氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中非法添加的石蠟

徐 芬，江 豐*，李詩瑤，程 慧，安 迪

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075）

石蠟分食品級和工業(yè)級，其中食品級石蠟只能在國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的使用范圍內(nèi)限量使用[1]，其廣泛應(yīng)用于食品包裝、水果涂層等或作為被膜劑、脫模劑、消泡劑限量使用在各種食品加工工藝中；工業(yè)級石蠟屬于非食用物質(zhì)，且含有重金屬、多環(huán)芳烴、硫化物等[2-3]，長期食用會嚴(yán)重影響人體的消化系統(tǒng)和免疫功能，對人們的身體健康十分不利。近年來，不法分子為了改善大米的感官特性，使其外觀更有光澤，用石蠟對大米進(jìn)行拋光，以掩蓋陳米原本灰暗霉變的色澤，而且拋光會損失陳米表層的微量元素和維生素，影響人體對營養(yǎng)素的吸收，從而影響人體的健康。因此有必要對大米中石蠟的檢測方法進(jìn)行深入研究，建立準(zhǔn)確、可靠的檢測方法，為大米質(zhì)量安全監(jiān)管提供參考，以保護廣大消費者的切身利益。

目前，已頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21309—2007《涂漬油脂或石蠟大米檢驗》[4]，只能對大米中的石蠟進(jìn)行簡單的定性分析，并不能定量。有文獻(xiàn)報道，可以采用物理法[5-6]、傅里葉紅外光譜法[7-9]、液相色譜法[9-11]、氣相色譜法[12-15]、氣相色譜質(zhì)譜法[14-20]等對石蠟進(jìn)行檢測。其中，物理法方法簡單，但靈敏度較低，不能定量；傅里葉紅外光譜法在前期需要大量樣品建立光譜庫；已有許多研究表明，高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法靈敏度高、選擇性好，可應(yīng)用于食品非法添加石蠟的檢測中，但各個方法中使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液、前處理方法、以及定性定量方法各不相同，且尚未完全解決食品中石蠟準(zhǔn)確定量的問題。本研究根據(jù)大米基質(zhì)的特性和石蠟的物理性質(zhì)，首次采用排除法，選用C24、C26、C28、C30、C33這5種烷烴進(jìn)行石蠟的定性與定量分析，建立了一種氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法，以期能快速、準(zhǔn)確檢測大米中石蠟。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售；正己烷（色譜純）：Fisher公司；石油醚（分析純）、硫酸（分析純）、8種切片石蠟（熔點分別為48～50℃、50～52℃、52～54℃、54～56℃、56～58 ℃、58～60℃、60～62℃、62～64℃）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME2002E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB25-12DTS超聲波雙頻清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；HEI-VAP/LR20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph GmbH公司；MS3basic渦旋儀：IKA；5810R離心機：德國Eppendorf公司；7890B-7000D串聯(lián)三重四級桿氣相色譜質(zhì)譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

石蠟標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取切片石蠟0.1000g于100mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為1.0 g/L。

石蠟標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取1.00 mL石蠟標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶，用正己烷定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為0.10 g/L。

1.3.2 試樣前處理

稱取20 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL石油醚，超聲浸提30 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于梨形旋蒸瓶中；再加入20 mL石油醚到提取瓶中，再超聲重復(fù)提取一次，離心，合并提取液。將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮近干，加入5.0 mL正己烷溶解，再加入0.5 mL硫酸溶液，渦旋振蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液過0.45 μm微孔濾膜后，待測。

1.3.3 儀器條件

HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（0.25μm×0.25mm×30m）；升溫程序：150℃保持1min，以10℃/min升溫至300℃，保持10min，以10℃/min升溫至310℃，保持10 min；載氣：氦氣，流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：無分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；離子源類型：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度：250℃；GC-MS接口溫度：280℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 石蠟的定性分析

根據(jù)熔點不同，熔點范圍在48～64℃的固體切片石蠟有8種不同的型號，但每種型號的主要組分均為正構(gòu)烷烴CnH2n+2的混合物。將質(zhì)量濃度為0.10 g/L的8種石蠟標(biāo)準(zhǔn)使用液分別用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃，通過結(jié)果分析，8種石蠟都含有C22～C33烷烴組分。由于8種石蠟標(biāo)樣的C22～C33烷烴組分在色譜圖上均有響應(yīng)，只是峰面積的大小不同，故在定性和定量分析實驗中，只需選擇一個中間熔點的石蠟作為標(biāo)準(zhǔn)品。本方法選取54～56℃熔點的石蠟配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，建立GC-MS/MS方法，C22～C33烷烴組分在色譜圖上的響應(yīng)如圖1所示。

分別對67批次大米樣品進(jìn)行分析，色譜圖上C22～C33處均有響應(yīng)的樣品為0批次，即67批次大米均為陰性樣品。通過篩選發(fā)現(xiàn)，67批次大米樣品在色譜圖上C22～C33處的響應(yīng)各不相同，但是在C24、C26、C28、C30、C33處定性和定量離子對均沒有干擾峰，則可以排除C22、C23、C25、C27、C29、C31、C32，最終選擇C24、C26、C28、C30、C33作為大米中石蠟的定性烷烴。因此在相同試驗條件下進(jìn)行樣品測定時，若色譜圖中C24、C26、C28、C30、C33處兩對離子都有出峰，則可判定大米樣品中含有非法添加的石蠟。

圖1 石蠟的SRM圖（C22～C33）Fig.1 SRM diagram of paraffin(C22-C33)

2.2 石蠟的定量分析

用選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）模式對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行分析時，每種烷烴選擇兩對離子進(jìn)行監(jiān)測，其中85.1→57這對離子由于靈敏度高，可以作為定量離子，C22～C33烷烴的保留時間及定量、定性離子對見表1。對定量離子進(jìn)行積分，不同熔點的石蠟的峰面積如表2所示。計算峰面積之和，通過不同物質(zhì)峰面積加和的最小相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法來挑選加和的峰，結(jié)果見表3。從表3可以看出，C24+C26+C28+C30+C33加和的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）為8.73%，可以滿足大米中石蠟的定量分析。

表1 C22～C33烷烴的保留時間及定量、定性離子對Table1 Retention time and quantitative and qualitative ion pairs of C22-C33alkanes

續(xù)表

表2 不同熔點石蠟的C24、C26、C28、C30、C33烷烴的峰面積Table2 Peak area of C24,C26,C28,C30and C33alkline of paraffins with different melting points

表3 不同烷烴峰面積加和及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table3 Relative standard deviation and peak areas summation of different alkanes

2.3 前處理條件的優(yōu)化

石蠟溶于石油醚、二甲苯、乙醚、苯、三氯甲烷、四氯化碳等非極性溶劑，不溶于水、甲醇等極性溶劑，考慮到試劑的安全性，該方法選擇石油醚作為提取溶劑。由于在提取時，石油醚同時也把樣品中的脂肪提取出來，上機前需去除雜質(zhì)。濃硫酸不與石蠟發(fā)生反應(yīng)，但是能氧化提取液中的脂肪，使石蠟與脂肪分離。在提取液中加入濃硫酸，離心分層后可以直接吸取有機層上機。已有文獻(xiàn)表明，從操作步驟和回收率等方面綜合比較，超聲提取明顯優(yōu)于索氏提取和加熱回流提取[14]，因此本方法采用超聲提取方式。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍

精密量取石蠟標(biāo)準(zhǔn)使用液適量，用正己烷制成質(zhì)量濃度分別為0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.06 mg/L、0.08mg/L的系列混合對照品溶液，在上述參數(shù)條件下，以標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，C24+C26+C28+C30+C33峰面積之和（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=1130.72x-10 145.56，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，結(jié)果表明，石蠟質(zhì)量濃度在0.01～0.08mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比測得該方法的檢出限為0.25mg/kg，以10倍信噪比測得該方法的定量限為0.75 mg/kg。

2.4.2 方法的回收率與精密度

在空白大米樣品中加入2.50 mg/kg、5.00 mg/kg、10.00 mg/kg 3個不同濃度的石蠟標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3的方法進(jìn)行提取分析，平行測定3次，結(jié)果見表4。大米基質(zhì)SRM圖和加標(biāo)樣品圖（加標(biāo)量10.00mg/kg）分別如圖2、圖3所示。

表4 加標(biāo)回收率、精密度實驗結(jié)果Table4 Results of standard recovery rate and precision experiments

圖2 大米基質(zhì)的SRM圖Fig.2 SRM diagram of rice matrix

圖3 大米的加標(biāo)樣品的SRM圖Fig.3 SRM diagram of adding standard sample of rice

由表4可知，加標(biāo)回收實驗的平均回收率分別為99.54%、93.38%、110.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）分別為12.11%、5.42%、8.31%，結(jié)果表明，本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足日常檢測的要求。

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中石蠟的方法。在樣品的前處理過程中，采用石油醚進(jìn)行超聲提取，加入濃硫酸凈化，有效提高了前處理效率，并且在本方法的儀器條件下，石蠟在較短的分析時間內(nèi)能得到良好的定性和定量結(jié)果。方法學(xué)實驗結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg，加標(biāo)回收率及精密度實驗的平均回收率為93.38%～110.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.42%～12.11%，相關(guān)系數(shù)R2為0.9980。方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可以滿足大米中石蠟的檢測需求，為打擊大米中非法添加石蠟提供了較準(zhǔn)確的檢測方法。