Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2轉(zhuǎn)運體的特異性底物（BSP）藥代動力學(xué)試驗結(jié)果見表1，血藥濃度時間曲線見圖1。結(jié)果顯示：除M全粉組，其余各組與N空白對照組相比，Cmax無顯著性差異，但各組的t1/2，AUC0t，AUC0∞顯著升高，CL顯著下降（P<005），由于BSP在體內(nèi)主要通過Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)運，結(jié)果表明首烏藤及二蒽酮對大鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)運體Oatp1a1，Oatp1b2產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

血藥濃度時間曲線下面積表現(xiàn)為M空白對照組>N全粉組>N提取物組≈M提取物組>N空白對照組≈M全粉組，其中M空白對照組高于其他各組，表明LPS對Oatp1a1和Oatp1b2的活性具有明顯的抑制作用；N全粉組>N提取物組≈M提取物組>M全粉組，說明首烏藤全粉對Oatp1a1和Oatp1b2活性的抑制作用強于提取物二蒽酮；并且其在正常組的抑制作用強于模型組，說明首烏藤及二蒽酮與LPS合用時對Oatp1a1和Oatp1b2活性的抑制作用減弱，可能具有一定的保護(hù)作用。

33首烏藤及提取物對Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2基因表達(dá)的影響

各轉(zhuǎn)運體的mRNA表達(dá)結(jié)果見表2。Oatp1a1結(jié)果顯示：與N空白對照組相比，除M空白對照組顯著升高，其余各組mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)為顯著性下降的趨勢，下降的程度呈現(xiàn)出N全粉組>M提取物組≈N提取物組>M全粉組>N空白對照組。轉(zhuǎn)運體Oatp1b2的mRNA結(jié)果與其相似。轉(zhuǎn)運體MRP2的mRNA結(jié)果，與N空白對照組相比，除M空白對照組無顯著性差異，其余各組mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)為顯著性下降的趨勢，但下降程度呈現(xiàn)出M提取物組>N提取物組>N全粉組>M全粉組>M空白對照組≈N空白對照組。

34首烏藤及提取物對血清AST，ALT的影響

大鼠給藥首烏藤及提取物后的血清生化指標(biāo)AST，ALT的檢測結(jié)果見表3。與N空白對照組比較，AST和ALT均顯著性降低。

4討論

轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)藥物在組織及細(xì)胞中的攝入和外排，并在藥物吸收、分布、代謝和排泄（ADME）中起重要作用[12]。肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)代謝的主要器官，重要的解毒功能，通常情況下，藥物經(jīng)血液進(jìn)入肝臟，再以原形或代謝物的形式經(jīng)膽汁分泌至體外。在這一程中，肝細(xì)胞血竇側(cè)的攝取轉(zhuǎn)運體協(xié)助底物運輸至肝細(xì)胞內(nèi)，而膽小管側(cè)和血竇側(cè)的外排轉(zhuǎn)運體則負(fù)責(zé)將藥物或代謝物排至膽汁或重新轉(zhuǎn)運回血液[13]。

BSP與膽紅素的代謝途徑類似，在機體內(nèi)幾乎完全經(jīng)過肝膽管清除，主要通過轉(zhuǎn)運體Oatp1a1和Oatp1b2攝取入肝臟，其原型再經(jīng)過外排型轉(zhuǎn)運體MRP2外排致膽汁中[10]。本研究利用BSP的此特性作為Oatp1a1和Oatp1b2的特異性底物，進(jìn)而判斷其活性變化，BSP藥代動力學(xué)結(jié)果顯示：首烏藤及其提取物可使BSP的t1/2，AUC0t，AUC0∞顯著升高，CL顯著下降（P<005），由于BSP在體內(nèi)主要通過Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)運，結(jié)果表明首烏藤及提取物二蒽酮對大鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)運體Oatp1a1，Oatp1b2產(chǎn)生了明顯的抑制作用。由血藥濃度時間曲線下面積可以看出：首烏藤全粉的抑制作用強于提取物二蒽酮；LPS對Oatp1a1，Oatp1b2也有明顯的抑制作用；而正常組的抑制作用強于模型組，說明首烏藤及提取物二蒽酮與LPS合用時對轉(zhuǎn)運體活性的抑制作用減弱，可能具有一定的保護(hù)作用。

無論正常或LPS大鼠，首烏藤全粉和二蒽酮對Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2的基因表達(dá)均有顯著抑制的作用：在正常大鼠中，二蒽酮對于MRP2的作用高于全粉，而全粉對Oatp1a1和Oatp1b2的作用高于二蒽酮，即二蒽酮對毒性物質(zhì)或膽紅素的外排產(chǎn)生了較強的抑制作用，其毒性作用可能強于全粉；但在LPS大鼠中，全粉對MRP2的作用高于二蒽酮，而二蒽酮對Oatp1a1和Oatp1b2的作用高于首烏藤全粉，說明全粉的毒性作用可能高于二蒽酮；并且M空白對照組對MRP2的基因表達(dá)無影響，并對Oatp1a1和Oatp1b2基因表達(dá)具有一定的上調(diào)作用，說明LPS對肝臟無損傷作用。

ALT與AST主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死時ALT和AST就會升高，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，是目前最常用的肝功能指標(biāo)。因此本研究對這2種指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果與N空白對照組比較， AST和ALT均顯著性降低。臨床上認(rèn)為其升高方可說明肝損傷情況，而降低并不具有生物學(xué)意義，其原因可能給藥時間過短，機體的代償性調(diào)節(jié)消除了這2種指標(biāo)的變化。endprint

綜上首烏藤及其總二蒽酮部位對大鼠肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)運體Oatp1a1，Oatp1b2，MRP2的功能具有抑制作用，推測可能與膽紅素或毒性物質(zhì)成分肝內(nèi)蓄積，形成的肝損傷存在一定的聯(lián)系，此結(jié)論尚需進(jìn)一步蛋白表達(dá)及生化病理學(xué)研究證實。

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[責(zé)任編輯張燕]endprint