首烏藤總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

王振吉，楊申明*，張光勇

（楚雄師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000）

首烏藤（Polygoni multiforiCaulis）又名夜交藤，為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥藤莖或帶葉藤莖[1]。它是一種藥食兩用植物，具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，臨床上主要用于治療失眠多夢、血虛身痛、肌膚麻木、風(fēng)疹瘙癢等病癥[2]。已有研究表明，首烏藤中的蒽醌類、黃酮類具有改善睡眠功效[3-5]。黃酮類化合物對人體無毒無害，具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗病毒等作用，在食品添加劑、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[6-8]。因此，研究首烏藤總黃酮的提取及生物活性，對提高首烏藤資源的綜合利用具有十分重要的意義。

目前，對首烏藤總黃酮的提取已有相關(guān)研究報道。潘佳偉等[9]用表面活性劑輔助提取首烏藤總黃酮，其得率為6.0%；肖揚等[10]用乙醇為溶劑提取首烏藤總黃酮，其提取率為21.35%；史俊燕[11]用乙醇為溶劑提取總黃酮，其提取率為3.19%。目前，對首烏藤總黃酮的提取主要采用有機溶劑，容易對環(huán)境造成污染，而針對首烏藤總黃酮的水提工藝及抗氧化性研究鮮見報道。

本研究以首烏藤為試驗材料，實驗室自制超純水為提取溶劑，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化超聲波輔助提取首烏藤總黃酮的工藝條件；同時，以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，對首烏藤總黃酮從清除1,1-苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH的能力來評價其抗氧化性，以期為首烏藤黃酮類物質(zhì)的深入研究及其在功能性食品等方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

首烏藤（Polygoni multifori）：采自雙柏縣妥甸，經(jīng)鑒定為蓼科植物何首烏干燥藤莖；蘆丁標準品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；DPPH、維生素C：昆山諾普森實驗室用品科技有限公司；超純水：實驗室自制；其他所用化學(xué)試劑均為分析純：天津化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1502型紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司；UPT-1-100L型優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；KQ520OB型超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；2代運邦多功能粉碎機：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SE40ZF電子天平：奧豪斯儀器有限公司；HH-S2S型恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取工藝流程

1.3.2 總黃酮含量測定

（1）蘆丁標準曲線繪制

以蘆丁為標準品，采用A（lNO）33-NaNO2比色法測定總黃酮含量[12]。以蘆丁標準溶液含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得蘆丁標準曲線線性回歸方程：y=10.382x-0.000 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 36。

（2）首烏藤總黃酮含量的計算

式中：C為供試品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)，M為首烏藤干粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 總黃酮提取工藝優(yōu)化單因素試驗

分別考察以下單因素的影響：（1）超聲功率分別為150W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W的條件下進行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超聲時間80 min、超聲溫度60 ℃；（2）確定超聲功率300 W，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90 ℃的條件下進行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超聲時間80 min；（3）確定超聲溫度60℃，分別在超聲時間20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min的條件下進行提取，超聲功率300 W、料液比1∶50（g∶mL）；（4）確定超聲時間100min，分別在料液比1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60（g∶mL）的條件下進行提取，超聲功率300 W、超聲溫度60℃。

1.3.4 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以首烏藤總黃酮含量為評價指標，以超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、料液比（D）為試驗考察因素，設(shè)計L（934）正交試驗探索最優(yōu)總黃酮提取工藝條件，因素及水平見表1。

表1 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for total flavonoids extraction technology optimization

1.3.5 首烏藤總黃酮抗氧化活性測定

將首烏藤總黃酮配制成0.0034mg/mL、0.0068mg/mL、0.013 6 mg/mL、0.027 2 mg/mL、0.054 4 mg/mL 5 種質(zhì)量濃度，分別測定其對DPPH·、·OH的清除率，同時，以維生素C為對照，評價其抗氧化性。

（1）DPPH·清除率測定

參照文獻[13-15]的測定方法。

（2）·OH清除率測定

參照文獻[16-17]的測定方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮提取工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖1 超聲波功率對總黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids

由圖1可知，隨著超聲功率在150～450W范圍內(nèi)的增大，首烏藤總黃酮含量先增大后減??；當(dāng)超聲波功率為300 W時，總黃酮含量達最大1.23mg/g；當(dāng)超聲功率＞300W之后，總黃酮含量有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是提高超聲波功率，能增加首烏藤細胞的破碎程度，使首烏藤總黃酮的溶出率升高。但是極端的增大超聲波功率會增加能耗，同時由于超聲波的強化和機械作用，可能會破壞生物活性物質(zhì)的分子鏈，造成已經(jīng)溶出的活性物質(zhì)分子的不正常降解[18-19]，降低生物活性。因此，確定適宜的超聲波功率為300 W。

2.1.2 超聲溫度對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖2 超聲提取溫度對總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction of total flavonoids

由圖2可知，隨著超聲溫度在40～90℃范圍內(nèi)的升高，首烏藤總黃酮含量先增大后減??；在超聲溫度為60℃時，總黃酮含量達最大1.24 mg/g；在超聲溫度高于60℃之后，總黃酮含量有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著超聲溫度的升高，分子運動速度加快，含量增大，但溫度過高，會破壞部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)并增加其他非黃酮類物質(zhì)溶出[20]，影響黃酮類物質(zhì)的生物活性和總黃酮含量。因此，確定適宜的超聲溫度為60℃。

2.1.3 超聲時間對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖3 超聲提取時間對總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction of total flavonoids

由圖3可知，超聲時間＜100 min之前，總黃酮含量隨超聲作用時間的延長而呈增大趨勢；當(dāng)超聲時間為100 min時，總黃酮含量達最大值1.25 mg/g；之后隨超聲時間的延長而總黃酮含量略有下降趨勢。這可能是在一定時間范圍內(nèi)，超聲波有利于首烏藤中水分的滲入和細胞壁的破碎，增加了首烏藤中黃酮類物質(zhì)的溶出，但隨著提取時間的增加，會使黃酮類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)破壞[21]，從而影響總黃酮含量。因此，確定適宜的超聲時間為100 min。

2.1.4 料液比對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖4 料液比對總黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction of total flavonoids

由圖4可知，首烏藤總黃酮隨著提取溶劑用量的增大，總黃酮含量有增大的趨勢，當(dāng)料液比達1∶45（g∶mL）時，總黃酮含量達最大1.24 mg/g。之后若繼續(xù)增加溶劑用量，總黃酮含量基本不再增大，反而略有緩慢下降趨勢。這可能是因為料液比達到1∶45（g∶mL）時，黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量反而有利于首烏藤中其他雜質(zhì)的溶出，使得總黃酮含量下降。因此，確定適宜的料液比為1∶45（g∶mL）。

2.2 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal tests results for extraction technology optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experimental results

由表2可知，影響主次順序依次為B＞C＞A＞D，即超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率＞料液比。首烏藤總黃酮最佳提取工藝組合為A3B2C3D3，即超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間120 min，料液比1∶50（g∶mL）。由于最佳組合不在9組試驗內(nèi)，因此，在該條件下進行驗證性試驗，重復(fù)5次，測得首烏藤總黃酮平均含量為1.32 mg/g，大于正交試驗結(jié)果中的最大含量1.25mg/g，表明該方法重復(fù)性良好，適合于首烏藤總黃酮的提取。由表3可知，4個因素對首烏藤總黃酮含量均有顯著影響（P＜0.05）。

2.3 首烏藤總黃酮抗氧化性分析

2.3.1 清除DPPH·的能力評價

由圖5可知，首烏藤總黃酮在質(zhì)量濃度0.003 4～0.0544mg/mL范圍內(nèi)，隨著首烏藤總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH·的能力增強。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.0544mg/mL時，對DPPH·的清除率可達到74.36%，高于陽性對照維生素C對DPPH·的清除率65.22%，說明首烏藤總黃酮具有較強的清除DPPH·的能力。

圖5 不同質(zhì)量濃度首烏藤總黃酮對DPPH·的清除效果Fig.5 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion DPPH·

2.3.2 清除·OH的能力評價

從圖6分析可知，首烏藤總黃酮在質(zhì)量濃度0.003 4～0.0544mg/mL范圍內(nèi)，隨著首烏藤總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除·OH的能力也增強。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.0544mg/mL時，首烏藤總黃酮對·OH的清除率可達到62.29%，低于陽性對照維生素C對·OH的清除率80.42%，但首烏藤總黃酮仍然表現(xiàn)出較強的清除·OH的能力。

圖6 不同質(zhì)量濃度首烏藤總黃酮對·OH的清除效果Fig.6 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion·OH

3 結(jié)論

通過單因素試驗及正交試驗，優(yōu)化得到的首烏藤總黃酮最佳超聲提取工藝為超聲功率350W，超聲溫度60℃，超聲時間120min，料液比1∶50（g∶mL）。在此最優(yōu)條件下進行驗證性試驗，重復(fù)5次，得首烏藤總黃酮平均含量為1.32mg/g。

抗氧化性試驗結(jié)果表明，在首烏藤總黃酮的質(zhì)量濃度0.003 4～0.054 4 mg/mL范圍內(nèi)，隨著首烏藤總黃酮質(zhì)量濃度的增加其清除DPPH·和·OH的能力逐步增強。表現(xiàn)出較強的清除DPPH·和·OH的能力，說明首烏藤總黃酮具有較強的抗氧化活性。