重金屬Cu2+對四角蛤蜊的急性毒性及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

宮春光　殷蕊　孫桂清　于清海　王其增　崔健斌

摘要：在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應(yīng)和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，Cu²⁺對四角蛤蜊24、48、96h LC₅₀分別為13.4、7.34和4.32mg/L；安全濃度分別為0.13、0.07和0.04mg/L。通過對Cu²⁺暴露在不同濃度96h的四角蛤蜊肝臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，Cu²⁺對四角蛤蜊的肝臟組織結(jié)構(gòu)有明顯影響，肝臟的損傷程度隨著Cu²⁺濃度的增加而加深，2.59mg/L為四角蛤蜊肝臟解毒的閾值。

關(guān)鍵詞：重金屬；四角蛤蜊；急性毒性；肝臟

四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve）屬軟體動物門，瓣鰓綱，真瓣鰓目，蛤蜊科，是我國沿海地區(qū)一種重要的經(jīng)濟貝類，通常生活在含泥沙較多的潮間帶，在我國南北沿海均有分布，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，深受國內(nèi)外消費者的歡迎。近幾年，我國沿海地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展速度較快，隨之而來的是大量工業(yè)廢水和生活污水排人海洋，給海洋生態(tài)環(huán)境帶來極大的負(fù)擔(dān)，在諸多污染物中，重金屬對海洋環(huán)境的影響尤為顯著。重金屬隨沿岸徑流排入海中后，容易在沿海的底泥中沉積，而四角蛤蜊為生活在泥沙中的底棲生物，又具有移動性差的特點，因而最易受到重金屬的影響；重金屬污染物可以在海洋生物體內(nèi)或其某一組織中積累，通過生物富集和放大，直接或間接威脅人類的健康。在利用生物間的共生互補原理、運用生態(tài)學(xué)原理創(chuàng)建環(huán)境友好型養(yǎng)殖模式中，底棲貝類是一個重要的混養(yǎng)組合，通過貝類消耗掉其它養(yǎng)殖動物所排出的N，可以優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，同時增加養(yǎng)殖效益，例如牙鲆和四角蛤蜊的池塘生態(tài)混養(yǎng)。國內(nèi)外已進行過許多有關(guān)重金屬對魚類及底棲貝類的急性毒性研究，但有關(guān)重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應(yīng)和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。筆者研究了Cu²⁺對四角蛤蜊成貝的急性毒性效應(yīng)，得出了24、48和96h半致死濃度和安全質(zhì)量濃度；同時研究了暴露Cu²⁺不同濃度96h的情況下，對四角蛤蜊肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響。本實驗可為四角蛤蜊安全養(yǎng)殖和重金屬生態(tài)毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗對象為成體四角蛤蜊，產(chǎn)地河北省黃驊市。四角蛤蜊進入實驗室后，暫養(yǎng)5d，期間定期投喂球等鞭金藻（3011），連續(xù)充氣，每日換水一次，換水量100%，暫養(yǎng)水溫在（12±0.5）℃。暫養(yǎng)期間貝類日死亡率低于5%后進行實驗，實驗前1d停止投餌，選擇健康、反應(yīng)靈敏、個體均勻的四角蛤蜊隨機分組進行實驗，實驗貝類殼長（32.18±1.87）mm，殼高（28.23±1.36）mm，濕體質(zhì)量（9.98±1.32）g。

CuSO₄·5H₂O為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，含量≥99.0%，用超純水分別配制成含有Cu²⁺質(zhì)量濃度為10g/L母液，實驗時根據(jù)不同濃度進行稀釋。試驗用水為人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽區(qū)海生海水晶廠出品）+雙蒸水配制而來，鹽度27‰，pH8.30。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性預(yù)實驗 使用15L水槽，加入4L配制海水和適量藥物母液，混勻后放人10只四角蛤蜊，保持實驗水溫在（12±0.5）℃，自然光照，實驗期間不換水，不充氣，不投餌。每個預(yù)實驗濃度做一組平行試驗，同時設(shè)一個對照組，取實驗數(shù)據(jù)平均值。24h、48h和96h后觀察死亡情況，以多次刺激無反應(yīng)、雙殼張開、外套膜萎縮為判斷其死亡的標(biāo)準(zhǔn)進行計數(shù)。通過預(yù)實驗查明重金屬離子的不引起死亡的最大濃度（ILL）和最小100%致死濃度（LC₁₀₀）。

1.2.2 急性毒性實驗 經(jīng)預(yù)實驗，Cu²⁺對四角蛤蜊不引起死亡的ILL為0.76mg/L，LC₁₀₀為43.18mg/L。在此Cu²⁺實驗濃度范圍內(nèi)，按照等比級數(shù)設(shè)定11個濃度組，每組設(shè)3個平行，1個對照，每個水槽內(nèi)隨機放人10只四角蛤蜊，實驗條件與預(yù)實驗條件保持一致，24h、48h和96h后觀察死亡情況并及時清除死亡個體。實驗重復(fù)一次，最終數(shù)據(jù)取平均值。

計算平均死亡率，再換算成概率單位，計算出實驗藥液質(zhì)量濃度對數(shù)，求出概率單位與實驗藥液質(zhì)量濃度對數(shù)的回歸方程，求出各自的半數(shù)致死濃度（LC₅₀）；安全濃度為LC₅₀×AF，其中AF為應(yīng)用系數(shù)，對于穩(wěn)定且又易于在生物體內(nèi)積累的污染物，其系數(shù)多選在O.01～0.05范圍內(nèi)。本實驗中重金屬離子屬于難分解、積累性強的物質(zhì)，AF值取O.01。

1.2.3 肝臟組織切片的制備與觀察 取暴露不同濃度Cu²⁺96h的活體四角蛤蜊，解剖，取肝臟組織，用Bouin氏液固定、經(jīng)自來水沖洗、梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋等步驟；后進行切片，切片厚度5μm；采用蘇木精-伊紅染色法（H.E）染色，BK5000顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 中毒癥狀 不同實驗濃度下四角蛤蜊的中毒反應(yīng)有所不同。實驗開始24h內(nèi)，低于2.59mg/L濃度組的四角蛤蜊大部分都伸出了斧足和水管，而高于這個濃度組中的四角蛤蜊雙殼緊閉，其中高于13.03mg/L濃度組的部分個體黏液分泌明顯，最高濃度組的個體在24h全部死亡；24～48h內(nèi)，2.59mg/L濃度組中的四角蛤蜊縮回了斧足和水管，同時低于此濃度實驗組中的四角蛤蜊有少數(shù)伸出斧足，0.76mg/L濃度組的個體則幾乎全部伸出斧足，高濃度組則雙殼緊閉，刺激無反應(yīng)，水中漂浮大量粘絲，拿起四角蛤蜊，可見大量粘液掛在殼面上；48～96h內(nèi)，受試四角蛤蜊的中毒現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，出現(xiàn)外套膜脫落現(xiàn)象，高濃度組的死亡率接近100%，但0.76mg/L濃度組的個體則仍有部分個體伸出斧足，但相比對照組中的四角蛤蜊所伸出的斧足相對要小。總體上，Cu²⁺濃度越高，四角蛤蜊所排黏液就越多。中毒死亡的個體一部分雙殼張開，一部分雙殼緊閉，但幾乎均是外套膜、水管脫落。

2.1.2 急性毒性實驗結(jié)果 Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性實驗具體結(jié)果見表1。

Cu²⁺對四角蛤蜊的半致死濃度及安全濃度見表2。

2.1.3 Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

不同濃度Cu²⁺暴露96h對四角蛤蜊肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響見圖1-8。

2.2 分析

2.2.1 重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應(yīng)及毒性機理 本實驗在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環(huán)境下，研究了重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Cu²⁺對四角蛤蜊24、48、96hLC₅₀分別為13.43、7.34和4.32mg/L；安全濃度分別為0.13、0.07和0.04mg/L。王曉宇等研究了Hg²⁺和Cd²⁺對四角蛤蜊的急性毒性，96hLC₅₀分別為0.207和2.383mg/L，其中Cd²⁺的毒性比本實驗的Cu²⁺低，這與重金屬毒性的眾多研究報道趨勢（Hg²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺）不符；但王曉宇的實驗水溫為（15±0.5）℃，而本實驗水溫為（12±0.5）℃，而多數(shù)重金屬的毒性與水溫呈正相關(guān)；另外，Lussier等研究了幾種重金屬和氰化物對巴西擬糠蝦（Mysidopsis bahia）的急性毒性效應(yīng)，得到了各種重金屬對巴西擬糠蝦的96h半數(shù)致死濃度，研究發(fā)現(xiàn)毒性作用大小為Hg²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺。因而，這種現(xiàn)象還有待于進一步研究。

實驗開始后，低濃度組的四角蛤蜊除最初受到人為刺激緊閉雙殼外，2h后大部分個體都伸出了斧足和水管；而高濃度組中的四角蛤蜊則始終雙殼緊閉，說明其受到Cu²⁺刺激后以閉殼的方式進行避毒。Cu²⁺是生物體必需金屬元素，是許多氧化酶的組成成分，但過量的Cu²⁺進人生物體內(nèi)會催化氧化酶產(chǎn)生大量活性氧自由基團，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化；另外Cu²⁺可使多種酶類及活性因子失去活性，從而破壞生物體的酶系統(tǒng)，阻斷其各種生化反應(yīng)和新陳代謝活動，導(dǎo)致生物體死亡。

2.2.2 Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 雙殼貝類分布廣、遷移性差、能高度富集水中污染物，因而是生物監(jiān)測和毒理學(xué)最常被研究的群體之一。肝臟是四角蛤蜊的主要解毒和代謝功能器官，是重金屬Cu²⁺進入其體內(nèi)的主要富集部位，當(dāng)Cu²⁺進人體內(nèi)后會催化氧化酶產(chǎn)生大量活性氧自由基團而造成氧化損傷，一旦超過肝臟的解毒能力，就會對肝臟的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響，其組織病理學(xué)評價可用于鑒定Cu²⁺的污染程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響有明顯的濃度依賴性，Cu²⁺濃度越高，對肝臟的損傷就越明顯。當(dāng)暴露Cu²⁺0.76mg/L時，肝臟組織只有輕微損傷，表現(xiàn)為肝小管輕微腫脹（見圖1）；但暴露Cu²⁺2.59mg/L時，肝臟組織損傷明顯，表現(xiàn)為肝小管上皮細(xì)胞和胃粘膜層壞死、明顯脫落（見圖5）；而暴露Cu²⁺5.79mg/L時，肝臟組織則出現(xiàn)了大范圍壞死，留下大面積壞死區(qū)（見圖7）；暴露Cu²⁺8.69mg/L時，肝臟組織大范圍壞死后已經(jīng)完全失去消化腺的結(jié)構(gòu)，只有部分肝小管留有輪廓（圖8），此時四角蛤蜊的肝臟已完全失去其生理功能。高于8.69mg/L濃度組的四角蛤蜊在96h前已全部死亡，因此沒有取樣切片。從實驗結(jié)果可以看出，Cu²⁺2.59mg/L濃度暴露96h時達(dá)到了四角蛤蜊肝臟解毒的閾值，高于此濃度會導(dǎo)致肝臟逐漸失去其代謝、解毒生理功能。

（收稿日期：2016-03-08）