3種藥用作物對煙草黑脛病菌的抑菌效果研究

何大敏 陳陽 楊水平 張雪 趙建 莫靜靜 張東艷 趙新梅 陳大霞 丁偉

[摘要]煙草黑脛病是由疫霉菌侵染引起的最具危害的土傳病害之一，為尋找該病的控制方法，該試驗采用菌絲生長速率法，研究了玄參、川明參、半夏等作物莖葉根系提取物、根系分泌物以及提取物與分泌物組合對煙草黑脛病的抑菌效果，結果表明：①玄參、川明參、半夏的莖葉和根系提取物對煙草黑脛病菌有不同程度的抑制作用，且隨提取物濃度增大而增強；其中，玄參抑菌活性最強，05 g·mL-1時莖葉、根系提取物抑菌率分別達7488%，6927%；川明參與半夏抑制效果相對較差；川明參莖葉和根系提取物組合后，有明顯增益效應。②玄參、川明參、半夏根系分泌物對煙草黑脛病菌均表現(xiàn)出一定的抑菌性，隨濃度增大而增強；抑菌強度為川明參>玄參>半夏。③提取物與根系分泌物組合的抑菌性，玄參、川明參相近而強于半夏，均介于各自提取物與根系分泌物之間。玄參、川明參具有防控煙草黑脛病的應用潛力。

[關鍵詞]煙草黑脛病菌； 玄參； 川明參； 提取物； 根系分泌物； 抑菌性

Antifungal effects of three medicinal crops on Phytophthora nicotianae

HE Damin1，2， CHEN Yang1， YANG Shuiping1*， ZHANG Xue3，4*， ZHAO Jian2， MO Jingjing2，

ZHANG Dongyan1， ZHAO Xinmei1， CHEN Daxia4， DING Wei1

（1. College of Resources and Environment， Southwest University， Chongqing 400715， China；

2. Zunyi Subsidiary of Guizhou Tobacco Company， Zunyi 563000， China；

3. Chongqing Medical and Pharmaceutical College， Chongqing 401331， China；

4. Chongqing Academy of Chinese Material Medica， Chongqing 400065， China）

[Abstract]Tobacco black shank is one of the most harmful soilborne diseases infected by Phytophthora parasitica In order to probe the control method to this disease， in this study， the mycelial growth rate method was employed to investigate the antifungal effects of extracts from stemleaf and root， root exudates， and their combination of Scrophularia ningpoensis， Chuanmingshen violaceum and Pinellia ternata The results showed that： ①Stemleaf and root extracts of S ningpoensis， C violaceum and P ternata exhibited different antifungal activities， and the inhibition increased with the increase of extract concentration The antifungal effect of S ningpoensis extracts at 05 g·mL-1 was the strongest than other medicinal plants， the inhibition rate of steamleaf and root extracts reached 7488%， 6927%， respectively The inhibitory effect of C violaceum and P ternata was relatively lower， however， there is a significant gain effect after combination of steamleaf and root extracts of C violaceum ②The root exudates of S ningpoensis， C violaceum and P ternata showed fungistasis to Phytophthora nicotianae， and fungistasis was enhanced with the increase of root exudate concentration The antifungal effect in the order of C violaceum > S ningpoensis > P ternata ③The antifungal activity of combination of extract and root exudate from S ningpoensis was similar with the effect of C violaceum， they were both stronger than P ternata， and the antifungal activity for three combination were located between the antifungal activity of their extracts and root exudates S ningpoensis and C violaceum can be potentially applied to prevent and control the tobacco black shankendprint

[Key words]Phytophthora nicotianae； Scrophularia ningpoensis； Chuanmingshen violaceum； extract； root exudate； antifungal

藥用作物和煙草Nicotiana tabacum L都是我國重要的經(jīng)濟作物，但是由于耕地的有限性及行業(yè)分割，連作在我國十分普遍[1]。大部分藥用作物[2]和煙草具有嚴重的連作障礙，連作使土壤中的病原微生物大量繁殖，致使某些土傳病害的發(fā)生危害程度增加[34]，降低產(chǎn)量和品質[1，56]。輪（間/套）作可以有效緩解連作障礙[2，79]。

煙草黑脛病是由疫霉菌Phytophthora parasitica侵染引起的真菌性病害，疫霉菌危害茄科作物如茄、椒、番茄尤其煙草[10]，是世界上種植業(yè)最具毀滅性土傳病害之一[11]，在我國各煙區(qū)都有發(fā)生和蔓延[12]，連作加重該病的發(fā)生、流行及危害[4，13]。目前對煙草黑脛病菌P nicotianae的防治以化學防治為主[3，14]，但長期使用化學品，容易使病菌產(chǎn)生抗藥性，同時造成煙地污染，影響煙葉安全，也有報道用拮抗菌[1516]、輪作[1718]、植物提取物[1011，19]來防治的。篩選抗菌活性植物，利用其提取物加工制成植物源殺菌劑，或利用其與宿主作物輪（間/套）作而減輕病害，因對環(huán)境友好正廣泛受關注和重視[2025]。研究表明，大蒜Allium sativum含有大量含硫化合物，具有廣譜的抑菌活性，其提取物對煙草黑脛病菌和青枯病等具有明顯抑菌效果，有希望用作防治煙草黑脛病等植物保護劑的原料[2526]；大蒜根系分泌物也能抑制煙草黑脛病菌菌絲的生長，可利用其與煙草輪作降低煙草黑脛病在田間傳播[17]。

自然界的植物資源中許多都具有抑菌性，其中，藥用作物更具有開發(fā)潛力[2324]。藥用作物玄參Scrophularia ningpoensis、川明參Chuanmingshen violaceum、半夏Pinellia ternata生境與煙草相近，在西南山地煙區(qū)廣泛種植，它們的莖葉及根系都具有抗菌、抗炎的作用成分[2122，2728]，但均只收獲塊根作藥材，而莖葉等非藥用部位大部分生物量枯落田間，產(chǎn)生不同程度的自毒連作障礙[7，19，29]。將玄參、川明參、半夏與煙草進行輪（間/套）作，形成特定的種植模式，不僅可以避免各自的連作障礙，其抑菌成分或許還可用于控制煙地土傳病害。川明參輪作能顯著改善煙地土壤微生物種群結構，降低煙草青枯病菌Ralstonia solanacearum等致病微生物數(shù)量[18]。但有關玄參、川明參、半夏對煙草黑脛病菌的抑菌性尤其藥用作物根系分泌物抑菌性以及其輪（間/套）作控病利用均尚未見報道。本試驗模擬田間條件下，研究玄參、川明參、半夏的不同部位提取物、根系分泌物及其組合，對煙草黑脛病菌的抑菌效應，為煙草黑脛病菌控制和藥煙輪（間/套）作栽培以及藥用作物資源充分利用提供借鑒。

1材料

供試菌株：煙草疫霉菌P parasitica var nicotianae，分離自遵義煙草黑脛病患病煙株，由西南大學資源環(huán)境學院微生物實驗室提供。

供試植株：玄參、半夏、烤煙種子采自貴州道真縣，川明參種子采自四川閬中市，將上述作物種子播于本單位實驗苗圃，備用。

2方法

21培養(yǎng)基

燕麥培養(yǎng)基（OA），稱取30 g燕麥置于1 000 mL蒸餾水中，煮沸20 min，過濾，加入20 g瓊脂粉，融化后用蒸餾水補足至1 000 mL，分裝滅菌（121 ℃，30 min），備用。

22提取物制備

取苗圃中4—6月齡供試植物苗，分成地上莖葉、地下根系兩部分，除半夏鱗莖采用鮮樣外，其余40 ℃恒溫干燥箱中鼓風吹干至發(fā)脆，粉碎，過1 mm篩。各稱取粉碎后的7個植物樣品（玄參莖葉、玄參根系、川明參莖葉、川明參根系、半夏莖葉、烤煙莖葉、烤煙根系）50 g，每個樣品稱取3份，放入棕色廣口瓶中，加入1 000 mL的蒸餾水作為提取劑，攪拌使植物材料完全浸沒，置于常溫的條件下采用超聲波提取05 h，然后將廣口瓶置于避光處靜置24 h，再進行減壓抽濾，殘渣用同樣方法重復處理3次。合并濾液，用旋轉蒸發(fā)儀在40 ℃條件下減壓濃縮至最小體積，于50 mL量瓶中定容，即得到1 g·mL-1提取物的原液（即每毫升原液含有1 g樣品對應的提取物），密封，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

半夏鱗莖樣品則采用50 g干樣等量的鮮樣，研磨，過濾，超聲提取，其余步驟均相同。

23根系分泌物

取苗圃中2月齡供試植物健康均一幼苗，用蒸餾水將根系洗凈，用01%的HgCl2滅菌10 min后，移栽到250 mL的航空杯中，以泡沫板固定，加入Hoagland營養(yǎng)液，至淹沒幼苗根部，每杯3株，每種植物4個重復，每3 d更換營養(yǎng)液。3周后，取出幼苗，用蒸餾水沖洗根部，移栽到另一航空杯中，加蒸餾水至淹沒根部。杯口用塑料薄膜遮擋，防止外來菌污染，同時也減少蒸發(fā)量。每2 d收集1次含有根系分泌物的蒸餾水，共收集3次，收集結束后稱量植物鮮根重。合并收集的根系分泌物溶液，過濾，在35 ℃下旋轉蒸發(fā)減壓濃縮至最小體積，根據(jù)鮮根重，用蒸餾水定容成1 g·mL-1的原液（即每毫升原液含有1 g鮮根對應的根系分泌物）。

24濃度設置

將上述22項中的莖葉、根系提取物原液分別稀釋至005，01，025，05 g·mL-1，將23中的根系分泌物原液分別稀釋至01，02，04，06 g·mL-1。莖葉、根系提取物組合用025 g·mL-1質量濃度按體積比1∶1配制，2種提取物與根系分泌物組合用025 g·mL-1的提取物組合液和04 g·mL-1的根系分泌物按體積1∶1配制。endprint

25抑菌性測定

采用菌絲生長速率法[30]。將OA培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿，冷卻凝固后，在無菌操作下取2 mL提取物、根系分泌物稀釋液滴加至培養(yǎng)基表面，涂勻，以加2 mL滅菌水作為CK，每個處理重復3次。待稀釋液浸入培養(yǎng)基表面后，在平板中央接入直徑05 cm的黑脛病菌餅（用直徑05 cm打孔器在培養(yǎng)的黑脛病菌菌落邊緣同一圓周上打孔而得），每個皿1個菌餅，密封，隨機擺放于恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃暗黑培養(yǎng)6 d，期間每隔24 h用十字交叉法測定菌落直徑。記錄并計算生長抑制率：生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

26數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和DPS進行統(tǒng)計分析。

3結果與分析

31幾種作物提取物對煙草黑脛病菌的抑菌效應

311提取物抑菌時間效應玄參、川明參、半夏及煙草的提取物在濃度01 g·mL-1時對煙草黑脛病菌的抑制效應見圖1。玄參、川明參、半夏3種作物地上、地下部分提取物都有明顯的程度不同的抑菌效應，隨培養(yǎng)時間增加而下降，降幅不一，至第4～6天趨于穩(wěn)定。不同作物存在較大差異，同種作物不同部位也存在一定差異。玄參在6 d期間內(nèi)抑制率最高，莖葉略高于根系，玄參莖葉在第1天抑制率為5521%，最高，第6天為4141%，降幅249%。其次為川明參，莖葉高于根系，隨時間緩慢降低，最后趨于穩(wěn)定。半夏鱗莖初期有較高抑菌效果，抑菌率介于玄參根系與川明參莖葉之間，但迅速下降，降幅861%，至第4天有所回升并趨于穩(wěn)定；半夏莖葉初期抑菌效果不明顯，后期有所上升。

312提取物抑菌濃度效應玄參、川明參、半夏3種作物不同濃度提取物在培養(yǎng)6 d后的抑菌結果見表1，在試驗濃度范圍內(nèi)（005 ～05 g·mL-1），各作物提取物對黑脛病菌的抑制率，隨濃度增大而上升并逐漸趨于穩(wěn)定。不同作物間存在較大差異，總體抑菌強度為玄參>川明參>半夏；在05 g·mL-1下，玄參莖葉、根系提取物的抑制率分別達7488%，6927%。各作物不同部位間差異相對較小，總體而言，玄參莖葉略高于根系且低濃度下顯著，川明參高濃度下莖葉顯著高于根系，半夏鱗莖略高于莖葉但都很低。

32幾種作物根系分泌物對煙草黑脛病菌的抑菌效應

321根系分泌物抑菌時間效應玄參、川明參、半夏及煙草4種作物根系分泌物對煙草黑脛病菌的抑制率隨時間變化情況見圖2。玄參、川明參的根系分泌物有比較高的抑制效果，尤其在初期，但隨時間增加抑制率下降，第3天開始趨于平緩；在前期，玄參抑菌效果強于川明參，后期川明參強于玄參。半夏分泌物也表現(xiàn)出一定抑制效果，但遠低于玄參、川明參。煙草則相反，其根系分泌物表現(xiàn)出一定的促進效應，尤其在初期。

322根系分泌物抑菌濃度效應川明參、玄參、半夏3種作物根系分泌物對煙草黑脛病菌抑制的濃度效應見圖3，在試驗質量濃度范圍內(nèi)（01～06 g·mL-1），抑制作用隨著濃度增大而增強。作物抑制作用強弱依次為川明參、玄參、半夏，川明參在04～06 g·mL-1時趨于穩(wěn)定，而玄參在04 g·mL-1時達到最高，而后下降。

33提取物與分泌物組合的抑菌效應

331作物不同部位物提取物組合效應在025 g·mL-1質量濃度下，莖葉與根系提取物的組合對煙草黑脛病菌抑制效果見表2，玄參、川明參抑制率遠高于半夏，三者相差顯著。比較各作物組合部位發(fā)現(xiàn)，玄參、半夏的組合效果都介于其莖葉和根系之間，而川明參（5237%）遠高于其莖葉（3667%）、根系（2633%）單劑抑菌率，具有明顯的組合增益效應。

332提取物與根系分泌物組合效應提取物與根系分泌物組合效果，玄參、川明參差異不顯著，但二者顯著高于半夏，見表2。相較于提取物和根系分泌物，各作物組合抑制率介于各自提取物（含莖葉、根系及組合）和分泌物之間。

4討論

利用植物的抗菌活性部分或提取其有效成分，以及分離純化的單體物質加工而成的用于防治植物病害的植物源殺菌劑，被認為是化學合成殺菌劑最好的替代品，與化學合成殺菌劑相比，其來源于自然，對環(huán)境友好[23]。本研究中，玄參、川明參、半夏的莖葉和根系提取物對煙草黑脛病菌都有程度不同的抑制作用，玄參抑菌活性最強，在05 g·mL-1時莖葉和根系分別達7488%，6927%，具有開發(fā)殺黑脛病菌菌劑的潛力；川明參和半夏抑菌活性相對較低，開發(fā)潛力不大，但川明參莖葉和根系組合的抑菌率能達到5237%，遠較莖葉和根系單劑高，組合增益效應顯著。提取劑影響植物提取物抑菌性的效果，研究表明，五倍子Galla chinensis、金銀花Lonicera japonica Thunb、大青葉Isatis indigotica、穿心蓮Andrographis paniculata、蒲公英Taraxacum mongolicum等乙醇提取物對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和大腸桿菌Escherichia coli的抑菌性要強于水提物[31]，大蒜乙醇提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用優(yōu)于大蒜水提物[25]，這提示，若采用乙醇等更有效的提取劑，3種藥用植物抑菌活性或許更強。但它們起作用的活性成分，有待進一步研究。

利用提取物中抗菌活性成分的另一種方式是將抗菌植物與宿主作物（煙草）進行輪（間/套）作。相比開發(fā)植物源殺菌劑，輪（間/套）作更簡便、直接、有效，成本更低，更能使抗菌植物資源得以充分利用。輪（間/套）作下，藥用作物株體中抑菌活性成分通過雨霧淋溶直接進入土壤，而不需要提取、加工等制藥環(huán)節(jié)。同時，輪（間/套）作下，本研究中3種藥用作物僅塊根或鱗莖收獲帶走，株體的大部分非藥用部分（尤其玄參、川明參每畝以噸計的莖葉和根系）被留下，即使活性成分含量低不易加工提取，在生長過程中葉枯落田間時或莖葉還田后，都可經(jīng)淋溶持續(xù)進入土壤而發(fā)揮抑菌效力，作用時間長，數(shù)量上遠多于一般田間農(nóng)藥施用量而作用強度大。輪（間/套）作還增加田間土壤有機物的多樣性和數(shù)量，調節(jié)和改善土壤微生物種群結構，增加微生物多樣性，間接控制病原微生物[1719]。從這個意義看，3種作物輪（間/套）作配置控制煙草黑脛病的利用潛力，遠優(yōu)于開發(fā)植物源殺菌劑。endprint

根系分泌物為輪（間/套）作控制或減輕病害提供了另一物質來源。植物生長過程中通過根系向周圍土壤環(huán)境分泌釋放大量各種有機物質，其數(shù)量通常情況下可達到植物光合固定碳的20%左右，部分植物如禾谷類植物可可高達40%以上[32]。根系分泌物在土壤中發(fā)揮著復雜而獨特的化學、生物、生態(tài)作用：分泌物中的化感物質會影響植物自身（自感）和其他植物（他感）的生長發(fā)育，而其中有機酸通過活化土壤養(yǎng)分而加強作物營養(yǎng)吸收，根系分泌物為土壤微生物增添有機碳源而影響微生物生長，通過促進或拮抗而深刻塑造土壤微生物種群結構[18，3337]。作物特異性根系分泌物具有其特異的生理活性，其種類和數(shù)量受自身遺傳所主導[37]。小麥Triticum aestivum根系分泌物能抑制小麥全蝕病菌Gaeumannomyces gramini的菌絲發(fā)育[34]，大蒜根系分泌物能抑制黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f sp cucumerinum和西瓜枯萎病菌F oxysporium f niveum的菌絲生長及孢子萌發(fā)[35]，川明參根系分泌物能抑制煙草青枯病[18]。本研究中，玄參、川明參、半夏的根系分泌物對煙草黑脛病菌都有一定的抑制作用，其中，與提取物有所不同的是川明參抑菌性明顯強于玄參和半夏。同提取物一樣，川明參、玄參、半夏根系分泌物對煙草黑脛病菌的抑制作用也隨濃度增大而增強，在質量濃度01 g·mL-1時就表現(xiàn)出比較強的抑菌性，當質量濃度04 g·mL-1時抑制率接近高點，抑菌率增加了3倍。綜合考慮抑菌濃度和通常情況下作物根系分泌物的數(shù)量，可以推知，川明參、玄參、半夏與煙草輪（間/套）作利用它們的根系分泌物來控制煙草黑脛病是可行的，尤其是生物產(chǎn)量大的玄參和川明參。

提取物和根系分泌物的組合，可以模擬田間自然輪（間/套）作條件下，提取物和根系分泌物同時存在時的抑菌效果。玄參、川明參、半夏3種藥用作物的組合，對煙草黑脛病菌都有明顯的抑制效果，抑菌率分別為4502%，4752%，1933%，玄參與川明參相近而強于半夏。但3種作物的組合抑菌率介于其提取物與根系分泌物之間，并無明顯增益效應出現(xiàn)，可能因為提取物、分泌物中抑菌活性成分并不相同，組合之后各成分因溶液體積相對增加而濃度被稀釋一倍，也可能各抑菌成分相互影響導致抑菌性發(fā)生了不同程度的改變[38]，實際情況尚待進一步研究。

5結論

玄參、川明參對煙草黑脛病菌都有較強的抑菌性，半夏抑菌性不佳。其中，玄參的莖葉、根系提取物及其組合的抑菌性要優(yōu)于川明參和半夏，且莖葉強于根系；川明參根系分泌物的抑菌性要優(yōu)于玄參和半夏；川明參莖葉、根系提取物組合效果要遠高于單劑效果。玄參、川明參提取物有開發(fā)植物源殺菌劑的潛力；從提取物和根系分泌物兩方面利用看，它們與煙草輪（間/套）作配置防控煙草黑脛病的應用前景會更好。但作物株體中對煙草黑脛病菌起作用的具體有效成分，以及輪（間/套）作配置的田間實際效果等需進一步研究。

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[責任編輯呂冬梅]endprint