固相萃取凈化-高效液相色譜法測定肉制品中的9種N-亞硝基化合物

蔡魯峰，李 娜，杜 莎，譚 雅，李 珂，王遠(yuǎn)亮,*（.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙　4028；2.湖南省商業(yè)技師學(xué)院烹飪系，湖南 株洲　42000）

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固相萃取凈化-高效液相色譜法測定肉制品中的9種N-亞硝基化合物

蔡魯峰1,2，李 娜1,2，杜 莎1，譚 雅1，李 珂1，王遠(yuǎn)亮1,*
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410128；2.湖南省商業(yè)技師學(xué)院烹飪系，湖南 株洲412000）

摘 要：建立采用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定肉制品中9種N-亞硝基化合物的方法。以甲醇為提取劑，60 ℃條件下超聲提取，經(jīng)CNWBOND HC-C18固相萃取柱凈化后，采用AQ-C18色譜柱分析。甲醇和超純水為流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)了待測物的良好分離，紫外檢測器檢測，結(jié)合保留時(shí)間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：9種N-亞硝基化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；方法定量限（RSN= 10）為0.047～0.097 μg/g；回收率為72.6%～97.6%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）為3.1%～7.9%。此方法前處理簡單、回收率高、精密度好，適用于肉制品中9種N-亞硝基化合物的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞：N-亞硝基化合物；固相萃?。桓咝б合嗌V；肉制品

引文格式：

蔡魯峰, 李娜, 杜莎, 等. 固相萃取凈化-高效液相色譜法測定肉制品中的9種N-亞硝基化合物[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 217-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612039. http://www.spkx.net.cn

CAI Lufeng, LI Na, DU Sha, et al. Determination of nine N-nitroso compounds in meat products by solid phase extraction purification and high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(12): 217-221. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612039. http://www. spkx.net.cn

在已知的N-亞硝基化合物（N-nitroso compounds，NOCs）中超過300種具有致癌性，并且90%以上的已經(jīng) 證實(shí)具有致癌活性[1]。目前關(guān)于NOCs檢測方法的研究報(bào)道主要涉及食品樣品如罐頭食品[2]、肉制品[3-4]，環(huán)境樣品如廢水[5]等，日化樣品如化妝品[6]，膠制品如橡膠[7]、乳膠[8]以及煙草[9]等。在肉制品中已鑒定報(bào)道的NOCs至少有15 個(gè)[10]，這些物質(zhì)存在于培根、香腸、煙熏羊肉、下水肉制品、火腿等肉制品中。不同種類的加工肉制品所含的NOCs的種類和含量也不同，Sannino 等[11]對干腌火腿、意大利香腸、法蘭克福香腸、肉罐頭、熏火腿、摩泰臺拉香腸、金華火腿、意大利風(fēng)干牛肉、杯形香腸、熏豬肉香腸共10種加工肉制品進(jìn)行了分析，結(jié)果表明在所有樣品中都檢測到了N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA），含量在0.3～1.1 μg/kg之間，只有在法蘭克福香腸中檢測到N-亞硝基二丙胺（N-nitroso-di-iso-propylamine，NDPA）（0.6 μg/kg）；在煙熏火腿中檢測N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidin，NPYP）（0.5 μg/kg） 。

由于肉制品中形成的NOCs是痕量的，一般的化學(xué)檢測法無法定量檢測，必須使用精密儀器和痕量物質(zhì)檢測法定量測定使。肉制品中NOCs的測定方法主要有分光光度法[12]、離子色譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]、氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法[15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16]、氣相色譜-氮磷檢測器法[17]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[18]、氣相色譜耦合熱能分析法[19]、高效液相色譜法[20]、氣相色譜-熱能分析法等。其中液相 色譜除了具有氣相色譜的高效、靈敏、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)外，它還可以測定非揮發(fā)性亞硝胺；熱能分析儀分析具有很好的重現(xiàn)性，但是儀器昂貴，應(yīng)用范圍較窄，一般實(shí)驗(yàn)室很少配備[21]。

由于肉制品中化合物眾多，上機(jī)檢測前必須進(jìn)行前處理既提取凈化，而固相萃取是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，該技術(shù)可以高效、快速并大批量處理樣品，不僅提高了分析質(zhì)量和效率，減少有機(jī)溶劑使用量，節(jié)約成本，而且可以降低環(huán)境污染。本研究采用固相萃取-高效液相色譜法對發(fā)酵肉制品中9種NOCs含量進(jìn)行了分析，建立了快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏和高效的方法。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

發(fā)酵豬肉，原材料為豬里脊肉，自然發(fā)酵而成。

標(biāo)準(zhǔn)品：N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine， NDEA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，N P I P）、N D P A、N-亞硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPhA）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NMEA）、NDMA、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、NPYP；常規(guī)試劑：HCl、NaOH、NaHCO3、NaCl、K2CO3、NaNO2、NaH2PO4、冰醋酸、正戊烷、正己烷、二氯甲烷（均為分析純）美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）美國Tedia公司。

L C-2 0 AT高效液相色譜儀（配備S P D-2 0 A紫外檢測器）日本島津公司；AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國Welch公司；HCC18SPE小柱（500 mg，6 mL）美國Cnwbond公司；BG-12C 超聲波清洗機(jī)廣州邦潔電子產(chǎn)品有限公司；13 mm 0.20 μm希波氏（Xiboshi）針式過濾器美國Dionex公司；Milli-Q Integral超純水機(jī)美國Millipore公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，用甲醇稀釋，定容至100 mL棕色容量瓶中，超聲混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用時(shí)用空白樣品溶液稀釋到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01、0.05、0.1、0.2、2、6、10、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2樣品預(yù)處理

將待測樣品粉碎，稱取1.0 g于10 mL具塞萃取瓶中，加入5 mL甲醇并浸泡樣品5～10 min，于60 ℃條件下超聲提取30 min，將提取液轉(zhuǎn)移至潔凈的圓底燒瓶中；再用5 mL甲醇重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于35 ℃負(fù)壓條件下濃縮至1.0 mL左右，待凈化。

將上述濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至預(yù)先用甲醇5 mL進(jìn)行活化處理，5 mL超純水平衡后的C18固相萃取小柱中，先用5 mL的30%甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫3 次，每次用量為3 mL，收集洗脫液并用氮?dú)饩徛祾咧?.5 mL，最后用甲醇定容至1.0 mL，過0.20 μm濾膜后供高效液相色譜測定。

1.2.3色譜條件

AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 μm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相：A，甲醇；B，超純水；流速：0.5 mL/min；檢測波長：240 nm；運(yùn)行時(shí)間：40 min；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1　Gradient elution program

2　結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇

圖1　不同流動(dòng)相條件下的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰情況Fig. 1　Chromatographic peaks of mixed NOC standards separated with different mobile phases

考察甲醇-水[22]、乙腈-水[23]、甲醇-1.0%甲酸溶液[24]、乙腈-乙酸鹽緩沖液（pH 4.0）[25]體系對9種NOCs的分離效果，結(jié)果見圖1。乙腈-乙酸鹽緩沖液（pH 4.0）體系基線漂移，無法定量；甲醇-1.0%甲酸溶液分離效果較好，但同樣存在基線漂移現(xiàn)象，這說明流動(dòng)相中添加酸不會對峰形具有明顯的改善，同時(shí)還會引起基線的漂移，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，故實(shí)驗(yàn)采用不加酸流動(dòng)相，這一結(jié)果與楊寧等[26]的研究結(jié)果一致。乙腈-水（含1%冰乙酸）體系洗脫能力很強(qiáng)，NDMA及NDEA被洗脫無法解析且基線漂移，甲醇-水體系洗脫效果較好，基線穩(wěn)定，但NDBA和NDPhA未完全分開，通過調(diào)節(jié)在不同分析時(shí)間里流動(dòng)相的配比，在總流速為0.5 mL/min，甲醇梯度洗脫，色譜圖分離效果及峰形較好。

2.1.2流速的確定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流速可以很大程度地影響待測組分的分離效果。本實(shí)驗(yàn)研究了0.3、0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min 5 個(gè)梯度對色譜分離的影響，發(fā)現(xiàn)在流速為0.5 mL/min時(shí)，9種NOCs達(dá)到了最大程度的基線分離，當(dāng)流速為0.8 mL/min，8號峰和9號峰不能分離，信號發(fā)生重疊，當(dāng)流速為1.0 mL/min和1.2 mL/min時(shí)，3、8、9號物質(zhì)不能定量洗脫，出現(xiàn)無峰現(xiàn)象；而當(dāng)流速為0.3 mL/min，分析時(shí)間過長，且出現(xiàn)雜峰，影響分離效果，故液相色譜最佳流速為0.5 mL/min。各待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見圖2。

圖2　各待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖Fig. 2　Chromatogram of a mixed standard solution of the analytes

2.2固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1淋洗劑的選擇

將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至預(yù)先用甲醇5 mL進(jìn)行活化處理，5 mL超純水平衡后的C18固相萃取小柱中，分別用30%甲醇溶液、正戊烷和正己烷各5 mL淋洗，收集洗脫液測定9種NOCs的回收率，結(jié)果見表2。正戊烷僅對NPIP、NDPA和NDBA 3種物質(zhì)有微弱的解吸附能力，同時(shí)對其他6種NOCs的保留無影響；正己烷對NDBA 和NDPhA的解吸附能力較強(qiáng)，對NMEA、NPIP和NDPA也有微弱的解吸附能力，對其他4種NOCs的保留無影響；30%甲醇除了對NDBA和NDPhA有微弱的解吸附能力外，對其他7種NOCs的保留無影響，考慮到9種NOCs的溶解及稀釋劑和有機(jī)流動(dòng)相均為甲醇，故30%甲醇溶液為最佳淋洗劑。

表2　3種淋洗劑對9種NOCs的回收率Table 2 Desorption efficiency of 9 -nitroso compounds with 3 different washing solvents

2.2.2洗脫劑的選擇

通過考察二氯甲烷、乙醇-正己烷、甲醇洗脫劑對測定9種NOCs回收率的影響。結(jié)果表明，二氯甲烷在3種洗脫劑中的回收效果最差，乙醇-正己烷次之，甲醇回收9種NOCs的效果最好。3種洗脫劑對NDBA，NDPhA的回收率都較好，而二氯甲烷、乙醇-正己烷對其他幾種NOCs的回收率在31%～55%之間；甲醇對9種NOCs的回收率在76%～112%之間，因此選擇甲醇作為固相萃取的洗脫劑。3種溶劑洗脫對NOCs回收率見圖3。

圖3　不同洗脫劑對9種NOCs的回收率Fig. 3　Recoveries of 9 nitrosamines with 3 different eluants

2.2.3洗脫次數(shù)的選擇

甲醇的用量為2 mL，考察洗脫次數(shù)對加標(biāo)回收率的影響，一般來講回收率會隨著洗脫次數(shù)的增加而升高，但并不呈現(xiàn)線性關(guān)系。如圖3所示，當(dāng)洗脫1 次時(shí)9種NOCs的回收率都較低，當(dāng)洗脫次數(shù)為3 次和4 次時(shí)9種標(biāo)準(zhǔn)物的回收率基本不變，曲線平緩。考慮到洗脫效果和經(jīng)濟(jì)及環(huán)保效益，最終選擇洗脫次數(shù)為3。

圖4　不同洗脫次數(shù)對9種NOCs的回收率Fig. 4　Recoveries of 9 nitrosamines at different elution cycles

2.2.4洗脫劑用量的選擇

洗脫次數(shù)為3，考察每次甲醇的用量對9種NOCs的回收率。如圖5所示，隨著洗脫劑用量的不斷增加，9種 NOCs的回收率逐漸升高，當(dāng)洗脫劑用量為1 mL時(shí)回收率范圍在42%～67%之間，洗脫效果差；當(dāng)洗脫劑量為3 mL和4 mL時(shí)回收率基本不變，曲線平緩。考慮到洗脫效果和經(jīng)濟(jì)及環(huán)保效益，最終選擇洗脫劑用量為3 mL。

圖5　不同洗脫劑用量對9種NOCs的回收率Fig. 5　Recoveries of 9 nitrosamines with different volumes of the eluant

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及檢出限

以高效液相色譜分離9種NOCs，在前述最優(yōu)色譜分離與檢測條件下，考察NOCs的峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.1～20 μg/mL之間線性關(guān)系良好，根據(jù)3 倍信噪比和10 倍信噪比得出9種NOCs的儀器檢出限與定量限，見表3。

表3　高效液相色譜測定9種NOCs的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及檢出限、定量限Table 3 Standard curve equations, limit of detection and limit of quantitation for 9 nitrosamines by HPLC

2.4方法回收率和精密度

在空白樣品中分別添加混合NOCs標(biāo)準(zhǔn)溶液使其添加量分別為5、10、15 μg/g，在儀器工作條件下，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4　方法回收率和精密度（n=6）Table 4 Precision (RSD) and spiked recoveries (n= 6)

2.5實(shí)際樣品測定結(jié)果

圖6　實(shí)際樣品測定色譜圖Fig. 6　Chromatogram of 9 NOCs in real meat samples

利用本研究建立的方法分析測定了4 個(gè)品種的肉制品樣品中9種NOCs的含量，實(shí)際樣品定圖譜見圖6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。在4種受檢樣品中均未檢測到NMOR、NMEA、NPIP、NDPA、NDPhA；NDMA以及NDEA在4種樣品中都有檢測出，其含量分別在0.13～0.31 μg/kg之間和0.18～0.36 μg/kg之間；在1號和3號樣品中檢測到了NPYR，1、3號和4號樣品中檢測到了NDBA；這種結(jié)果可能是肉品原料、發(fā)酵工藝以及實(shí)驗(yàn)誤差所導(dǎo)致的。

表5　實(shí)際樣品中檢測到9種NOCs的含量Table 5　Contents of 9 NOCs in real meat samples

3　結(jié) 論

本研究建立了超聲提取-固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測器檢測法測定9種NOCs含量的分析方法，在檢測肉制品時(shí)能有效提取并凈化其中的NOCs，降低其他物質(zhì)的干擾，方法精密度和回收率均符合分析的要求，且儀器通用、前處理方便、操作簡便。該方法對于NOCs的分析研究具有良好的應(yīng)用前景。

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Determination of Nine N-Nitroso Compounds in Meat Products by Solid Phase Extraction Purification and High Performance Liquid Chromatography

CAI Lufeng1,2, LI Na1,2, DU Sha1, TAN Ya1, LI Ke1, WANG Yuanliang1,*
(1. Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha410128, China; 2. Department of Cooking, Hunan Commercial Techincian Institute, Zhunzhou412000, China)

Abstract:A solid-phase extraction (SPE)-high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for simultaneous determination of 9 N-nitroso compounds (NOCs) in meat products. The analytes were extracted with methanol at 60 ℃ ultrasonically, purified by a CNWBOND HC-C18SPE column, and analyzed by HPLC on a Phenomenex AQ-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) employing methanol and ultrapure water as the mobile phase in a gradient elution mode. The 9 N-nitroso compounds were qualitatively determined by retention time, and confirmed by ultraviolet spectroscopy. The results indicated that the calibration curves of the target analytes displayed good linearity with correlation coefficients (r) greater than 0.99. The method limits of quantification (MLOQ) for the target analytes ranged from 0.047 to 0.097 μg/g (RSN=10). The recoveries were in the range between 72.6% and 97.6%, and the precision (relative standard deviation, RSD) ranged from 3.1% to 7.9% (n = 6).

Key words:N-nitroso compounds; solid phase extraction (SPE); high performance liquid chromatography (HPLC); meat products

收稿日期：2015-09-20

基金項(xiàng)目：湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目（2014GK1034）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11JJ4019）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015WK3015）；湖南農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工崗位專家項(xiàng)目；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303082）

作者簡介：蔡魯峰（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xslhdb@163.com

*通信作者：王遠(yuǎn)亮（1977—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：Wang@hunau.net

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612039

中圖分類號：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0217-05