六味葛藍(lán)降脂片對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性及遺傳毒性的試驗(yàn)研究

朱智德++蔣林++羅宇東++陳洪濤

[摘要] 目的 開(kāi)展六味葛藍(lán)降脂片的遺傳毒性和急性毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其作為保健食品的毒理學(xué)安全性。 方法 根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法的要求，進(jìn)行急性經(jīng)口LD50測(cè)定，通過(guò)小鼠精子畸形試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)評(píng)價(jià)其遺傳毒性。 結(jié)果 六味葛藍(lán)降脂片的急性經(jīng)口LD50>30 g/kg；3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。 結(jié)論 在本試驗(yàn)條件下，六味葛藍(lán)降脂片急性經(jīng)口毒性屬無(wú)毒級(jí)，未見(jiàn)遺傳毒性作用。

[關(guān)鍵詞] 六味葛藍(lán)降脂片；急性毒性；遺傳毒性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R965.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）04（c）-0004-04

Study on the acute and genetic toxicities of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets in mice

ZHU Zhi-de1 JIANG Lin2 LUO Yu-dong1，3 CHEN Hong-tao1，3

1.Pharmaceutical Factory，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Adult Education College，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China；3.Key Laboratory，Generic Technology Development of Chinese Medicine Preparation in Guangxi Universities，Nanning 530001，China

[Abstract] Objective To determine the acute oral toxicity and genetic toxicity of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets. Methods The acute oral LD50 test was performed，and the genetic toxicity was evaluated by mouse sperm abnormality test，bone marrow micronucleus test and Ames test according to the requirements of the《health food inspection and evaluation of technical specifications》（formerly the Ministry of health in 2003 Edition） food safety toxicology evaluation procedures and test methods. Results The acute oral LD50 of Liuwei Gelan lipid-lowering tablets was greater than 30 g/kg.The genetic toxicity indicated by Ames test，micronucleus test of polychromatic erythrocytes in bone marrow and sperm shape abnormality test in mice was negative. Conclusion In our experimental condition，the acute toxicity of Liuwei Gelan lipid-lowering tablet is classified as non_toxic.Genetic toxicity is not found.

[Key words] Liuwei Gelan lipid-lowering tablets；Acute toxicity；Genetic toxicity

高脂血癥為臨床上的多發(fā)病及常見(jiàn)病，是引發(fā)脂肪肝、心腦血管疾病的重要病因之一。西藥降脂療效確切，但對(duì)人體的肝、腎等器官損害較大，因此臨床應(yīng)用范圍受到一定限制。祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治高脂血癥及心腦血管疾病等方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1-11]，中藥治療高脂血癥副作用小，復(fù)發(fā)率低，具有廣譜且多層次、多靶點(diǎn)、多途徑降脂的優(yōu)勢(shì)，研究并開(kāi)發(fā)降脂中藥及保健食品具有廣闊的市場(chǎng)空間。六味葛藍(lán)降脂片為廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(chǎng)擬開(kāi)發(fā)的具有輔助降血脂功效的保健食品。前期功效學(xué)試驗(yàn)研究[12-13]表明，六味葛藍(lán)降脂片具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動(dòng)脈硬化、保護(hù)肝臟、緩解體重增長(zhǎng)的功效。為評(píng)價(jià)產(chǎn)品的安全性，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）的要求，現(xiàn)進(jìn)行六味葛藍(lán)降脂片的急性經(jīng)口毒性及遺傳毒性作用試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品和受試菌株

六味葛藍(lán)降脂片由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(chǎng)生產(chǎn)，為棕褐色的片劑，產(chǎn)品批號(hào)：20130301，每片含生藥量7 g，按成人口服推薦用量（2片/次，2次/d）計(jì)算，折合劑量為100.0 mg/kg體質(zhì)量，試驗(yàn)前加無(wú)菌蒸餾水配制成相應(yīng)的劑量；試驗(yàn)菌株和肝微粒體酶（S9）由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供，試驗(yàn)前經(jīng)鑒定合格后使用。

1.2 主要儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、RE501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）、JY501電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）、XFS-280壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、101-1恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物來(lái)源

昆明種小鼠，清潔級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK桂2014-0002。

1.4 試驗(yàn)方法

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（原衛(wèi)生部2003年版）食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法以及相關(guān)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行試驗(yàn)[14-21]。

1.4.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 采用一次最大耐受量給予的方法，選擇昆明種清潔小鼠20只（體質(zhì)量18～22 g），雌雄各半，取受試樣品配制成500 mg/ml濃度溶液給小鼠灌胃（0.40 ml/20 g體質(zhì)量），每間隔4 h灌胃1次，灌胃3次，累積劑量達(dá)30 000 mg/kg體質(zhì)量。試驗(yàn)前小鼠禁食（16 h）不禁水，灌胃后每周稱(chēng)量小鼠體重1次，連續(xù)觀察14 d，記錄動(dòng)物的中毒癥狀及死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物并進(jìn)行大體解剖觀察，評(píng)價(jià)被檢物的急性毒性強(qiáng)弱。

1.4.2 Ames試驗(yàn) 采用平板摻入法，分加入多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠S9及不加入S9兩種情況。受試品用蒸餾水配制成濃度為0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 mg/ml的溶液，采用四株鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進(jìn)行試驗(yàn)。將0.10 ml受試物溶液、0.10 ml試驗(yàn)菌株和0.50 ml S9混合液（當(dāng)需要代謝活化時(shí)）混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中，37℃下培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照（用蒸餾水替代樣品）、自發(fā)回變對(duì)照（不加樣品，空白對(duì)照）和陽(yáng)性突變劑對(duì)照，以直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出回變菌落數(shù)的多少而進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。試驗(yàn)設(shè)8、40、200、1000、5000 μg/皿5個(gè)試驗(yàn)劑量，每個(gè)劑量做3個(gè)平行皿。試驗(yàn)在同樣條件下重復(fù)做2次。如在背景生長(zhǎng)良好條件下，受試回變菌落數(shù)增加1倍以上，即回變菌落數(shù)≥2×空白對(duì)照數(shù)，并有劑量反應(yīng)關(guān)系即可認(rèn)為該受試物為誘變陽(yáng)性。

1.4.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 采用30 h給受試物法，即2次給受試物間隔24 h，第2次給受試物后6 h，頸椎脫臼處死動(dòng)物。取昆明種小鼠50只（體質(zhì)量25～30 g），雌雄各半，將其隨機(jī)分成陰性對(duì)照（蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照（40 mg/kg體質(zhì)量）劑量的環(huán)磷酰胺]和3個(gè)受試物劑量組（2500、5000、10 000 mg/kg體質(zhì)量），每組10只小鼠。各組小鼠按相應(yīng)劑量（0.40 ml/20 g體質(zhì)量）灌胃，兩次給藥間隔24 h，第2次給藥后6 h頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，放入甲醇中固定，Giemsa應(yīng)用液中染色，用光學(xué)顯微鏡觀察并對(duì)微核進(jìn)行計(jì)數(shù)，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），并以含微核的PCE千分率計(jì)算微核率，同時(shí)計(jì)算PCE（每只小鼠計(jì)數(shù)200個(gè)）與成熟紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，試驗(yàn)結(jié)果微核率有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，即可確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 選擇50只6～8周齡的昆明種雄性小鼠（體質(zhì)量25～35 g），將其隨機(jī)分成陽(yáng)性對(duì)照（40 mg/kg體質(zhì)量）劑量的環(huán)磷酰胺]、陰性對(duì)照（蒸餾水）和3個(gè)受試物劑量組（2500、5000、10 000 mg/kg體質(zhì)量），每組10只小鼠。各組小鼠按相應(yīng)劑量（0.40 ml/20 g體質(zhì)量）灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)5 d，最后1次灌胃后第30天處死小鼠，取出兩側(cè)附睪的精子，用甲醇固定5 min，1%伊紅染色1 h，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算精子畸形率（每只小鼠檢查1000個(gè)完整的精子），用χ2檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)精子畸形陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)是畸形率至少為陰性對(duì)照組的倍量或差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，小鼠骨髓微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用泊松分布均數(shù)比較法，精子畸形試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六味葛藍(lán)降脂片對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

以30 000 mg/kg體質(zhì)量的樣品劑量（最大給藥量）灌胃小鼠后，小鼠生長(zhǎng)情況良好，未見(jiàn)有中毒癥狀，體重也未見(jiàn)異常，14 d觀察期動(dòng)物無(wú)死亡。試驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物解剖的大體觀察，主要臟器如心、肝、脾、胃、腎、肺、腸等未見(jiàn)明顯異常（表1）。樣品急性經(jīng)口毒性根據(jù)我國(guó)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，屬無(wú)毒級(jí)。

2.2 六味葛藍(lán)降脂片Ames試驗(yàn)結(jié)果

無(wú)論加入S9與不加入S9，對(duì)于四種試驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100、TA102，受試物的各劑量組回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)比較，均沒(méi)有增加1倍以上，也無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系（表2、表3），表明該受試物為誘變陰性。

陽(yáng)性對(duì)照：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2-氨基芴（劑量為10 μg/皿）；TA97-S9、TA102-S9采用敵克松（劑量為50 μg/皿）；TA100-S9采用疊氮鈉（劑量為1.5 μg/皿）；TA102+S9采用1，8-二羥基蒽醌（劑量為50 μg/皿）；TA98-S9采用柔毛霉素（劑量為6 μg/皿）。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

受試物各劑量組骨髓細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），陰性對(duì)照組的骨髓細(xì)胞微核率顯著低于環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。各組的PCE/NCE比值也處于正常的范圍內(nèi)，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性（表4）。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

受試樣品的陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，小鼠的精子畸形率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；樣品各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表5），表明該樣品對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)的結(jié)果為陰性。

3 討論

六味葛藍(lán)降脂片的主要成分為絞股藍(lán)、火麻仁、決明子、葛根、沙棘等藥食同源藥材，根據(jù)中醫(yī)藥君、臣、佐、使理論，方中的絞股藍(lán)、火麻仁為君藥，絞股藍(lán)益氣養(yǎng)陰，益脾補(bǔ)虛，而火麻仁潤(rùn)腸通便，用于血虛津虧，腸燥便秘；決明子為臣藥，能平肝、清熱明目，潤(rùn)腸通便；佐以葛根解肌退熱，升陽(yáng)透疹，生津止渴，沙棘消食化滯，活血散瘀；荷葉升發(fā)清陽(yáng)，化除濕濁；諸品配合，諸癥兼顧，相得益彰，共奏益氣健脾，升發(fā)清陽(yáng)，除濕化痰，降濁消脂之功。本品通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝功能，從而達(dá)到多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)整體協(xié)調(diào)降血脂的功能。本實(shí)驗(yàn)考察了六味葛藍(lán)降脂片對(duì)小鼠的急性毒性及遺傳毒性作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，該產(chǎn)品的三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)（小鼠精子畸形試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)）均為陰性，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)根據(jù)我國(guó)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)屬無(wú)毒級(jí)，表明六味葛藍(lán)降脂片是一種服用安全的保健食品。

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（收稿日期：2015-12-15 本文編輯：王紅雙）