硫磺熏蒸知母的化學(xué)標(biāo)志物分析

鄭偉 王芳旭 孫欣光 康利平 趙陽 張潔 馬百平

[摘要]中藥知母經(jīng)硫磺熏蒸制備成含硫知母飲片，利用UPLCQTOFMSE結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺(tái)、主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA），分析并在線鑒定了硫磺熏蒸前后知母飲片中的16個(gè)主要的差異性成分，其中9個(gè)主要存在于熏蒸后知母飲片中；確定了熏蒸后知母飲片中的化學(xué)標(biāo)志物，為硫熏后新產(chǎn)生的亞硫酸酯化衍生物。同時(shí)利用UPLCQTOFMSE尋找主要化學(xué)標(biāo)志物——知母皂苷BⅡ亞硫酸酯（m/z 983）的手段，建立了知母飲片硫磺熏蒸的快速篩查方法，該方法便捷準(zhǔn)確，可作為知母質(zhì)量控制的有效輔助手段。這是首次分析鑒定了甾體皂苷類成分的亞硫酸酯化衍生物，并應(yīng)用這一方法篩查硫磺熏蒸的知母飲片。

[關(guān)鍵詞]知母； 硫磺熏蒸； UPLCQTOFMSE； 化學(xué)標(biāo)志物

Analysis of chemical markers in sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma

ZHENG Wei1，2， WANG Fangxu2， SUN Xinguang2， KANG Liping2，3， ZHAO Yang2， ZHANG Jie2， MA Baiping2*

（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China；

2. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China；

3. National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Sulfurcontaining Anemarrhenae Rhizoma decoction pieces were prepared by using sulfurfumigating procedure The difference components before and after sulfur fumigation in Anemarrhenae Rhizoma were analyzed and online identified by UPLCQTOFMSE combined with UNIFI informatics platform， principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLSDA） respectively As a result， 16 major differences components were identified， and among them， 9 components were mainly from sulfurfumigated samples The main chemical markers in sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma were identified as the sulfite derivatives newly produced after sulfurfumigating Meanwhile， UPLCQTOFMSE was used to find the main chemical marker anemarrhena saponin BⅡ sulfite （m/z 983） By using this method， a rapid screening method for sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma was established This was a convenient and accurate detection method for sulfur dioxide residue， and it can be used as an effective assistant method to control the quality of Anemarrhenae Rhizoma At the same time， it was the first time to identify sulfited derivatives of steroidal saponins， and screen the sulfurfumigated Anemarrhenae Rhizoma

[Key words]Anemarrhenae Rhizoma； sulfurfumigated； UPLCQTOFMSE； chemical markers

中藥知母為百合科多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥等功效[1]。知母中主要化學(xué)成分為甾體皂苷、黃酮、多糖等類型，其中根莖中總多糖含量高達(dá)30%[2]。由于其含有較高的多糖成分，新鮮知母藥材容易發(fā)霉變質(zhì)，對(duì)其藥材的儲(chǔ)存一直是一個(gè)值得關(guān)注的問題。

硫熏法是部分中藥材傳統(tǒng)加工養(yǎng)護(hù)方法之一，具有防蟲、防霉、殺菌和美化藥材外觀的作用[3]，因其價(jià)格低廉、操作方便仍被應(yīng)用于知母鮮藥材的前期加工中，近年來甚至被濫用[4]。研究表明硫磺熏蒸處理可導(dǎo)致部分藥材活性成分發(fā)生轉(zhuǎn)化[56]，甚至造成SO2或亞硫酸鹽殘留量過高，不但影響藥材質(zhì)量，而且存在安全隱患[79]。為了監(jiān)控藥材硫熏情況，2015年版《中國藥典》附錄收載了中藥材及飲片中SO2殘留量測定方法[1]。然而有研究顯示， 二氧化硫會(huì)隨著藥材貯藏時(shí)間的延長不斷逸失[10]。因此，尋找并確定硫熏藥材的化學(xué)標(biāo)志物變得尤為重要。endprint

超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQTOFMSE）技術(shù)具有高分辨和良好的結(jié)構(gòu)鑒定功能，作為中藥材化學(xué)成分快速鑒定的手段，已廣泛用于中藥材化學(xué)成分的表征及快速鑒定[11]，結(jié)合主成分分析（PCA）技術(shù)，可使中藥材及復(fù)方的質(zhì)量控制等研究更加便捷簡單[12]。

本論文應(yīng)用UPLCQTOFMSE結(jié)合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）對(duì)硫磺熏蒸前后的知母飲片進(jìn)行對(duì)比分析，觀察硫磺熏蒸對(duì)知母飲片化學(xué)成分的影響并鑒定其差異性成分，確定了硫磺熏蒸知母的標(biāo)志性成分，旨在為知母藥材的儲(chǔ)藏以及質(zhì)量控制方法和相關(guān)監(jiān)管法規(guī)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

11儀器與試劑Waters ACQUITYTM超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters公司，Milford，MA，美國）；SYNAPT G2質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters 公司，Manchester，英國）；UNIFI 181軟件、Umetrics EZinfo 30 軟件（Waters 公司，Manchester，英國）；色譜柱：Acquity HSS T3 C18（21 mm×100 mm，18 μm，Waters，愛爾蘭）；Sartorius BP211D 1/10萬電子天平（Sartorius公司，美國）；舒美KQ600E數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，江蘇）；SPE 固相萃取柱為Cleanert ODS C18（1 000 g·6 L-1，Agela，天津）；022 μm 微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）。甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher，美國）；甲酸（色譜純，Acros Co Ltd，NJ，美國）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏蒸餾水有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

12藥材11批知母藥材及飲片樣品，其中3批鮮知母藥材（1～3）于2016年11月分別采自河北安國不同種植區(qū)域，5批未經(jīng)硫熏知母飲片及3批硫熏知母飲片分別收集自河北安國藥材市場。所用樣本均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為百合科植物知母A asphodeloides的根莖及其飲片。

2方法

21硫磺熏蒸知母藥材的制備將3批鮮知母根莖切片，陰干。全部8批未經(jīng)硫磺熏蒸處理知母飲片各取100 g，用10 mL水浸潤05 h。硫磺熏蒸過程在真空干燥器中進(jìn)行，將10 g硫磺點(diǎn)燃灼燒至熔融發(fā)煙，轉(zhuǎn)移至干燥器底部，取知母飲片放入干燥器上層，以凡士林涂抹蓋口密閉容器，同時(shí)打開抽氣閥門，待硫磺燃盡立刻關(guān)閉抽氣閥門，硫熏6 h后，續(xù)加5 g硫磺點(diǎn)燃熏蒸10 h，后取出待用。

22供試品溶液制備8批未熏蒸知母飲片及11批熏蒸知母飲片樣品（編號(hào)1～19）分別粉碎后過40 目篩，各精密稱取藥材粉末10 g，置于具塞三角瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇40 mL，浸泡30 min 后超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻后經(jīng)定量濾紙濾過，濾液經(jīng)SPE 固相萃取柱萃取，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%乙腈洗脫至50 mL量瓶中并定容，經(jīng)022 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

23混合對(duì)照品溶液配制由于螺甾皂苷在甲醇水系統(tǒng)較易溶解，而呋甾皂苷在甲醇水系統(tǒng)易甲氧基化[13]，在乙腈水系統(tǒng)中完全溶解，故將呋甾皂苷溶解于乙腈水系統(tǒng)；其他類型化合物溶解于甲醇水系統(tǒng)。精密稱取芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷B及知母皂苷AⅢ各03 mg，知母皂苷BⅡ溶解于1 mL 30%乙腈，芒果苷溶解于1 mL 50%甲醇，知母皂苷B及知母皂苷AⅢ分別溶解于1 mL甲醇，制得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液200 μL，混勻既得。

24色譜條件色譜柱：Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3 色譜柱（21 mm×100 mm，18 μm）；流動(dòng)相：01%甲酸水溶液（A）乙腈（B）；梯度洗脫（0～05 min，5% B；05～30 min，5%～15% B；30～60 min，15%～20% B；60～100 min，20%～22% B；100～135 min，22% B；135～175 min，22%～38% B；175～210 min，38%～50% B；210～220 min，50% B；220～235 min，50%～85% B；235～256 min，85% B）；流速06 mL·min-1；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

25質(zhì)譜條件電噴霧電離離子源（ESI），離子化模式分為正、負(fù)離子，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣體為氮?dú)?，流?50 L·h-1，溫度為450 ℃。毛細(xì)管電壓為3 000 V，錐孔電壓為30 V，掃描范圍m/z 100～1 500。低能量掃描時(shí)trap 電壓為6 eV，transfer 電壓為4 eV；高能量掃描時(shí)，負(fù)離子模式：trap 電壓為40～60 eV，transfer 電壓為15 eV，正離子模式：trap 電壓為50～65 eV，transfer 電壓為15 eV。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用Leucineenk Ephalin 作校正液。

26UNIFI數(shù)據(jù)庫及分析方法的建立應(yīng)用UNIFI 181軟件的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)， 補(bǔ)充軟件自帶中藥數(shù)據(jù)庫中知母藥材的化學(xué)成分及相關(guān)信息，并導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件， 構(gòu)建知母化學(xué)成分專屬數(shù)據(jù)庫。分析方法設(shè)置中設(shè)定3D 峰檢測參數(shù)的強(qiáng)度閾值 （高能量為30計(jì)數(shù)， 低能量為200計(jì)數(shù)），加合離子峰的種類 （負(fù)離子模式為[M-H]-，[M+HCOO]-，正離子模式為[M+H]+，[M+Na]+）。

3結(jié)果

31非硫磺熏蒸知母與硫磺熏蒸知母化學(xué)成分對(duì)比分析采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析1批實(shí)驗(yàn)室硫磺熏蒸知母及3批市場收集的硫磺熏蒸知母，所得色譜圖見圖1，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室熏蒸知母與市場收集的熏蒸知母化學(xué)成分類似，可見實(shí)驗(yàn)室硫熏方法可模擬產(chǎn)地硫熏干燥方法。endprint

采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析非硫磺熏蒸知母及實(shí)驗(yàn)室硫磺熏蒸知母，并對(duì)8組相對(duì)應(yīng)的硫磺熏蒸知母及非硫磺熏蒸知母進(jìn)行PCA 分析，所得PCA 得分圖見圖2。二維PCA得分圖表明，硫熏知母與非硫熏知母化學(xué)成分差異較大。為了進(jìn)一步探尋區(qū)分硫磺熏蒸對(duì)知母的影響，采用正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）進(jìn)行處理，得到SPlot 圖，見圖3。選擇離散程度較大的點(diǎn)，即VIP 值大于25 的點(diǎn)進(jìn)行分析，這些點(diǎn)代表對(duì)兩者差異貢獻(xiàn)較大的成分，最終確定16個(gè)差異性成分（其中硫熏知母中9個(gè)，5個(gè)為新生成的含硫衍生物，非硫磺熏蒸知母中7個(gè)差異性成分），見表1。硫熏知母與非硫熏知母之間主要差異性成分為甾體皂苷類，并且硫磺熏蒸不但會(huì)導(dǎo)致藥材產(chǎn)生一定的含硫衍生物，同時(shí)也會(huì)引起藥材中化合物含量的變化。

快速分析非硫磺熏蒸知母及硫磺熏蒸知母，樣品BPI 色譜圖見圖4。將采集的Continuum的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到UNIFI軟件中，軟件自動(dòng)標(biāo)識(shí)經(jīng)處理后的可信數(shù)據(jù)， 給出保留時(shí)間、化學(xué)式、質(zhì)量數(shù)誤差、同位素匹配偏差， 標(biāo)識(shí)的高能量碎片數(shù)目等信息。根據(jù)保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)確證，即可確定相應(yīng)的色譜峰。

非硫磺熏蒸知母與硫磺熏蒸知母的16個(gè)差異性成分在負(fù)離子模式易產(chǎn)生[M-H]-加合離子峰，利用UNIFI 181軟件中的“Elemental Composition”計(jì)算工具，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的可能分子式。分子式確定為C45H76O19的色譜峰有9～11，根據(jù)與對(duì)照品保留時(shí)間相比較，確定色譜峰9為知母皂苷BⅡ。峰10，11裂解碎片與峰9一致，判斷其為知母皂苷BⅡ的異構(gòu)體，根據(jù)保留時(shí)間，及相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)[14]，確定色譜峰10為25R知母皂苷BⅡ，色譜峰11為25R，SofficinalisninⅠ。

分子式確定為C45H76O21S的色譜峰有5，6，色譜峰5在低能量負(fù)離子給出m/z 983454 5[M-H]-，負(fù)離子高能量給出m/z 821400 6，757441 7，595387 8和433333 6，表明此化合物連續(xù)裂解1分子SO2及3分子六碳糖，根據(jù)正離子高能量給出的特征碎片m/z 417336 5，273220 2，255215 7，推測色譜峰5為知母色譜峰4在負(fù)離子低能量給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 999456 3，高能量給出m/z 837399 9，675347 9，611369 0，表明此化合物在負(fù)離子高能量下，連續(xù)裂解2分子六碳糖及1分子SO2，在正離子高能量給出m/z 433343 4，289219 9，271206 8，253198 9的特征峰，根據(jù)文獻(xiàn)比對(duì)[14]，推測其為知母皂苷N亞硫酸酯。由于色譜峰3的相對(duì)分子質(zhì)量及裂解碎片與峰4一致，推測其為知母皂苷N亞硫酸酯的異構(gòu)體。峰12在負(fù)離子低能量給出m/z 821399 2的準(zhǔn)分子離子峰，利用軟件判斷其分子式為C39H66O16S，由于負(fù)離子高能量給出m/z 659345 2，497299 5，表明此化合物含有2個(gè)六碳糖，在正離子高能量觀察到m/z 417336 9，289215 3，271205 9，253197 3的特征碎片，推測色譜峰12為anemarrhenasaponin Ⅰ亞硫酸酯。

通過以上方法，利用這些差異性成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間及碎片離子與對(duì)照品及相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)[14]，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定結(jié)果見表1，其可能的結(jié)構(gòu)見圖6。

33硫磺熏蒸對(duì)知母中化學(xué)成分的影響通過硫熏知母及非硫熏知母差異性成分對(duì)比分析結(jié)果可知，知母經(jīng)硫熏后，新芒果苷減少，芒果苷含量增加，可能是由于硫磺在空氣中燃燒，與氧及水結(jié)合生成亞硫酸，亞硫酸與氧苷類成分發(fā)生水解反應(yīng)引起的含量變化[15]。對(duì)于皂苷類成分，經(jīng)硫磺熏蒸后，呋甾類成分主要呈減少趨勢，而螺甾類成分有一定增加。

實(shí)驗(yàn)室利用相同方法，硫磺熏蒸知母皂苷BⅡ及知母皂苷AⅢ的對(duì)照品發(fā)現(xiàn)，知母皂苷BⅡ經(jīng)硫熏后含量降低，且生成了相應(yīng)的亞硫酸酯衍生物，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[15]，可能的化學(xué)反應(yīng)見圖7，而知母皂苷AⅢ則無明顯改變。由此推測，知母中新生成的含硫衍生物可能是硫磺燃燒生成的亞硫酸與呋甾糖苷類成分中的C22位活潑醇羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，生成相應(yīng)的亞硫酸酯。

34硫磺熏蒸知母化學(xué)標(biāo)志物的確定采用所建立的UPLCQTOFMSE方法快速分析非硫磺熏蒸知母及硫磺熏蒸知母，樣品BPI 色譜圖見圖4。可發(fā)現(xiàn)硫磺熏蒸知母藥材的化學(xué)輪廓明顯不同于非硫磺熏蒸知母藥材，其中色譜峰5只在硫磺熏蒸知母樣品中檢測到，表明硫磺熏蒸可以導(dǎo)致知母中的化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了新的成分，從而改變藥材的化學(xué)輪廓。通過比較發(fā)現(xiàn)8批硫磺熏蒸知母藥材均產(chǎn)生一致的硫熏特征色譜峰，由于圖3C中，色譜峰1顯示較高的質(zhì)譜響應(yīng)值，且知母皂苷BⅡ?yàn)橹钢械幕瘜W(xué)標(biāo)志物，故將峰5（知母皂苷BⅡ亞硫酸酯，m/z 983）作為硫磺熏蒸知母的化學(xué)標(biāo)志物。

4討論

硫磺熏蒸由于其成本低、操作方便且對(duì)藥材具有儲(chǔ)藏防蟲、防霉及漂白功效，仍被應(yīng)用于中藥材的初加工[17]。然而，硫磺熏蒸可導(dǎo)致部分藥材或其提取物中原有活性發(fā)生變化[1819]，更會(huì)改變藥效甚至產(chǎn)生安全隱患[7，2021]。盡管國家相關(guān)部門已頒布相關(guān)法規(guī)通過檢測二氧化硫殘留量來篩查硫磺熏蒸中藥材，然而，由于二氧化硫易揮發(fā)，在藥材加工、炮制或貯藏過程中二氧化硫殘留量會(huì)隨時(shí)間的增長而降低。因此，建立快速和高選擇性的硫磺熏蒸中藥材的篩查方法顯得尤為迫切。

本研究首次利用UPLCQTOFMSE分析知母飲片硫磺熏蒸前后化學(xué)成分的差異，鑒定了16個(gè)差異性成分，并首次確定了硫熏后知母中新生成的甾體皂苷類成分的亞硫酸酯化衍生物，與文獻(xiàn)報(bào)道中芍藥苷類成分及藁本內(nèi)酯類成分經(jīng)硫熏后產(chǎn)生相應(yīng)的亞硫酸酯類似[19，22]，補(bǔ)充了硫磺熏蒸對(duì)甾體皂苷類成分影響的研究。文獻(xiàn)報(bào)道，人參經(jīng)硫熏后人參皂苷不僅轉(zhuǎn)化為亞硫酸酯，更有部分轉(zhuǎn)化為人參皂苷硫酸酯[23]，然而在研究中并未發(fā)現(xiàn)硫酸酯化現(xiàn)象。硫磺熏蒸不僅帶來含硫衍生物的生成，同時(shí)伴隨著原有成分含量的改變，這些變化是否與化合物類型及具體結(jié)構(gòu)有關(guān)仍值得進(jìn)一步深入研究。endprint

本實(shí)驗(yàn)利用UPLCQTOFMSE建立了一種快速篩查硫磺熏蒸知母的方法，通過檢測硫磺熏蒸后的化學(xué)標(biāo)志物——知母皂苷BII亞硫酸酯（m/z 983），以判斷知母是否經(jīng)過硫磺熏蒸。與2015年版《中國藥典》中二氧化硫殘留檢測方法相比，該方法更加便捷準(zhǔn)確，可作為知母質(zhì)量控制的有效輔助手段。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]endprint