醋甘遂活性部位各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性比較研究

樓堅(jiān)偉+曹亮亮+張橋+張麗

[摘要]采用模式生物斑馬魚的胚胎評(píng)價(jià)醋甘遂活性部位各成分群急性毒性，同時(shí)采用UFLCQTOFMS對(duì)各成分群的化學(xué)成分進(jìn)行定性研究。以24 h健康斑馬魚胚胎為研究對(duì)象，各成分群設(shè)9個(gè)濃度和1個(gè)空白對(duì)照組，考察給藥后96 h其對(duì)斑馬魚胚胎存活率的影響，計(jì)算不同樣品對(duì)斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度（LC50）。結(jié)果顯示，各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性大小依次為B>C>A>D，成分群D的毒性不明顯。UFLCQTOFMS分析結(jié)果顯示成分群B主要檢測(cè)到巨大戟烷型二萜類成分，成分群C主要檢測(cè)到假白欖烷型二萜類成分。關(guān)聯(lián)毒性研究結(jié)果，推測(cè)假白欖烷型二萜類成分可能為醋甘遂中更為低毒的活性成分，可為進(jìn)一步深入探究醋甘遂“有故無(wú)殞”的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]醋甘遂； 成分群； UFLCQTOFMS； 斑馬魚胚胎； 急性毒性

Comparative study on acute toxicity of different active ingredient

fractions from Kansui stirbaked with vinegar on zebrafish embryos

LOU Jianwei， CAO Liangliang， ZHANG Qiao， ZHANG Li*， DING Anwei

（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and

Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract]The 24 h normal developing zebrafish embryos were used to evaluate the acute toxicity and the compounds of respective fractions were analyzed by UFLCQTOFMS simultaneously Nine concentration groups with respective concentration and a blank control group were designed for each fraction to investigate their effect on survival rates of zebrafish embryos 96 h after drug administration， and calculate the median lethal concentration （LC50） of different fractions to zebrafish embryos The results showed that all of the fractions had acute toxicity to zebrafish embryos except VEKD， and the order was as follows： VEKB， VEKC， VEKA and VEKD According to the results of UFLCQTOFMS， the chemical ingredients contained in VEKB and VEKC were mainly composed of ingenanetype and japhanetype diterpenoids， respectively It could be speculated that japhanetype diterpenoids might be the active compounds with lower toxicity associated with the results of toxicity study， providing some references for the further research on effective material basis of Kansui stirbaked with vinegar according to the principle of "drastic medicine， no death risks"

[Key words]Kansui stirbaked with vinegar； ingredients； UFLCQTOFMS； zebrafish embryos； acute toxicity

中藥甘遂為大戟科植物甘遂Euphorbia kansui TN Liou ex TP Wang的干燥塊根[1]。性味寒苦，有毒，常用于治療胸腹積水、二便不利等癥，臨床內(nèi)服需醋炙，以降低毒性及緩和藥性。本課題組前期從腹水量、尿量、對(duì)腎素血管緊張素Ⅱ醛固酮系統(tǒng)的影響等多方位考察了醋甘遂各極性部位對(duì)Walker256癌性腹水模型大鼠的瀉水逐飲功效，表明醋甘遂乙酸乙酯部位為其瀉水逐飲活性部位[2]，但其功效成分仍待深入研究。醋甘遂較生品毒性降低，在癌性腹水模型大鼠上表現(xiàn)為“有故無(wú)殞”，但在正常動(dòng)物上醋甘遂仍表現(xiàn)出一定的肝、胃、腸毒性，其毒性研究不可忽視[3]。模式動(dòng)物斑馬魚較小鼠等哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有低成本、易于觀察且重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于細(xì)胞又更能體現(xiàn)中醫(yī)整體理論，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于中藥毒性研究[4]。故本實(shí)驗(yàn)擬分離醋甘遂瀉水逐飲活性部位各成分群，采用模式生物斑馬魚的胚胎對(duì)各成分群進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合UFLCQTOFMS對(duì)各成分群的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，以期為揭示醋甘遂活性成分群瀉水逐飲的物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的依據(jù)。endprint

1材料

11藥材

甘遂藥材（產(chǎn)地：陜西省寶雞市眉縣，生產(chǎn)批號(hào)20150415）購(gòu)自陜西省寶雞市眉縣天源中草藥開發(fā)有限公司。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)唐于平教授鑒定為大戟科植物甘遂E kansui的塊根，符合《中國(guó)藥典》2015年版項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

12動(dòng)物

斑馬魚成魚（野生型AB品系）購(gòu)于南京堯順禹生物科技有限公司，約7月齡，體長(zhǎng)（35±03） cm， 體質(zhì)量（045±01） g。

13儀器與試劑

SHIMADZU LC20快速液相色譜儀；高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)：配有電噴霧離子源（ESI）的Triple TOFTM 5600質(zhì)譜、Peak View SoftwareTM Version 12質(zhì)譜分析軟件（AB SCIEX公司）；萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特公司）；TC10KA型雙杰電子天平；MS105DV型電子天平（METTLER TOLEDO，1/10 萬(wàn)）；DZF6050型真空干燥箱（上海煜南有限公司）；SZX41型體式顯微鏡（上海明茲精密儀器有限公司）；R200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi公司）；KH500DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；智能生化培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；人工海水（蒸餾水、NaCl 137 mmol·L-1，NaHCO3 42 mmol·L-1，KH2PO4 044 mmol·L-1，CaCl2 13 mmol·L-1，KCl 54 mmol·L-1，MgSO4 10 mmol·L-1，Na2HPO4 025 mmol·L-1）；乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純（Merck公司），水為超純水（Millipore純水機(jī)自制）。

2方法

21樣品的制備

211醋甘遂的制備取凈甘遂適量，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（四部）炮制通則項(xiàng)下醋炙法規(guī)定，加醋拌勻，悶透，待醋吸盡，炒鍋加熱至260 ℃左右，翻炒9 min至顏色加深，略有焦斑，微帶醋香氣，取出放涼，即得。每100 kg甘遂用醋30 kg。

212醋甘遂活性部位各成分群的制備取醋甘遂10 kg，粉碎過(guò)4號(hào)篩，加10倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h；殘?jiān)?0倍量的水回流提取2次，每次2 h；合并4次濾液，得醋甘遂復(fù)合提取物。采用等倍量的乙酸乙酯萃取醋甘遂復(fù)合提取物10次，合并萃取液并減壓濃縮至干。采用減壓硅膠柱層析法，以石油醚乙酸乙酯（100∶2，20個(gè)柱體積）洗脫得成分群A（VEKA）；石油醚乙酸乙酯（100∶15，8個(gè)柱體積；100∶18，2個(gè)柱體積）洗脫得成分群B（VEKB）；石油醚乙酸乙酯（100∶40，8個(gè)柱體積）洗脫得成分群C（VEKC）；甲醇洗脫得成分群D（VEKD）?；厥杖軇瑴p壓干燥至干。各成分群相對(duì)于原飲片的提取率分別為VEKA 055%，VEKB 021%，VEKC 032%，VEKD 155%。

22UFLCQTOFMS定性分析

221各成分群供試品溶液的制備按各成分群在原飲片中的提取率，分別稱取各成分群適量（均相當(dāng)于醋甘遂1 g）至10 mL量瓶中，加20%乙腈超聲溶解后加溶劑稀釋至刻度。13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，022 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

222色譜條件Acquity UPLC BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm， Waters公司），流動(dòng)相為01%甲酸水（A）乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～80%B；20～36 min，80%～99%B；36～38 min，99%B；38～42 min，99%～20%B；42～45 min，20%B），柱溫30 ℃，流速04 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL。

223質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍m/z 50～1 500，采用動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）和觸發(fā)信息關(guān)聯(lián)采集模式（IDA）掃描的方法。去溶劑溫度（TEM）550 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，去簇電壓（DP）100 V，一級(jí)碰撞電壓（CE）10 V，二級(jí)碰撞電壓（CE）35 V，氣簾氣276 kPa，輔助氣379 kPa，霧化氣379 kPa。

224數(shù)據(jù)采集與分析運(yùn)用Peak View SoftwareTM Version 12軟件中的XIC Manager功能，并對(duì)總離子流圖進(jìn)行背景扣除，對(duì)各成分群的甘遂特征性化合物進(jìn)行初步篩查。利用Formula finder軟件，獲得的目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、同位素分布等眾多性息以測(cè)定化合物的元素組成。在總結(jié)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)信息的基礎(chǔ)上，結(jié)合目標(biāo)化合物的特征碎片及裂解規(guī)律，進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析與鑒定。

23斑馬魚毒性評(píng)價(jià)

231斑馬魚胚胎的繁殖及收集斑馬魚成魚養(yǎng)殖與繁殖方法參照zebrafish book[5]。水溫控制（290±10） ℃，光周期為14∶10（即光照14 h，黑暗10 h），餌料為新鮮豐年蝦。收集斑馬魚胚胎前，以雌雄比為1∶2的比例將成體斑馬魚分離喂養(yǎng)1周，產(chǎn)卵前合并至特制容器中，放入氧氣泵以及加熱棒，以控制水溫及水的含氧量。次日，取出成魚，收集魚卵，以新鮮的超純水清洗數(shù)次以除去未受精死卵及糞便等雜物，隨后放入人工海水中，于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)箱溫度為（290±10） ℃，選取健康發(fā)育的斑馬魚胚胎用于實(shí)驗(yàn)。

232預(yù)實(shí)驗(yàn)確定毒性范圍實(shí)驗(yàn)采用靜水實(shí)驗(yàn)法[6]，以96 h為1個(gè)試驗(yàn)周期，試驗(yàn)期間不換水。取健康斑馬魚胚胎，以10枚/孔置于24孔板中，各濃度設(shè)置3個(gè)平行組，1個(gè)空白對(duì)照組。醋甘遂活性部位各成分群采用人工海水溶解（均能溶于人工海水中），配制成不同濃度的一系列樣品（各成分群樣品濃度均為浸膏濃度），加入對(duì)應(yīng)孔中，每孔2 mL，均置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育。給藥后每隔24 h于體式顯微鏡下觀察并記錄斑馬魚胚胎的發(fā)育及死亡情況，4 d后得出各成分群96 h的全部死亡的最小濃度（LC100）和全部存活的最大濃度（LC0）。endprint

233LC50的測(cè)定依據(jù)各供試品預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的LC100和LC0范圍，按照幾何級(jí)數(shù)梯度設(shè)9個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組及1個(gè)人工海水對(duì)照組。各濃度設(shè)3個(gè)平行組，1個(gè)空白對(duì)照組。給藥后，每24 h觀察不同藥物濃度下魚卵的孵化及死亡情況，發(fā)現(xiàn)死亡及時(shí)取出，并記錄，至4 d后即實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算醋甘遂活性部位各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度（LC50）。采用SPSS Statistics 200軟件計(jì)算斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度（LC50）。

3結(jié)果

31UFLCQTOFMS定性分析

UFLCQTOFMS法得到的醋甘遂活性部位各成分群正離子模式下的總離子流圖見圖1。通過(guò)正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜的母離子峰及二級(jí)質(zhì)譜得到化合物準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量及相對(duì)應(yīng)的碎片峰信息，根據(jù)保留時(shí)間及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究[716]對(duì)母離子峰進(jìn)行歸屬，結(jié)合裂解規(guī)律最終推測(cè)出巨大戟烷型二萜類11個(gè)，假白欖烷型二萜類11個(gè)，見表1。成分群A檢測(cè)出化合物1～4；B中檢測(cè)出化合物1～10；C中檢測(cè)出化合物3～5，7，9，11～19；D中檢測(cè)出化合物20～22，各成分群的一級(jí)質(zhì)譜信息及二級(jí)碎片信息見表2。

甘遂的特征性化學(xué)成分為萜類成分，其中以二萜類為主，可分為巨大戟烷型（ingenane type）和假白欖烷型（jatrophane type）2類母核的化合物，其碎片離子大多以分子離子失去1個(gè)或多個(gè)中性羧酸分子為主[7]。巨大戟烷型二萜類成分如3O（2′E，4′Zdecadienoyl）5Oacetylingenol，其分子離子峰為m/z 563[M+Na]+，失去1分子或多分子羧酸分子產(chǎn)生[M-HOAc+Na]+ （m/z 503），[M-C9H15COOH+Na]+ （m/z 395）和[M-HOAc-C9H15COOH+Na]+（m/z 335）等離子碎片。假白欖烷型二萜類成分如kansuinin D/D1，在其各級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中，m/z 734，674，554分別對(duì)應(yīng)[M-HOAc+H]+，[M-2HOAc+H]+和[M-4HOAc+H]+。又如假白欖烷型二萜類成分kasuinin B/C，失去乙?；?、苯甲酰基以及CO，產(chǎn)生m/z 685，623，563，473等離子碎片。

32醋甘遂活性部位不同成分群對(duì)斑馬魚胚胎極性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

醋甘遂活性部位各成分群在96 h對(duì)斑馬魚胚胎的LC0和LC100經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到，見表3。

33醋甘遂活性部位不同成分群LC50的測(cè)定

各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的LC50見表4，表明各成分群毒性：B>C>A>D，成分群D在一定劑量范圍內(nèi)未表現(xiàn)出毒性。

34醋甘遂活性部位不同成分群的量毒關(guān)系

以藥液質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，斑馬魚胚胎的死亡率（%）為縱坐標(biāo)繪制醋甘遂活性部位各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的量毒關(guān)系圖。結(jié)果表明，醋甘遂活性部位成分群A，B及C對(duì)斑馬魚胚胎的毒性均呈明顯的量毒關(guān)系，見圖2。

4討論

甘遂作為峻下逐水之要藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》下品，中醫(yī)臨床采用醋炙以降低其毒性，但毒效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究的不完整性一直是制約其臨床安全有效應(yīng)用的重要因素之一。課題組前期研究表明，醋甘遂乙酸乙酯部位是其毒效部位[1718]，深入研究該活性部位有助于進(jìn)一步理解醋甘遂“有故無(wú)殞”的作用機(jī)制。模式生物斑馬魚基因有著與人類基因高達(dá)87%的同源性[1920]，且相比于小鼠及細(xì)胞等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)手段，具有高通量、給藥量少、低成本、易于觀察且重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸發(fā)展成為一種適用于生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)的模型[2122]，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于中藥毒性研究中[2326]。斑馬魚為體外受精，單次產(chǎn)卵量大，與小鼠相比，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量多，其結(jié)果也相對(duì)更加穩(wěn)定、可靠，且胚胎發(fā)育透明，便于觀察其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的孵化及發(fā)育情況，因此本實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚胚胎對(duì)醋甘遂活性部位各成分群所進(jìn)行的LC50測(cè)定，對(duì)后期各成分群的毒性研究具有一定的指導(dǎo)意義。

作為近年來(lái)新興的定性分析方法，UFLCQTOFMS因其高效的分離能力及精確的結(jié)構(gòu)鑒定能力，已被廣泛地應(yīng)用于中藥化學(xué)成分分析等研究中[27]，本研究中采用該方法對(duì)甘遂活性部位各成分群的化學(xué)成分進(jìn)行定性研究，得到了各成分群相對(duì)較全面的化學(xué)成分信息。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到成分群B對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性明顯大于成分群C，且毒性劑量范圍明顯小于成分群C，胚胎孵化明顯遲緩，表現(xiàn)出卵黃囊吸收延遲、囊腔腫大、肝臟及胃腺腸道發(fā)育不良、心腔腫大、脊柱彎曲、血液循環(huán)減緩等癥狀，表明成分群B對(duì)于斑馬魚胚胎有明顯的發(fā)育毒性。同時(shí)UFLCQTOFMS分析結(jié)果表明成分群B中主要含巨大戟烷型二萜類成分，成分群C中主要含假白欖烷型二萜類成分。文獻(xiàn)研究表明，假白欖烷型二萜類成分的細(xì)胞毒性較巨大戟烷型二萜類成分更小[2830]，綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成分群B與C之間毒性的差異可能是由于所含二萜類成分的差異性所致。因此，本文推測(cè)假白欖烷型二萜類成分可能為醋甘遂中更為低毒的活性成分，這為進(jìn)一步探究醋甘遂“有故無(wú)殞”的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)，且為后續(xù)研究提供了思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國(guó)藥典. 一部[S]. 2015：88.

[2]曹亮亮，王文曉，張橋，等. 醋甘遂瀉水逐飲功效活性部位篩選[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40 （18）：3655.

[3]曹亮亮， 王文曉， 張麗， 等. 基于“有故無(wú)殞”思想的醋甘遂毒性研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（16）：3249.

[4]彭蘊(yùn)茹， 韋英杰， 丁永芳， 等. 基于斑馬魚模型的藥物毒性研究進(jìn)展與中藥毒性研究新策略[J]. 中草藥， 2017， 48（1）：17.

[5]Westerf Ield M. The zebrafish book[M]. Eugene：Eugene University of Oregon Press， 1995.endprint

[6]GB/T 132671991. 水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚（斑馬魚）急性毒性測(cè)定方法[S]. 1991.

[7]劉悅， 劉志強(qiáng)， 李慧琳， 等. 傳統(tǒng)中藥甘遂根中二萜類化學(xué)成分的電噴霧質(zhì)譜研究[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 29（9）：1727.

[8]Zhang L， Shu X Y， Ding A W， et al. LCDADESIMSMS separation and chemical characterization of the inflammatory fraction of the roots of Euphorbia kansui [J]. Chromatographia， 2009， 70（5）：805.

[9]Li C F， Wang J H， Cong Y， et al. A new diterpene from the processed roots of Euphorbia kansui [J]. J Asian Nat Prod Res， 2008， 10（2）：101.

[10]Wang H Y， Wang J S， Luo J， et al. Isolation of ingenoltype diterpenoids from Euphorbia kansui by offline coupling of HPLCESIMSn and HSCCC[J]. Sep Sci Technol， 2012， 48（11）：1745.

[11]王立巖. 甘遂的化學(xué)成分及其生物活性的研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)藥科大學(xué)， 2003.

[12]Wang Y B， Li Y Y， Wang H B， et al. Chemical constituents from the roots of Euphorbia kansui [J]. Chin J Nat Med， 2007， 5（3）：182.

[13]Khiev P， Kim J W， Sung S J， et al. Ingenanetype diterpenes with a modulatory effect on IFNγ production from the roots of Euphorbia kansui[J]. Arch Pharm Res， 2012， 35（9）：1553.

[14]Jin W L， Jin Q， Jang H， et al. Jatrophane and ingenanetype diterpenoids from Euphorbia kansui， inhibit the LPSinduced NO production in RAW 264. 7 cells[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2016， 26（14）：3351.

[15]陳云利， 袁丹， 徐鑫， 等. 甘遂中麻風(fēng)樹烷型大環(huán)二萜類化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2008， 33（15）：1836.

[16]Pan Q， Fanny C F， Nancy Y， et al. Activity of macrocyclic jatrophane diterpenes from Euphorbia kansui in a TrkA fibroblast survival assay[J]. J Nat Prod， 2004， 67（9）：1548.

[17]曹亮亮， 王文曉， 張麗， 等. 醋甘遂不同提取部位對(duì)癌性腹水大鼠瀉水逐飲功效比較研究[J]. 中草藥， 2015， 46（17）：2593.

[18]黃海燕， 束曉云， 丁安偉， 等. 甘遂和醋甘遂醇提物及其不同極性部位的藥效和毒性研究[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2008， 17（17）：3.

[19]Barbazuk W B， Korf I， Kadavi C， et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes[J]. Genome Res， 2000， 10（9）：1351.

[20]Santosledo A， Jenny A， Marlow F L. Comparative gene expression analysis of the fmnl family of formins during zebrafish development and implications for tissue specific functions[J]. Gene Expr Patterns， 2013， 13（1/2）：30.

[21]梁愛華. 斑馬魚——一種可用于中藥藥效和毒性篩選的魚類模型[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2009， 34（22）：2839.

[22]賈順姬， 孟安明. 中國(guó)斑馬魚研究發(fā)展歷程及現(xiàn)狀[J]. 遺傳， 2012， 34（9）：1082.

[23]舒斌， 韋英杰， 張陸勇， 等. 采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 33（1）：35.

[24]楊雨婷， 何育霖， 張雪， 等. 廣藿香油及其主要成分對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的比較研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥， 2015， 24（21）：14.

[25]曹雨誕， 李征軍， 陳海鷹， 等. 甘遂不同炮制品及提取物對(duì)斑馬魚的急性毒性研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2013， 30（2）：140.

[26]張楷承， 曹雨誕， 姚芳， 等. 京大戟醋制前后對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2017，42（12）：2291.

[27]Yang M， Sun J， Lu Z， et al. Phytochemical analysis of traditional Chinese medicine using liquid chromatography coupled with mass spectrometry[J]. J Chroma A， 2009， 1216（11）：2045.

[28]李征軍. 甘遂化學(xué)成分及毒性評(píng)價(jià)研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)， 2012.

[29]Wang L Y， Wang N L， Yao X S， et al. Diterpenes from the roots of Euphorbia kansui and their in vitro effects on the cell division of Xenopus[J]. J Nat Prod， 2002， 65（9）：1246.

[30]Wang L Y， Wang N L， Yao X S， et al. Studies on the bioactive constituents in Euphorbiaceae， part 3. Diterpenes from the roots of Euphorbia kansui and their in vitro effects on the cell division of Xenopus （2）[J]. Chem Pharm Bull， 2003， 51（8）：935.

[責(zé)任編輯孔晶晶]endprint