倒提壺多糖的含量測(cè)定

隆 林1 羅朝鳳2 李天先1 呂 磊1 周 麗3

1.黔西南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 興義 562400；2.黔西南布依族苗族自治州醫(yī)院，貴州 興義 562400；3.興義民族師范學(xué)院，貴州 興義 562400

倒提壺為毛茛科翠雀屬植物云南翠雀花(DelphiniumyunnanenseFranch)的干燥根，又名飛燕草、小草烏、米草烏、月下參等，以根入藥。我國(guó)大部分地區(qū)均有分布[1-2]。生于海拔1000～2400 m的草坡或灌木叢[3]，其味苦、平，性溫?zé)?，有毒，能?qū)風(fēng)除濕、散寒止痛、補(bǔ)陰斂汗，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、胃寒疼痛、盜汗、跌撲損傷[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，多糖類化合物具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗衰老、降血糖等多種藥理活性[5]。目前倒提壺多糖的研究分析還未見報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行多糖的提取及含量測(cè)定研究，為今后科學(xué)分析倒提壺質(zhì)量和藥用研究方向提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、日本島津AY220電子天平(萬(wàn)分之一)；賽多利斯CPA225D電子天平(十萬(wàn)分之一)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)HH-4，金壇市中大儀器廠)。

1.2 材料 實(shí)驗(yàn)所用倒提壺采于貴州各地和云南，將其新鮮的根洗凈，曬干，粉碎過4號(hào)篩備用。原植物標(biāo)本由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室孫慶文教授鑒定為毛茛科植物云南翠雀花(DelphiniumyunnanenseFranch)。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833-201508，含量99.9%)，10批樣品來(lái)源見表1。試劑：蒽酮、硫酸和無(wú)水乙醇均為分析純，水為超純水。

表1 10批倒提壺來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品11.14 mg，置100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 提取條件的考察

2.2.1 不同前處理對(duì)倒提壺多糖提取的影響

2.2.1.1 索氏提取 取2號(hào)樣粉末0.25 g，精密稱定， 置索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，加熱提取4 h，取出，濾紙袋及殘?jiān)鼡]干后置于錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘?jiān)蒙倭繜崴礈?，殘?jiān)貜?fù)加熱回流2次，合并濾液與洗液，濃縮放冷后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，分別精密取2 mL，照2.5項(xiàng)下操作，依法檢測(cè)。

2.2.1.2 超聲提取 取2號(hào)樣粉末0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，用80%乙醇100 mL超聲提取(50 ℃ 40KHz)0.5 h，棄其乙醇液，重復(fù)提取1次，取出，濾紙袋及殘?jiān)鼡]干后置于錐形瓶中，按2.2.1.1項(xiàng)下“加水100 mL”起操作，依法檢測(cè)。結(jié)果見表2。由表2可知，前處理結(jié)果多糖含量超聲提取和索氏提取相當(dāng)，但索氏提取耗時(shí)過長(zhǎng)，故選用超聲提取。

表2 不同前處理對(duì)多糖提取的影響 (n=2)

2.2.2 不同提取方法對(duì)倒提壺多糖提取的影響 取2號(hào)樣粉末約0.25 g，精密稱定， 共6份樣，80%乙醇超聲提取后，濾紙袋及殘?jiān)鼡]干，置錐形瓶中，加入100mL水，分別按以下三種方法進(jìn)行提取：

2.2.2.1 加熱回流[6]加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘?jiān)脽崴礈?次，重復(fù)加熱回流2次，合并濾液；

2.2.2.2 超聲提取[7]超聲提取(50 ℃40 KHz)1h，趁熱抽濾，殘?jiān)脽崴礈?次，重復(fù)提取2次，合并濾液；

2.2.2.3 冷浸提取[8]冷浸提取24 h，過濾，殘?jiān)盟礈?次，重復(fù)提取2次，合并濾液。

將濾液濃縮放冷后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2mL置50mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壺多糖供試品溶液。分別精密量取供試品溶液各2 mL，照2.5項(xiàng)下操作，依法檢測(cè)。結(jié)果見表3。由測(cè)定結(jié)果可知，三種提取方法中加熱回流提取優(yōu)于超聲提取和冷浸法提取，故選用加熱回流提取。

表3 不同提取方法對(duì)多糖測(cè)定的影響 (n=2)

2.3 供試品溶液制備 通過比較得出供試液最佳制備方法為：精密稱取倒提壺粉末0.25 g于濾紙袋中，置錐形瓶中，加80%乙醇100 mL超聲提取(50 ℃ 40 KHz)0.5 h，棄其乙醇液，重復(fù)提取1次，取出，濾紙袋及殘?jiān)鼡]干后置于錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘?jiān)蒙倭繜崴礈?，重?fù)加熱回流2次，合并濾液與洗液，濃縮放冷后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壺多糖供試品溶液。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL和2.3項(xiàng)下的供試品溶液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分別精密加入預(yù)先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液(蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL)4 mL，混勻，置沸水浴中加熱10 min，冰水浴中迅速冷卻，約20 min時(shí)，以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm范圍掃描吸光度光譜。掃描結(jié)果表明：對(duì)照品溶液及供試品溶液勻在625 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，確定該波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分別置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分別精密加入預(yù)先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液(蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL)4 mL，混勻，置沸水浴中加熱10 min，冰水浴中迅速冷卻，約20 min時(shí)，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在625 nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。得回歸方程為y=0.0565x+ 0.0046,R2=0.999，線性范圍為1.8548～11.1289 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度與吸光度之間的關(guān)系如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3 mL，置25 mL比色管中，照2.5項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，以相應(yīng)試劑為空白，在625nm下進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定6次。記錄其吸光度值，計(jì)算RSD為0.76%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2號(hào)樣多糖供試品溶液2 mL，置25 mL比色管中，照2.5項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法顯色，以相應(yīng)試劑為空白，每隔20 min測(cè)定其吸光度，連續(xù)2 h考察其穩(wěn)定性，計(jì)算RSD值為1.36%，結(jié)果表明，本法測(cè)定樣品在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取2號(hào)樣粉末6份，按2.3項(xiàng)下制備倒提壺多糖供試品溶液，取2.0 mL按2.5項(xiàng)下顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算其含量，結(jié)果6份平均含量為24.98%，其RSD為1.87%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的5號(hào)樣粉末6份，每份0.125 g，加80%乙醇100 mL超聲提取(50 ℃ 40 KHz)0.5 h，棄其乙醇液，重復(fù)提取1次，取出，濾紙袋及殘?jiān)鼡]干后置于錐形瓶中，按表5中的量精密加入D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下自“置錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h”起同法操作，按2.5項(xiàng)下操作并測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率及RSD。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.10 倒提壺多糖的含量測(cè)定 精密量取2.3項(xiàng)下的倒提壺多糖供試品溶液2 mL，置于25 mL比色管中，照2.5項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“分別精密加入預(yù)先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液”起，依法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算倒提壺多糖的含量，結(jié)果見表5，多糖的含量范圍15.56%～29.52%，平均含量為20.60%。

表5 倒提壺多糖含量測(cè)定結(jié)果 (%,n=2)

3 討論

倒提壺中含有豐富的化學(xué)成份，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿及黃酮等，為不影響多糖的測(cè)定，應(yīng)先除去脂質(zhì)等小分子物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用80%乙醇來(lái)前處理。結(jié)果多糖含量超聲提取和索氏提取相當(dāng)，但索氏提取耗時(shí)過長(zhǎng)，故選用超聲提取。

多糖含量測(cè)定中常用的提取方法有回流提取、超聲提取和冷浸等，為證明哪種方法更適合倒提壺中多糖的提取，本實(shí)驗(yàn)比較了回流提取、超聲提取與冷浸提取。回流提取操作簡(jiǎn)單，成本低廉，超聲提取操作簡(jiǎn)便、快速，冷浸耗時(shí)長(zhǎng)，提取不完全?；亓魈崛》ǘ嗵呛枯^超聲提取和冷浸提取更高，故選用回流提取法。本實(shí)驗(yàn)以云南和貴州產(chǎn)的倒提壺為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)10個(gè)批次的樣本中多糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示10批次倒提壺多糖含量存在差異，多糖的含量范圍為15.56%～29.52%，平均含量為20.60%，其中興仁魯?shù)A營(yíng)野生的含量最高，云南宜良人工種植的含量最低。倒提壺為多年生草本植物，所采集的樣品多為野生品，種植的只有一批，樣本量較少，生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)年限的不同，致其根大小不一，多糖含量的高低是否與其有關(guān)，還需做進(jìn)一步研究。