• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    烏梢蛇PCR快檢試劑盒的應(yīng)用與評價

    2020-10-15 09:24:34楊志業(yè)1竑1譚穎儀1昂1趙玉洋
    中國民族民間醫(yī)藥 2020年18期
    關(guān)鍵詞:烏梢蛇偽品重復(fù)性

    楊志業(yè)1 方 竑1 譚穎儀1 劉 昂1 趙玉洋 袁 媛

    1.廣東省藥品檢驗所,廣東 廣州 510663;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心,北京 100700

    烏梢蛇首載于南北朝《雷公炮炙論》[1-2],其后歷代本草多有記載,尤以明代李時珍《本草綱目》的記載最為詳盡,在我國已有幾千年的藥用歷史。歷版藥典規(guī)定烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇ZaocysdhumnadesCantor 除去內(nèi)臟的干燥體,具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。在現(xiàn)代臨床上,烏梢蛇廣泛用于治療皮膚瘙癢癥、白癜風(fēng)、牛皮癬等,如烏蛇止癢丸、白癜風(fēng)丸等[3]。烏梢蛇養(yǎng)殖成本較高,其商品主要為野生。隨著野生動物保護(hù)力度的進(jìn)一步加強(qiáng),烏梢蛇市場資源短缺,價格顯著上漲,為了牟取暴利,市場上出現(xiàn)了多種烏梢蛇偽品或混淆品[4]。

    傳統(tǒng)鑒別方法多以蛇頭、腹鱗、體背鱗、肛鱗及尾下鱗的特征作為主要鑒別點[5],但專業(yè)性要求高,而且經(jīng)去頭及鱗片后切制或酒制等炮制加工的飲片,鑒別難度大,無法滿足對市售烏梢蛇質(zhì)量控制的要求。中國藥典自2010年版始收載了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測法對烏梢蛇進(jìn)行鑒別,該法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合更為準(zhǔn)確、可靠[6-9]。但經(jīng)典PCR法對實驗環(huán)境、操作人員要求高,常規(guī)裂解過程耗時長、步驟多,至少需要3.5 h才能完成單次檢驗,無法適應(yīng)當(dāng)前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場運用的需要。為了獲得一種快速、準(zhǔn)確、高效的鑒別烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?,陳康等[10]通過對經(jīng)典PCR技術(shù)方法條件進(jìn)行優(yōu)化,采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA[11-12],提取過程無需使用離心機(jī),采用SYBR Green I熒光檢視[13]代替瓊脂糖凝膠電泳,無需使用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等儀器,將烏梢蛇PCR鑒別方法試驗時間縮短為30min,并研制為快檢試劑盒,為實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用奠定了基礎(chǔ)[14]。

    《中國人民共和國藥品管理法》第一百條中規(guī)定:“對有證據(jù)證明可能危害人體健康的藥品及其有關(guān)材料,藥品監(jiān)督管理部門可以查封、扣押,并在七日內(nèi)作出行政處理決定”,藥品質(zhì)量快速篩查方法及產(chǎn)品就是為了在監(jiān)督現(xiàn)場對樣品進(jìn)行快速分析,為藥品監(jiān)管部分及時提供“證據(jù)”,使對大眾身體或財產(chǎn)具有較大危害性的藥品得到提前控制。因此,為更好地開展現(xiàn)場快檢快篩,提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率,有必要對快檢產(chǎn)品進(jìn)行評價,為藥品監(jiān)管部門的選擇和使用提供依據(jù)。筆者通過分析烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢測限等性能指標(biāo),以及通過與“藥典法”對比,通過對136批市售樣品的檢測,考察試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率、假陽性率和假陰性率,進(jìn)而對烏梢蛇PCR快檢試劑盒進(jìn)行綜合評價,為同類快檢產(chǎn)品的評價提供案例。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 MM400珠式組織細(xì)胞破碎儀(RETSCH);BIORAD T100 PCR儀(BIORAD);eppendorf centrifuge5481 離心機(jī)(EPPENDORF);CAMAG REPROSTAR3薄層色譜照相裝置(CAMAG);Sub Cell GT水平電泳系統(tǒng) (BIORAD);Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System 全自動凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)。

    1.2 試藥 烏梢蛇PCR快檢試劑盒(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司); Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司);蛋白酶K(Promega 公司);Takara Ex Taq(Takara公司);DNA 分子標(biāo)記(100-1000bp,Takara公司);中國藥典2015年版烏梢蛇藥典法引物(Invitrogen公司合成); Agarose G-10瓊脂糖(Biowest);電泳緩沖液配制試劑EDTA、Tris為分子生物學(xué)級試劑,冰醋酸為分析純。

    樣品分為2類,一類是對試劑盒的性能進(jìn)行考察的樣品,樣品信息見表1,樣品均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷教授鑒定;另一類是對試劑盒的應(yīng)用進(jìn)行評價的樣品,收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等,包括市售烏梢蛇粉12批(編號為WS-F001~WS-F012);市售烏梢蛇飲片29批(編號為WS-S001~WS-S029);市售酒烏梢蛇42批(WS-J001~WS-J042);烏梢蛇藥材樣品3批(蛇鲞,編號為WSZ001~WSZ003);烏梢蛇偽品50批(編號為SL001~SL050),包括烏梢蛇常見偽品灰鼠蛇、滑鼠蛇、赤鏈蛇等。

    表1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能參數(shù)考察用樣品信息表

    2 方法

    2.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測 參考2015年版中國藥典三部生物診斷試劑盒的要求,對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性等性能進(jìn)行考察。

    2.1.1 特異性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各2批,灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各2批,分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

    2.1.2 檢測限 取WS1,分別取25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、4 mg、3 mg、2 mg、1 mg,分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

    2.1.3 重復(fù)性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各1批,灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各1批,在同一實驗室相同條件下,由3位實驗員采用同批次試劑盒分別進(jìn)行試驗,考察批內(nèi)重復(fù)性。同時由同一位實驗員分別采用3個不同批次試劑盒進(jìn)行檢測,考察批間重復(fù)性。

    2.1.4 穩(wěn)定性 隨機(jī)選取一個試劑盒,分別放置至溶解,再分別按保存條件保存,如此反復(fù)分別經(jīng)過 1、5、10次后,對試劑盒內(nèi)的DNA提取試劑,陰性對照、陽性對照進(jìn)行檢測。

    2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價 實驗人員分為2組,第一組采用中國藥典2015年版一部烏梢蛇項下收載的PCR法對136批樣品進(jìn)行測定賦值,測定好后進(jìn)行隨機(jī)編號,形成盲樣;由第二組采用PCR快檢試劑盒方法進(jìn)行測定,獨立匯總檢測結(jié)果。通過比較兩個實驗室的相應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果不一致的進(jìn)行復(fù)測,計算烏梢蛇PCR快檢試劑盒的陽性結(jié)果準(zhǔn)確率、陰性結(jié)果準(zhǔn)確率、假陰性率、假陽性率等指標(biāo)。

    2.2.1 烏梢蛇聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)藥典方法 取樣品0.5 g,充分研磨使成粉末,取0.1 g,照中國藥典2015年版一部烏梢蛇飲片【鑒別】項下操作,簡稱為“藥典法”。

    2.2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法分為A、B兩部分,A部分為提取總DNA所用的試劑及耗材,于2~8 ℃保存;B部分為PCR擴(kuò)增部分所用的試劑及耗材,于-20 ℃下保存,簡稱“快檢試劑盒法”。具體操作如下:①取10~25 mg樣品粉末,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DNA稀釋10倍作為供試品溶液。另分別取陽性對照品、陰性對照品各10~25mg,同法制成陽性對照品溶液和陰性對照品溶液。②PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增體系為25 μL,包含預(yù)混反應(yīng)溶液24 μL,待測樣品或陽性、陰性對照DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性1 min;再進(jìn)行28個循環(huán)反應(yīng),條件為88 ℃變性10s,62 ℃退火并延伸10 s。以無菌雙蒸水作為空白對照,取1 μL,同法擴(kuò)增得到空白對照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。③檢視方法:在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL溶液熒光染料(SYBR Green I)混勻,于紫外光(365nm)下檢測熒光。若顯示綠色熒光,則為陽性結(jié)果,即為烏梢蛇正品,反之則為陰性結(jié)果,即偽品。

    3 結(jié)果

    3.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測結(jié)果

    3.1.1 特異性 采用快檢試劑盒法,烏梢蛇正品、偽品檢測結(jié)果均與標(biāo)定值一致。如圖1所示。

    1.WS1; 2.WS2; 3.WS4; 4.WS5; 5.WS7; 6.WS9; 7.W1; 8.W2; 9.W4; 10.W5; 11.W8; 12.W9圖1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒特異性檢測結(jié)果

    3.1.2 檢測限 取WS1,按“2.1.2”進(jìn)行試驗,結(jié)果本試劑盒方法檢出限為4 mg。

    3.1.3 重復(fù)性 經(jīng)檢測,不同生產(chǎn)批號的快檢試劑盒測定的結(jié)果一致,不同操作人員的檢測結(jié)果亦一致,表明該試劑盒重復(fù)性良好。

    3.1.4 穩(wěn)定性 經(jīng)檢測,反復(fù)凍融1、5、10次后,經(jīng)試劑盒提取的供試品DNA測定結(jié)果一致,表明該試劑盒穩(wěn)定性良好。

    3.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價結(jié)果 分別采用“藥典法”和“快檢試劑盒法”對市售烏梢蛇樣品86批(包括烏梢蛇粉12批、烏梢蛇飲片29批、酒烏梢蛇樣品42批,藥材樣品3批)以及偽品飲片50批進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。結(jié)果不一致的批次經(jīng)復(fù)試,復(fù)試結(jié)果與初試結(jié)果一致。

    表2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒與藥典法結(jié)果匯總

    以“藥典法”檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果,測定陽性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為76批,陰性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為60批,“快檢試劑盒法”測得陽性結(jié)果為74批,陰性結(jié)果為62批,陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%,其中酒烏梢蛇樣品中有5個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陰性”,假陰性率為6.6%;陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%,其中烏梢蛇偽品樣品中有3個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陽性”,假陽性率為5.0%。

    4 討論

    4.1 試驗樣品的代表性 本研究用于考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價的樣品收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等16家,樣品規(guī)格有烏梢蛇粉、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇、烏梢蛇藥材等不同狀態(tài)的樣品,覆蓋了流通領(lǐng)域中各種使用規(guī)格,其中正品76批,偽品60批,總批次數(shù)136批,具有較好的代表性。其中烏梢蛇市售樣品不合格率分別為11.6%,表明市售烏梢蛇質(zhì)量情況不容樂觀,開展現(xiàn)場快篩快檢技術(shù)和產(chǎn)品的應(yīng)用以進(jìn)一步提高監(jiān)督效能十分必要。

    4.2 試劑盒的性能評價 經(jīng)對試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及檢測限等性能指標(biāo)進(jìn)行考察,結(jié)果表明該試劑盒的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,檢測限(最低取樣量)為4 mg。而“藥典法”在增加裂解時間的前提下,檢測限約為10 mg,因此與“藥典法”比較,該試劑盒的檢測限僅為“藥典法”的二分之一。對于烏梢蛇這類價格較為昂貴的品種,檢測限低既可減少檢測成本,同時對于常見的以拼接等制偽手段制成的樣品,可以多部位取樣及增加取樣個數(shù),進(jìn)一步提高監(jiān)督力度。

    4.3 試劑盒的應(yīng)用評價 經(jīng)采用快檢試劑盒對136批樣品進(jìn)行試驗,并與“藥典法”結(jié)果相比較,陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%,陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%,假陽性率為5.0%,假陰性率為6.6%,總體準(zhǔn)確率為94.1%。對假陰性結(jié)果和假陽性結(jié)果進(jìn)行分析,可能與檢視方法有關(guān),由于烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料(SYBR Green I),混勻后在紫外光燈(365 nm)下檢視,熒光較弱的情況下可能會影響主觀判斷,造成假陰性或假陽性的結(jié)果。在這種情況下,可采用“藥典法”進(jìn)行進(jìn)一步確證。與“藥典法”相比,該試劑盒取樣量少,簡便快速,使用成本低,作為快速檢測產(chǎn)品,烏梢蛇PCR快檢試劑盒可在監(jiān)督現(xiàn)場進(jìn)行大批量快檢初篩,為打擊烏梢蛇摻假、售假提供的有效的方法和工具,亦為監(jiān)督執(zhí)法贏得了時間。

    綜上,研究以中國藥典2015年版一部烏梢蛇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下收載的PCR鑒別方法作為對照,對烏梢蛇PCR快檢試劑盒的性能與應(yīng)用進(jìn)行評價。烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA,基于快速PCR技術(shù),以SYBR Green I熒光檢視代替瓊脂糖凝膠電泳,將檢測時間縮短至30min以內(nèi)。與藥典收載的PCR法相比,具有操作簡便、耗時短、檢測限低、經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)勢。通過對136批烏梢蛇樣品及常見混偽品進(jìn)行試驗,結(jié)果表明該試劑盒可用于監(jiān)督現(xiàn)場快速篩查,以提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率。本文亦為同類產(chǎn)品的應(yīng)用與評價提供了研究經(jīng)驗。

    猜你喜歡
    烏梢蛇偽品重復(fù)性
    化學(xué)分析方法重復(fù)性限和再現(xiàn)性限的確定
    昆鋼科技(2021年2期)2021-07-22 07:46:56
    冬沖夏草與摻偽品的鑒別研究
    烏梢蛇PCR快檢試劑盒的應(yīng)用與評價
    烏梢蛇的本草考證研究△
    近紅外光譜技術(shù)鑒別白及粉及其混偽品
    論重復(fù)性供述排除規(guī)則
    電子舌技術(shù)鑒別川貝母粉及其摻偽品
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:58
    翻斗式雨量傳感器重復(fù)性試驗統(tǒng)計處理方法
    水利信息化(2017年4期)2017-09-15 12:01:21
    應(yīng)用rbcL條形碼鑒別高良姜及其偽品大高良姜
    藥用動物烏梢蛇線粒體基因組全序列分析*
    亚洲av中文字字幕乱码综合| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美成人性av电影在线观看| av福利片在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产欧美日韩一区二区精品| 色综合站精品国产| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久9热在线精品视频| 婷婷六月久久综合丁香| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一本综合久久免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产乱人伦免费视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91麻豆av在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 麻豆成人av在线观看| 97热精品久久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲,欧美精品.| 女同久久另类99精品国产91| 综合色av麻豆| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 很黄的视频免费| 热99在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美在线一区亚洲| 露出奶头的视频| 亚洲av.av天堂| 免费看a级黄色片| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 深爱激情五月婷婷| 中文字幕av成人在线电影| 校园春色视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品人妻偷拍中文字幕| 深爱激情五月婷婷| 一个人看的www免费观看视频| 国内精品久久久久久久电影| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品人妻1区二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 如何舔出高潮| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久国产成人精品二区| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲国产高清在线一区二区三| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜亚洲福利在线播放| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久久久久久久大av| 亚洲精品亚洲一区二区| 黄色日韩在线| 国产色婷婷99| 精品不卡国产一区二区三区| 色综合婷婷激情| 午夜激情福利司机影院| 欧美激情在线99| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产色婷婷99| 在现免费观看毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 波多野结衣巨乳人妻| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 丁香六月欧美| 香蕉av资源在线| 国模一区二区三区四区视频| 黄色配什么色好看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产亚洲精品av在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产精品,欧美在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线观看午夜福利视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美一区二区亚洲| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成人美女网站在线观看视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲av美国av| 国语自产精品视频在线第100页| 级片在线观看| 久久久色成人| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品福利观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 精品一区二区三区人妻视频| av视频在线观看入口| 搞女人的毛片| 黄色丝袜av网址大全| а√天堂www在线а√下载| 日韩免费av在线播放| 18+在线观看网站| 日韩有码中文字幕| 亚洲国产欧美人成| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人特级黄色片久久久久久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 91麻豆av在线| 成年女人永久免费观看视频| 久久热精品热| 赤兔流量卡办理| 国产日本99.免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 成人三级黄色视频| 免费无遮挡裸体视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产视频内射| 中亚洲国语对白在线视频| 97超视频在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩国内少妇激情av| 欧美高清性xxxxhd video| 青草久久国产| 99视频精品全部免费 在线| 日韩中字成人| 国产免费一级a男人的天堂| 在线播放无遮挡| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产黄色小视频在线观看| 欧美bdsm另类| 欧美bdsm另类| 97超视频在线观看视频| 少妇的逼好多水| 90打野战视频偷拍视频| 制服丝袜大香蕉在线| а√天堂www在线а√下载| 久久亚洲真实| 日本一二三区视频观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产日本99.免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 免费黄网站久久成人精品 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 色吧在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 精品久久久久久成人av| 最近最新中文字幕大全电影3| 国内精品久久久久精免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日韩精品青青久久久久久| 深夜a级毛片| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产精品999在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 国产高清激情床上av| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲av成人av| 国产精品女同一区二区软件 | 在线观看免费视频日本深夜| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品在线美女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 美女大奶头视频| av在线蜜桃| 免费看a级黄色片| 午夜影院日韩av| 婷婷色综合大香蕉| 十八禁网站免费在线| 99在线人妻在线中文字幕| 最近中文字幕高清免费大全6 | 中文在线观看免费www的网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 在线观看舔阴道视频| 国语自产精品视频在线第100页| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品乱码一区二三区的特点| av天堂中文字幕网| 我的老师免费观看完整版| 国产男靠女视频免费网站| www.色视频.com| a级毛片a级免费在线| 久久6这里有精品| 在现免费观看毛片| 国产69精品久久久久777片| 免费观看的影片在线观看| 在现免费观看毛片| 在线看三级毛片| 亚洲美女搞黄在线观看 | 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 99久久99久久久精品蜜桃| 少妇高潮的动态图| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美日韩综合久久久久久 | 免费看美女性在线毛片视频| 免费观看人在逋| 露出奶头的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一个人免费在线观看电影| 亚洲av熟女| 两个人视频免费观看高清| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲av免费在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品av视频在线免费观看| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 少妇高潮的动态图| 免费av不卡在线播放| 亚洲美女黄片视频| 精品人妻1区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产午夜精品论理片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩欧美国产在线观看| 欧美zozozo另类| 久久性视频一级片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99国产精品一区二区蜜桃av| av女优亚洲男人天堂| 亚洲欧美激情综合另类| 最近在线观看免费完整版| 极品教师在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 又紧又爽又黄一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99久久99久久久精品蜜桃| 97碰自拍视频| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲美女黄片视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 午夜a级毛片| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 91在线观看av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 51国产日韩欧美| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 麻豆国产av国片精品| 两人在一起打扑克的视频| 国产黄a三级三级三级人| 日韩欧美在线二视频| 国产在线男女| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 哪里可以看免费的av片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美激情在线99| 日韩欧美精品免费久久 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久九九精品影院| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 观看免费一级毛片| 最后的刺客免费高清国语| 97热精品久久久久久| 精品久久久久久久久av| 九色成人免费人妻av| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高清激情床上av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 他把我摸到了高潮在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 嫩草影视91久久| 99riav亚洲国产免费| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲成人久久性| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品日产1卡2卡| 欧美日本视频| 成年人黄色毛片网站| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久9热在线精品视频| 一级av片app| 伦理电影大哥的女人| 久久国产乱子免费精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 美女高潮的动态| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美成狂野欧美在线观看| 男人舔奶头视频| 一本综合久久免费| 国产精品1区2区在线观看.| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品永久免费网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产v大片淫在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一进一出抽搐动态| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品免费久久久久久久清纯| 深爱激情五月婷婷| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一进一出好大好爽视频| 波多野结衣高清无吗| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久精品国产欧美久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 免费在线观看亚洲国产| 桃色一区二区三区在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 人妻久久中文字幕网| 国产久久久一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美最新免费一区二区三区 | 午夜激情欧美在线| 久久草成人影院| 国产在视频线在精品| 精品久久久久久成人av| 国产精品一区二区性色av| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲久久久久久中文字幕| ponron亚洲| 岛国在线免费视频观看| 免费观看精品视频网站| 激情在线观看视频在线高清| avwww免费| 男女视频在线观看网站免费| 国产探花在线观看一区二区| 久久国产乱子免费精品| 久9热在线精品视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产91精品成人一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 免费av观看视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美日本视频| 亚洲av成人av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 97碰自拍视频| 舔av片在线| 男女视频在线观看网站免费| 天天躁日日操中文字幕| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人av一区二区三区在线看| 乱人视频在线观看| 国产精品伦人一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机午夜十八禁免费视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产伦精品一区二区三区视频9| 能在线免费观看的黄片| 99热精品在线国产| 波多野结衣高清无吗| 久久人人爽人人爽人人片va | 久久精品综合一区二区三区| 一级av片app| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲黑人精品在线| 黄色配什么色好看| 老鸭窝网址在线观看| 看十八女毛片水多多多| 高清毛片免费观看视频网站| 1000部很黄的大片| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美日韩无卡精品| 内地一区二区视频在线| 国产欧美日韩一区二区三| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲avbb在线观看| 午夜视频国产福利| 搡老岳熟女国产| 久久久久九九精品影院| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧美三级亚洲精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美在线二视频| 12—13女人毛片做爰片一| 免费搜索国产男女视频| 日本成人三级电影网站| 日韩亚洲欧美综合| 国产高清视频在线播放一区| 国产亚洲欧美98| 精华霜和精华液先用哪个| 人妻久久中文字幕网| 黄色女人牲交| 精品一区二区三区av网在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人国产一区最新在线观看| 欧美激情在线99| 国产在线男女| 亚洲av成人av| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜老司机福利剧场| 在线播放无遮挡| 欧美午夜高清在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产高潮美女av| 欧美成人a在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 内射极品少妇av片p| 嫩草影院精品99| 精品一区二区三区av网在线观看| 草草在线视频免费看| 一级av片app| 国产男靠女视频免费网站| 欧美色视频一区免费| 亚洲成人久久爱视频| 国产老妇女一区| 舔av片在线| 日韩欧美在线乱码| 色综合亚洲欧美另类图片| 又爽又黄a免费视频| 日本五十路高清| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久香蕉精品热| 中国美女看黄片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 嫩草影院精品99| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 99精品久久久久人妻精品| 九九在线视频观看精品| 我要看日韩黄色一级片| av专区在线播放| 国产精品三级大全| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 免费电影在线观看免费观看| 老司机福利观看| 一区福利在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久久电影| 国产免费一级a男人的天堂| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美乱色亚洲激情| 欧美一区二区国产精品久久精品| 99久久精品国产亚洲精品| 特大巨黑吊av在线直播| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产精品久久视频播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久久久久中文| 国产精品一及| 日本三级黄在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩高清综合在线| 亚洲av二区三区四区| 久久九九热精品免费| 午夜免费成人在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久中文看片网| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲专区国产一区二区| 久久久国产成人免费| 亚洲美女黄片视频| 国产综合懂色| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 成年人黄色毛片网站| 最好的美女福利视频网| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲内射少妇av| 一本综合久久免费| 高清毛片免费观看视频网站| 国产男靠女视频免费网站| 高清在线国产一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费人成在线观看视频色| 日本a在线网址| 亚洲国产高清在线一区二区三| xxxwww97欧美| 亚洲片人在线观看| 欧美潮喷喷水| 一区二区三区四区激情视频 | 99久久精品热视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人亚洲精品av一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| aaaaa片日本免费| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久99热6这里只有精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 首页视频小说图片口味搜索| 少妇人妻一区二区三区视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品成人久久久久久| xxxwww97欧美| 亚洲精品在线观看二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 不卡一级毛片| 午夜免费激情av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 人妻久久中文字幕网| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 校园春色视频在线观看| 丁香欧美五月| 极品教师在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 又爽又黄a免费视频| 久久中文看片网| 看免费av毛片| 亚洲国产欧美人成| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 成人特级av手机在线观看| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩乱码在线| 国产精华一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 黄色一级大片看看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品一区二区免费观看| 国内精品久久久久精免费| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲欧美精品综合久久99| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲久久久久久中文字幕| 色吧在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久人人爽人人爽人人片va | 9191精品国产免费久久| 男女床上黄色一级片免费看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av免费高清在线观看| h日本视频在线播放| 亚洲黑人精品在线| 国产乱人伦免费视频| 十八禁人妻一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产单亲对白刺激| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产免费av片在线观看野外av| 在线播放国产精品三级| 午夜福利在线在线| 久久久久久久午夜电影| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一二三四社区在线视频社区8| 窝窝影院91人妻| or卡值多少钱| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕高清在线视频| av视频在线观看入口| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产精品成人综合色| 国语自产精品视频在线第100页| 97热精品久久久久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 美女 人体艺术 gogo| 欧美在线黄色| 日本一本二区三区精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 禁无遮挡网站| 12—13女人毛片做爰片一|