木耳黑色素堿法提取工藝優(yōu)化及表征

張艷榮，王慶慶，劉 通，郭 中（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春　130118）

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木耳黑色素堿法提取工藝優(yōu)化及表征

張艷榮，王慶慶，劉 通，郭 中
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春130118）

摘 要：采用正交試驗(yàn)優(yōu)化碳酸鈉提取木耳黑色素的工藝，并對黑色素的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，單因素及正交試驗(yàn)確定最優(yōu)工藝條件為：超聲功率160 W（5 g固體物料）、料液比1∶30（g/mL）、碳酸鈉濃度2.00 mol/L、提取時間50 min。在此工藝條件下獲得木耳黑色素粗提物的產(chǎn)量為9.078 g/100 g?；瘜W(xué)表征證明，木耳黑色素對溫度、低濃度氧化劑和還原劑有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，但對光的穩(wěn)定性較差；木耳黑色素在波長210 nm處有最大吸收峰。紅外結(jié)果顯示，木耳黑色素由羥基、氨基、C＝O、C＝C、CH、CH2以及芳環(huán)基團(tuán)組成。木耳黑色素的S∶N=0.01，表明木耳黑色素為真黑色素，預(yù)示其具有烏發(fā)、抗衰老等作用。

關(guān)鍵詞：黑木耳；黑色素；提取工藝；表征

作者介紹：張艷榮（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油植物蛋白工程與功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com

引文格式：

張艷榮, 王慶慶, 劉通, 等. 木耳黑色素堿法提取工藝優(yōu)化及表征[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 27-32. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612005. http://www.spkx.net.cn

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黑色素是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的天然物質(zhì)，通常是由多酚類化合物或吲哚氧化聚合而成，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大[1]。通常情況下黑色素呈黑色、褐素或者棕色[2]。意大利化學(xué)家Nicolaus[3]通過研究黑色素的元素組成、聚合途徑及顏色，把黑色素分為異黑色素、棕黑色素和真黑色素。天然黑色素在生物體內(nèi)廣泛存在，其含量在現(xiàn)有生物類黑色素中占第一位[4]。相關(guān)研究[5]結(jié)果表明，黑色素具有保護(hù)神經(jīng)、抗氧化、清除自由基等功能，對人體健康的維護(hù)具有重要意義。隨著人們對天然黑色素研究的不斷深入，其越來越廣泛地被應(yīng)用于食品領(lǐng)域和化工領(lǐng)域[6]，例如食品添加劑、防曬露、染發(fā)劑等[7]。

天然黑色素的提取多采用氫氧化鈉法，其提取率高、純化效果好。但對于木耳黑色素的提取會由于強(qiáng)堿的作用導(dǎo)致木耳萃余物無法再次利用，帶來木耳食用菌資源的浪費(fèi)。如果提取劑為食品級碳酸鈉，則可繼續(xù)利用萃余物提取木耳膳食纖維，提高木耳利用率。木耳（Auricularia auricula（L. ex Hook.）Underwood），又名樹蕈，是傳統(tǒng)的藥食用菌[8]。木耳被譽(yù)為“菌中之冠”，其營養(yǎng)價(jià)值豐富 ，受到廣大營養(yǎng)學(xué)家的稱贊[9]，富含人體不可缺少的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、維生素[10]等。木耳子實(shí)體含有功能性黑色素，是著名的黑色健康食品[11]。有關(guān)研究[11]結(jié)果顯示，食物的營養(yǎng)價(jià)值與天然顏色存在密切聯(lián)系。食物的顏色越深，營養(yǎng)價(jià)值越高，其排列順序?yàn)楹凇⒕G、紅、黃、白，在同類食物中顏色越深，營養(yǎng)效果越顯著。天然黑色素是木耳特有的功能性成分之一[12]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助碳酸鈉提取木耳黑色素，并通過紫外光譜掃描、紅外光譜掃描和元素測定，對木耳黑色素的組成及相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行檢測分析，為木耳黑色素在食品、醫(yī)藥等方面的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木耳市售干品，要求干燥潔凈、無蟲蛀、無霉變。

碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、95%乙醇（均為分析純）北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

RHP-600型高速多功能粉碎機(jī)浙江榮浩工貿(mào)有限公司；水浴振蕩器哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；101A-2E電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝科器研究所；PHS-3C型pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；IR Prestige傅里葉紅外光譜儀日本島津公司。

1.3方法

1.3.1原料預(yù)處理

木耳干品用清水沖洗干凈，去除雜質(zhì)，置于50 ℃條件下烘干，破碎，得到可全部通過60 目孔徑篩的木耳粉，干燥環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2木耳黑色素提取工藝

1.3.3單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)條件為：固定樣品用量為5 g，料液比1∶30、碳酸鈉濃度1.00 mol/L、超聲功率100 W、提取時間70 min。改變其中一個條件，固定其余條件來分析料液比、碳酸鈉濃度、超聲功率和提取時間對木耳黑色素產(chǎn)量的影響[13]。每個因素設(shè)5 個水平：料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，g/mL）[14]、碳酸鈉濃度（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mol/L）、超聲功率（80、100、120、140、160 W）、提取時間（30、50、70、90、110 min），為減小試驗(yàn)的誤差，每組試驗(yàn)重復(fù)5 次。

將處理后的料液離心分離，獲得上清液，調(diào)節(jié)上清液pH 1.5，在80 ℃的水浴鍋中加熱至沉淀，離心分離，用蒸餾水洗滌至中性，干燥至恒質(zhì)量，獲得木耳黑色素粗提物。

1.3.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以木耳黑色素粗提物的產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，對料液比、碳酸鈉濃度、超聲功率和提取時間4 個因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定提取的最優(yōu)工藝。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments

1.3.5木耳黑色素的純化

將木耳黑色素粗提物置于濃度1 mol/L HCl溶液中，在90 ℃的條件下水解2 h，離心分離，取沉淀物分別用三氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇溶液反復(fù)處理至不產(chǎn)生白色分層，處理后用鹽酸調(diào)沉淀物pH 2.5靜置沉淀，離心收集沉淀用蒸餾水洗滌沉淀至中性，干燥至恒質(zhì)量，獲得純化的木耳黑色素[15]。

1.3.6木耳黑色素的鑒定

1.3.6.1溫度對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

將0.1 g木耳黑色素用1 mol/L的氫氧化鈉溶液定容至1 L，分別置于0、20、40、60、80、100 ℃不同條件下，于暗處放置，每個1 h取樣1 次，等溫度恢復(fù)至室溫條件，在波長400 nm處測定吸光度[15]。

1.3.6.2光照對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

將0.1 g木耳黑色素用1 mol/L的氫氧化鈉溶液定容至1 L，分別置于暗處（對照）、自然光照和白熾燈下照射，每隔1 h取樣一次測定吸光度。

1.3.6.3氧化劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%、0.30%和3.00%的H2O2溶液，分別量取2 mL加入到8 mL木耳黑色素溶液中，于室溫暗處放置，每隔1 h測定吸光度，對照組中將H2O2溶液換成蒸餾水[16]。

1.3.6.4還原劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%、0.20%和2.00%的亞硫酸鈉溶液，分別量取2 mL加入到8 mL木耳黑色素溶液中，于室溫暗處放置，每隔1 h測定吸光度，對照組中將H2O2溶液換成蒸餾水。

1.3.6.5紫外-可見光譜掃描

稱取1.00 g木耳黑色素，加入到0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液中，60 ℃水浴加熱并攪拌，維持30 min，使色素完全溶解，然后3 000 r/min離心10 min，取上清液在190～600 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描[17]。

1.3.6.6紅外光譜掃描

采用溴化鉀壓片法，按1∶200的比例將烘干至恒質(zhì)量的木耳黑色素和溴化鉀粉末，混合均勻研成粉末，將粉末壓成薄厚均勻、透明度高的薄片。在500～4 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[18]。

1.3.6.7木耳黑色素各組分元素分析

采用元素分析儀檢測木耳黑色素樣品中C、H、N和S元素含量。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對木耳黑色素提取效果的影響

圖1　料液比對木耳黑色素提取效果的影響Fig. 1　Effect of material-to-liquid ratio on the extraction yield of Auricularia auricula melanin

當(dāng)料液比為1∶10時，溶液黏稠，試驗(yàn)操作誤差大。由圖1可知，隨著提取溶劑用量的不斷增加，黑色素粗品產(chǎn)量也隨之上升，料液比在1∶30時，木耳黑色素粗提物產(chǎn)量最高；繼續(xù)增加溶劑用量，黑色素產(chǎn)量呈下降趨勢，且不利于黑色素酸沉，造成浪費(fèi)。綜合以上因素，選取料液比為1∶20、1∶30、1∶40為正交試驗(yàn)考察水平。

2.1.2碳酸鈉濃度對木耳黑色素得率的影響

由圖2可知，碳酸鈉溶液濃度在1.00～2.00 mol/L時，黑色素粗品產(chǎn)量隨著濃度的提高而上升。碳酸鈉度高于2.00 mol/L時，堿溶性雜質(zhì)的溶出量隨著碳酸鈉濃度的提高而增加，影響了黑色素的溶出效率，從而使黑色素產(chǎn)量下降。綜合以上因素，選取碳酸鈉濃度為1.50、2.00、2.50 mol/L作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖2　碳酸鈉溶液濃度對木耳黑色素提取效果的影響Fig. 2　Effect of sodium carbonate concentration on the extraction yield of Auricularia auricula melanin

2.1.3超聲功率對木耳黑色素提取效果的影響

圖3　超聲功率對木耳黑色素提取效果的影響Fig. 3　Effect of ultrasonic powers on the extraction yield of Auricularia auricula melanin

由圖3可知，木耳黑色素粗提物產(chǎn)量隨著超聲功率的增加而增大。這是由于超聲功率越大細(xì)胞破碎程度越大，加快了木耳黑色素的擴(kuò)散釋放效率[19]，提高木耳黑色素的產(chǎn)量。隨著超聲功率的增大，木耳黑色素粗提物產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，如果繼續(xù)增加超聲波功率會造成不必要的損失，因此選取120、140、160 W作為正交試驗(yàn)考察水平。

2.1.4超聲波提取時間對木耳黑色素提取效果的影響

圖4　提取時間對木耳黑色素提取效果的影響Fig. 4　Effect of extraction duration on the extraction yield of Auricularia auricula melanin

由圖4可知，提取時間在30～70 min時，木耳黑色素粗提物的產(chǎn)量隨時間延長不斷增加。當(dāng)提取時間在70 min左右時產(chǎn)量最高。提取時間繼續(xù)延長，木耳黑色素粗提物的產(chǎn)量開始降低。這可能是由于超聲波的振蕩破碎作用使黑色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而造成損失[20]。綜合以上因素，選取提取時間為50、70、90 min作為正交試驗(yàn)考察水平。

2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、碳酸鈉濃度、超聲功率、提取時間4 個因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，以木耳黑色素粗提物產(chǎn)量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定木耳黑色素提取的最優(yōu)工藝。

表2　木耳黑色素提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design with experimental results of Auricularia auricula melanin

由表2和圖5可知，采用碳酸鈉提取木耳黑色素過程中，各因素對木耳黑色素粗提物產(chǎn)量的影響主次關(guān)系為C＞B＞A＞D，即超聲功率＞碳酸鈉濃度＞料液比＞提取時間。其中超聲功率及碳酸鈉濃度對木耳黑色素粗提物產(chǎn)量的影響較大；而料液比與提取時間對木耳黑色素的提取影響不顯著。最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即料液比1∶30、碳酸鈉濃度2.00 mol/L、超聲波功率160 W、提取時間50 min，由此工藝條件下獲得的木耳黑色素粗提物產(chǎn)量為9.078 g/100 g。

圖5　正交試驗(yàn)直觀圖Fig. 5　Range analysis of orthogonal experiment

2.3溫度對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

表3　溫度對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of temperature on the stability of Auricularia auricula melanin

由表3可知，木耳黑色素在0 ℃維持4 h僅損失1.65%，隨著溫度的升高和加熱時間的延長，木耳黑色素的保存率有所下降，但在100 ℃加熱4 h后，損失保存率仍達(dá)到87.69%，這表明木耳黑色素具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

2.4光照對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

表4　光照對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of different light sources on the stability of Auricularia auricula melanin

由表4可知，木耳黑色素在暗處保存4 d，其損失率僅為0.83%；但是在自然光下存放僅1 d，色素?fù)p失就達(dá)到15.13%，存放4 d時木耳黑色素的殘存率為57.91%。木耳黑色素在白熾燈下照射4 d后，黑色素殘存率為69.38%，這表明光照對木耳黑色素的破壞作用隨著時間的延長而增加，且光照越強(qiáng)，破壞程度越大。這可能是因?yàn)楣庹崭淖兞四径谏氐慕Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。

2.5氧化劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

表5　氧化劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of oxidants on the stability of Auricularia auricula melanin

由表5可知，木耳黑色素溶液在H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時，色素溶液的吸光度與對照相差不大，但當(dāng)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30%時，色素溶液的吸光度與對照相差較大，當(dāng)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%時，色素溶液的吸光度急劇下降，這說明木耳黑色素對低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的H2O2具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.6還原劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響

表6　還原劑對木耳黑色素穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of reducing agents on the stability of Auricularia auricula melanin

由表6可知，在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的亞硫酸鈉溶液中，木耳黑色素的吸光素幾乎保持不變，表明木耳黑色素對還原劑亞硫酸鈉有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.7木耳黑色素紫外光譜特征

圖6　碳酸鈉提取木耳黑色素的紫外光譜圖Fig. 6　UV absorption spectra of Auricularia auricula melanin extracted with Na2CO3

將木耳黑色素在190～600 nm內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖6，在210 nm波長處有最大吸收峰，與相關(guān)報(bào)道[21]中黑色素的最大吸收峰在210 nm左右一致。光譜在紫外區(qū)域吸收力最強(qiáng)，從210 nm處開始，隨著波長的不斷提高，吸光度表現(xiàn)出下降趨勢，這是黑色素紫外吸收圖像的典型特點(diǎn)[22]。在紫外掃描的過程中沒有其他雜峰出現(xiàn)，說明本實(shí)驗(yàn)采用的提取與純化方法收到良好效果。

2.8木耳黑色素的傅里葉紅外光譜特征

圖7　氫氧化鈉（A）和碳酸鈉（B）提取木耳黑色素的紅外光譜圖Fig. 7　Infrared spectra of Auricularia auricula melanin extracted with NaOH (A) and Na2CO3(B)

由圖7可知，在3 290.5 cm－1處有較強(qiáng)的吸收峰，說明存在—OH和—NH結(jié)構(gòu)；在2 929.8 cm－1處的吸收峰是—CH和—CH2的共振峰；在2 854.6 cm－1處的吸收峰可能是由于CH3、CH2、或者C＝H基團(tuán)的振動引起的；在1 637.5 cm－1處吸收峰說明可能存在—COOH；在1 388.3 cm－1處吸收峰是C—CH3的彎曲和骨架振動形成；在613.3 cm－1處存在吸收峰可能存在苯環(huán)；在2 360.1 cm－1的吸收峰產(chǎn)生了偏差，是由于產(chǎn)生了二氧化碳而引起的，對分析結(jié)果影響較小可以忽略；在3 600.0～3 800.6 cm－1的范圍內(nèi)存在一些較小的峰，這是由于有雜質(zhì)的存在而引起的雜質(zhì)峰，可以通過進(jìn)一步純化除雜削弱或除掉雜質(zhì)，提高樣品純度，減小分析誤差。根據(jù)分析結(jié)果可知，木耳黑色素為鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，與植物源黑色素的結(jié)構(gòu)一致。另外，分別采用氫氧化鈉與碳酸鈉提取的木耳黑色素結(jié)構(gòu)極其相似，說明不同種類的堿溶液提取的木耳黑色素差異較小，因此可以考慮用食品級碳酸鈉取代氫氧化鈉提取木耳黑色素。

2.9木耳黑色素的元素分析

表7　木耳黑色素的元素分析Table 7 Elemental composition of Auricularia auricula melanin

Ito等[23]提出棕黑色素和真黑色素的S∶N分別是0.46和0.01，從表7可知，2種方法提取的木耳黑色素的S∶N均是0.01，說明氫氧化鈉及碳酸鈉法提取的木耳色素都是真黑色素。對比氫氧化鈉及碳酸鈉法提取的木耳色素中C∶N，發(fā)現(xiàn)碳酸鈉法獲得的木耳黑色素中N含量明顯高于氫氧化鈉法，說明碳酸鈉法提取的木耳黑色素中可能夾雜較多的蛋白質(zhì)等含氮化合物，或者含有氨基結(jié)構(gòu)[18,24-25]。

3　結(jié) 論

研究表明，超聲波輔助碳酸鈉提取木耳黑色素的最佳條件為料液比1∶30、碳酸鈉濃度2.00 mol/L、超聲功率160 W、提取時間50 min，此條件下木耳黑色素粗提物產(chǎn)量為9.078 g/100 g。

對木耳黑色素進(jìn)行穩(wěn)定性性實(shí)驗(yàn)，紫外、紅外圖譜掃描及元素分析，結(jié)果顯示，木耳黑色素對溫度、低濃度氧化劑和還原劑有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，但是對光的穩(wěn)定性較差；木耳黑色素在波長210 nm處有最大吸收峰；紅外光譜分析表明木耳黑色素由氨基、羥基、CH、C＝C、C＝O、CH2以及芳環(huán)基團(tuán)組成，說明木耳黑色素為鄰苯二酚型結(jié)構(gòu)；元素分析表明木耳黑色素為真黑色素。

天然黑色素具有保護(hù)神經(jīng)、抗氧化、清除自由基等營養(yǎng)保健作用，而且使用安全。在化學(xué)添加劑的污染、藥物的濫用對人們機(jī)體健康造成的危害越來越受到關(guān)注與抵制的今天，安全、健康、功能化的天然色素的提取必將成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。氫氧化鈉與碳酸鈉提取的木耳黑色素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)極其相似，預(yù)示可以利用食品級碳酸鈉取代強(qiáng)堿氫氧化鈉進(jìn)行木耳黑色素的提取，在獲得木耳黑色素的同時萃余物可以再次利用于木耳膳食纖維、木耳食品等加工，避免原料木耳的浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)木耳高值化利用。

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Alkaline Extraction Optimization and Characterization of Auricularia auricula Melanin

ZHANG Yanrong, WANG Qingqing, LIU Tong, GUO Zhong
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun130118, China)

Abstract:The orthogonal array design method was used to optimize the extraction of Auricularia auricula melanin and the characterization of the melanin was conducted. Through single factor and orthogonal array experiments, the optimum extraction conditions were obtained as follows: ultrasonic power, 160 W; sample mass 5 g; material-to-liquid ratio, 1:30 (g/mL); sodium carbonate concentration, 2.00 mol/L; and extraction duration, 50 min. The crude extract yield under these conditions was 9.078 g/100 g. Chemical characterization proved that the melanin possessed strong stability to heat and low concentrations of oxidant and reducing agent but was sensitive to light. The melanin displayed maximum absorption peak at 210 nm. Infrared spectroscopy indicated that Auricularia auricula melanin was composed of hydroxy, amino, C=O, C=C, CH, CH2and aromatic ring groups. The S:N ratio of the melanin was 0.01, indicating that it is eumelanin and has functions such as hair blackening and anti-aging.

Key words:Auricularia auricular; melanin; extraction; characterization

收稿日期：2015-12-14

基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B08）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100805）

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612005

中圖分類號：TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0027-06