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    烏梢蛇PCR快檢試劑盒的應(yīng)用與評價

    2020-10-15 09:24:34楊志業(yè)1竑1譚穎儀1昂1趙玉洋
    中國民族民間醫(yī)藥 2020年18期
    關(guān)鍵詞:烏梢蛇偽品重復(fù)性

    楊志業(yè)1 方 竑1 譚穎儀1 劉 昂1 趙玉洋 袁 媛

    1.廣東省藥品檢驗所,廣東 廣州 510663;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心,北京 100700

    烏梢蛇首載于南北朝《雷公炮炙論》[1-2],其后歷代本草多有記載,尤以明代李時珍《本草綱目》的記載最為詳盡,在我國已有幾千年的藥用歷史。歷版藥典規(guī)定烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇ZaocysdhumnadesCantor 除去內(nèi)臟的干燥體,具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。在現(xiàn)代臨床上,烏梢蛇廣泛用于治療皮膚瘙癢癥、白癜風(fēng)、牛皮癬等,如烏蛇止癢丸、白癜風(fēng)丸等[3]。烏梢蛇養(yǎng)殖成本較高,其商品主要為野生。隨著野生動物保護(hù)力度的進(jìn)一步加強(qiáng),烏梢蛇市場資源短缺,價格顯著上漲,為了牟取暴利,市場上出現(xiàn)了多種烏梢蛇偽品或混淆品[4]。

    傳統(tǒng)鑒別方法多以蛇頭、腹鱗、體背鱗、肛鱗及尾下鱗的特征作為主要鑒別點[5],但專業(yè)性要求高,而且經(jīng)去頭及鱗片后切制或酒制等炮制加工的飲片,鑒別難度大,無法滿足對市售烏梢蛇質(zhì)量控制的要求。中國藥典自2010年版始收載了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測法對烏梢蛇進(jìn)行鑒別,該法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合更為準(zhǔn)確、可靠[6-9]。但經(jīng)典PCR法對實驗環(huán)境、操作人員要求高,常規(guī)裂解過程耗時長、步驟多,至少需要3.5 h才能完成單次檢驗,無法適應(yīng)當(dāng)前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場運用的需要。為了獲得一種快速、準(zhǔn)確、高效的鑒別烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?,陳康等[10]通過對經(jīng)典PCR技術(shù)方法條件進(jìn)行優(yōu)化,采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA[11-12],提取過程無需使用離心機(jī),采用SYBR Green I熒光檢視[13]代替瓊脂糖凝膠電泳,無需使用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等儀器,將烏梢蛇PCR鑒別方法試驗時間縮短為30min,并研制為快檢試劑盒,為實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用奠定了基礎(chǔ)[14]。

    《中國人民共和國藥品管理法》第一百條中規(guī)定:“對有證據(jù)證明可能危害人體健康的藥品及其有關(guān)材料,藥品監(jiān)督管理部門可以查封、扣押,并在七日內(nèi)作出行政處理決定”,藥品質(zhì)量快速篩查方法及產(chǎn)品就是為了在監(jiān)督現(xiàn)場對樣品進(jìn)行快速分析,為藥品監(jiān)管部分及時提供“證據(jù)”,使對大眾身體或財產(chǎn)具有較大危害性的藥品得到提前控制。因此,為更好地開展現(xiàn)場快檢快篩,提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率,有必要對快檢產(chǎn)品進(jìn)行評價,為藥品監(jiān)管部門的選擇和使用提供依據(jù)。筆者通過分析烏梢蛇PCR快檢試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢測限等性能指標(biāo),以及通過與“藥典法”對比,通過對136批市售樣品的檢測,考察試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率、假陽性率和假陰性率,進(jìn)而對烏梢蛇PCR快檢試劑盒進(jìn)行綜合評價,為同類快檢產(chǎn)品的評價提供案例。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 MM400珠式組織細(xì)胞破碎儀(RETSCH);BIORAD T100 PCR儀(BIORAD);eppendorf centrifuge5481 離心機(jī)(EPPENDORF);CAMAG REPROSTAR3薄層色譜照相裝置(CAMAG);Sub Cell GT水平電泳系統(tǒng) (BIORAD);Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System 全自動凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)。

    1.2 試藥 烏梢蛇PCR快檢試劑盒(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司); Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(Takara公司);蛋白酶K(Promega 公司);Takara Ex Taq(Takara公司);DNA 分子標(biāo)記(100-1000bp,Takara公司);中國藥典2015年版烏梢蛇藥典法引物(Invitrogen公司合成); Agarose G-10瓊脂糖(Biowest);電泳緩沖液配制試劑EDTA、Tris為分子生物學(xué)級試劑,冰醋酸為分析純。

    樣品分為2類,一類是對試劑盒的性能進(jìn)行考察的樣品,樣品信息見表1,樣品均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷教授鑒定;另一類是對試劑盒的應(yīng)用進(jìn)行評價的樣品,收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等,包括市售烏梢蛇粉12批(編號為WS-F001~WS-F012);市售烏梢蛇飲片29批(編號為WS-S001~WS-S029);市售酒烏梢蛇42批(WS-J001~WS-J042);烏梢蛇藥材樣品3批(蛇鲞,編號為WSZ001~WSZ003);烏梢蛇偽品50批(編號為SL001~SL050),包括烏梢蛇常見偽品灰鼠蛇、滑鼠蛇、赤鏈蛇等。

    表1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能參數(shù)考察用樣品信息表

    2 方法

    2.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測 參考2015年版中國藥典三部生物診斷試劑盒的要求,對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性等性能進(jìn)行考察。

    2.1.1 特異性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各2批,灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各2批,分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

    2.1.2 檢測限 取WS1,分別取25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、4 mg、3 mg、2 mg、1 mg,分別采用試劑盒進(jìn)行檢測。

    2.1.3 重復(fù)性 抽取烏梢蛇藥材、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇各1批,灰鼠蛇、滑鼠蛇、鉛色水蛇各1批,在同一實驗室相同條件下,由3位實驗員采用同批次試劑盒分別進(jìn)行試驗,考察批內(nèi)重復(fù)性。同時由同一位實驗員分別采用3個不同批次試劑盒進(jìn)行檢測,考察批間重復(fù)性。

    2.1.4 穩(wěn)定性 隨機(jī)選取一個試劑盒,分別放置至溶解,再分別按保存條件保存,如此反復(fù)分別經(jīng)過 1、5、10次后,對試劑盒內(nèi)的DNA提取試劑,陰性對照、陽性對照進(jìn)行檢測。

    2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價 實驗人員分為2組,第一組采用中國藥典2015年版一部烏梢蛇項下收載的PCR法對136批樣品進(jìn)行測定賦值,測定好后進(jìn)行隨機(jī)編號,形成盲樣;由第二組采用PCR快檢試劑盒方法進(jìn)行測定,獨立匯總檢測結(jié)果。通過比較兩個實驗室的相應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果不一致的進(jìn)行復(fù)測,計算烏梢蛇PCR快檢試劑盒的陽性結(jié)果準(zhǔn)確率、陰性結(jié)果準(zhǔn)確率、假陰性率、假陽性率等指標(biāo)。

    2.2.1 烏梢蛇聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)藥典方法 取樣品0.5 g,充分研磨使成粉末,取0.1 g,照中國藥典2015年版一部烏梢蛇飲片【鑒別】項下操作,簡稱為“藥典法”。

    2.2.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法 烏梢蛇PCR快檢試劑盒方法分為A、B兩部分,A部分為提取總DNA所用的試劑及耗材,于2~8 ℃保存;B部分為PCR擴(kuò)增部分所用的試劑及耗材,于-20 ℃下保存,簡稱“快檢試劑盒法”。具體操作如下:①取10~25 mg樣品粉末,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DNA稀釋10倍作為供試品溶液。另分別取陽性對照品、陰性對照品各10~25mg,同法制成陽性對照品溶液和陰性對照品溶液。②PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增體系為25 μL,包含預(yù)混反應(yīng)溶液24 μL,待測樣品或陽性、陰性對照DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性1 min;再進(jìn)行28個循環(huán)反應(yīng),條件為88 ℃變性10s,62 ℃退火并延伸10 s。以無菌雙蒸水作為空白對照,取1 μL,同法擴(kuò)增得到空白對照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。③檢視方法:在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL溶液熒光染料(SYBR Green I)混勻,于紫外光(365nm)下檢測熒光。若顯示綠色熒光,則為陽性結(jié)果,即為烏梢蛇正品,反之則為陰性結(jié)果,即偽品。

    3 結(jié)果

    3.1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒性能檢測結(jié)果

    3.1.1 特異性 采用快檢試劑盒法,烏梢蛇正品、偽品檢測結(jié)果均與標(biāo)定值一致。如圖1所示。

    1.WS1; 2.WS2; 3.WS4; 4.WS5; 5.WS7; 6.WS9; 7.W1; 8.W2; 9.W4; 10.W5; 11.W8; 12.W9圖1 烏梢蛇PCR快檢試劑盒特異性檢測結(jié)果

    3.1.2 檢測限 取WS1,按“2.1.2”進(jìn)行試驗,結(jié)果本試劑盒方法檢出限為4 mg。

    3.1.3 重復(fù)性 經(jīng)檢測,不同生產(chǎn)批號的快檢試劑盒測定的結(jié)果一致,不同操作人員的檢測結(jié)果亦一致,表明該試劑盒重復(fù)性良好。

    3.1.4 穩(wěn)定性 經(jīng)檢測,反復(fù)凍融1、5、10次后,經(jīng)試劑盒提取的供試品DNA測定結(jié)果一致,表明該試劑盒穩(wěn)定性良好。

    3.2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價結(jié)果 分別采用“藥典法”和“快檢試劑盒法”對市售烏梢蛇樣品86批(包括烏梢蛇粉12批、烏梢蛇飲片29批、酒烏梢蛇樣品42批,藥材樣品3批)以及偽品飲片50批進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。結(jié)果不一致的批次經(jīng)復(fù)試,復(fù)試結(jié)果與初試結(jié)果一致。

    表2 烏梢蛇PCR快檢試劑盒與藥典法結(jié)果匯總

    以“藥典法”檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果,測定陽性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為76批,陰性標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果為60批,“快檢試劑盒法”測得陽性結(jié)果為74批,陰性結(jié)果為62批,陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%,其中酒烏梢蛇樣品中有5個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陰性”,假陰性率為6.6%;陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%,其中烏梢蛇偽品樣品中有3個批次陽性樣品“快檢試劑盒法”測定結(jié)果為“陽性”,假陽性率為5.0%。

    4 討論

    4.1 試驗樣品的代表性 本研究用于考察烏梢蛇PCR快檢試劑盒應(yīng)用評價的樣品收集于流通領(lǐng)域中的生產(chǎn)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、藥材市場等16家,樣品規(guī)格有烏梢蛇粉、烏梢蛇飲片、酒烏梢蛇、烏梢蛇藥材等不同狀態(tài)的樣品,覆蓋了流通領(lǐng)域中各種使用規(guī)格,其中正品76批,偽品60批,總批次數(shù)136批,具有較好的代表性。其中烏梢蛇市售樣品不合格率分別為11.6%,表明市售烏梢蛇質(zhì)量情況不容樂觀,開展現(xiàn)場快篩快檢技術(shù)和產(chǎn)品的應(yīng)用以進(jìn)一步提高監(jiān)督效能十分必要。

    4.2 試劑盒的性能評價 經(jīng)對試劑盒的特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及檢測限等性能指標(biāo)進(jìn)行考察,結(jié)果表明該試劑盒的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,檢測限(最低取樣量)為4 mg。而“藥典法”在增加裂解時間的前提下,檢測限約為10 mg,因此與“藥典法”比較,該試劑盒的檢測限僅為“藥典法”的二分之一。對于烏梢蛇這類價格較為昂貴的品種,檢測限低既可減少檢測成本,同時對于常見的以拼接等制偽手段制成的樣品,可以多部位取樣及增加取樣個數(shù),進(jìn)一步提高監(jiān)督力度。

    4.3 試劑盒的應(yīng)用評價 經(jīng)采用快檢試劑盒對136批樣品進(jìn)行試驗,并與“藥典法”結(jié)果相比較,陽性結(jié)果準(zhǔn)確率為93.4%,陰性結(jié)果準(zhǔn)確率為95.0%,假陽性率為5.0%,假陰性率為6.6%,總體準(zhǔn)確率為94.1%。對假陰性結(jié)果和假陽性結(jié)果進(jìn)行分析,可能與檢視方法有關(guān),由于烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料(SYBR Green I),混勻后在紫外光燈(365 nm)下檢視,熒光較弱的情況下可能會影響主觀判斷,造成假陰性或假陽性的結(jié)果。在這種情況下,可采用“藥典法”進(jìn)行進(jìn)一步確證。與“藥典法”相比,該試劑盒取樣量少,簡便快速,使用成本低,作為快速檢測產(chǎn)品,烏梢蛇PCR快檢試劑盒可在監(jiān)督現(xiàn)場進(jìn)行大批量快檢初篩,為打擊烏梢蛇摻假、售假提供的有效的方法和工具,亦為監(jiān)督執(zhí)法贏得了時間。

    綜上,研究以中國藥典2015年版一部烏梢蛇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下收載的PCR鑒別方法作為對照,對烏梢蛇PCR快檢試劑盒的性能與應(yīng)用進(jìn)行評價。烏梢蛇PCR快檢試劑盒采用堿裂解法提取烏梢蛇基因組DNA,基于快速PCR技術(shù),以SYBR Green I熒光檢視代替瓊脂糖凝膠電泳,將檢測時間縮短至30min以內(nèi)。與藥典收載的PCR法相比,具有操作簡便、耗時短、檢測限低、經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)勢。通過對136批烏梢蛇樣品及常見混偽品進(jìn)行試驗,結(jié)果表明該試劑盒可用于監(jiān)督現(xiàn)場快速篩查,以提高市場監(jiān)督、執(zhí)法的效率。本文亦為同類產(chǎn)品的應(yīng)用與評價提供了研究經(jīng)驗。

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