芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因克隆及表達(dá)分析

羅睿雄　趙志?！↑S建峰　黨志國(guó)　高愛平

摘 要 采用3′RACE和RT-PCR技術(shù)克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析該基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明：MiNDPK1基因cDNA全長(zhǎng)1 019 bp，開放閱讀框?yàn)?47 bp，編碼148個(gè)氨基酸。MiNDPK1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，無信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，具有典型的核苷二磷酸激酶活性結(jié)構(gòu)域和其他磷酸化活性位點(diǎn)；與麻瘋樹、橡膠樹同源性最高為89%，與菠菜同源性最低為82%。MiNDPK1在芒果各組織中均有表達(dá)，以葉片中表達(dá)最高，其次是花和果皮；在芒果進(jìn)入生殖時(shí)期的花芽分化期表達(dá)量最高，此后在芒果果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中逐漸降低并趨于平穩(wěn)。結(jié)合病害處理轉(zhuǎn)錄組樣本中的差異性表達(dá)結(jié)果，推測(cè)芒果MiNDPK1基因在花芽分化進(jìn)程、抗病性誘導(dǎo)及免疫應(yīng)答通路上發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 芒果；核苷二磷酸激酶；基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一種保守性多功能蛋白，其首要功能是依靠該酶上一保守的組氨酸殘基介導(dǎo)催化二磷酸核苷（Nucleoside diphosphate，NDP）和三磷酸核苷（Adenosine triphosphate，ATP）之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)來維持生命體細(xì)胞內(nèi)ATP和NTP等濃度的平衡[1]，參與UTP和GTP生物合成過程，在生物體新陳代謝方面起重要作用。NDPK蛋白由Berg等[2]于1953年發(fā)現(xiàn)以來，主要在人和動(dòng)物領(lǐng)域研究較為深入，植物中研究較晚，但其普遍存在于原核、真核生物中，并多數(shù)以四聚體的形式存在于原核生物中，而在真核生物中卻以六聚體形式存在；已有研究結(jié)果認(rèn)為，NDPKs基因是一種古老基因，并以家族的形式存在，定位于細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體及葉綠體中，是一種分泌蛋白。人類基因組中存在8個(gè)NDPKs基因（NDPKH1-NDPKH8），植物中發(fā)現(xiàn)的主要有NDPK1-4四個(gè)類型（擬南芥、水稻），而支原體等部分微生物不存在NDPKs基因，但多數(shù)物種存在至少一種NDPK基因[3]。

隨著研究的深入，NDPKs被看作是一種“管家酶”，主要功能是維持NDP和NTP代謝平衡[1]。NDPK以其具有催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的功能，在動(dòng)物中不同細(xì)胞環(huán)境發(fā)揮特異性功能，起著控制細(xì)胞增殖、調(diào)控轉(zhuǎn)錄[4]、蛋白質(zhì)磷酸轉(zhuǎn)移[5-7]、DNA修復(fù)損傷[8]、細(xì)胞分化[9]、細(xì)胞的移動(dòng)[10]、糖類和脂類代謝[11-12]等作用；而動(dòng)物核苷二磷酸激酶家族中的2個(gè)重要成員NDPK-A和NDPK-B中的NDPK-A與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切，NDPK-A被認(rèn)為通過多種作用機(jī)制抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌和惡性黑色素瘤等癌癥患者癌組織中的表達(dá)水平與癌組織的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)[13-16]，也用于腫瘤（NDKA）和結(jié)直腸癌（CRC）等病癥的生物標(biāo)志物[17]。在植物體上，NDPKs除在植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育[18-19]、內(nèi)源激素[20]、植物色素A/B[21]和煙草細(xì)胞凋亡[22]起調(diào)控作用外，還參與如鹽害、低溫[23]、高溫[24]、干旱[25]、機(jī)械損傷[26]、熱激[27]、紫外光照射[28]、氧化脅迫[29]、金屬離子[30]、化學(xué)藥劑（甲基紫羅堿和脫落酸等）[31-32]、病害[33]等生物與非生物堿脅迫的應(yīng)答機(jī)制。此外，NDPKs也參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[29，34]、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]、保護(hù)防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)[36]及響應(yīng)光剌激等方面的作用。

芒果（Mangifera indica L.）是中國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界第二大熱帶水果，素有“熱帶水果之王”的美稱。芒果的熱帶屬性導(dǎo)致芒果對(duì)逆境脅迫比較敏感，如開花期的低溫陰雨天氣，容易引起芒果授粉受精不良，座果率降低，也易導(dǎo)致病害的發(fā)生促使芒果大量腐爛[37]；干旱、鹽等脅迫后易導(dǎo)致芒果果實(shí)變小、產(chǎn)量降低，從而影響品質(zhì)[38]。本試驗(yàn)在芒果炭疽病樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找的差異性表達(dá)序列，經(jīng)比對(duì)確認(rèn)該片段為芒果核苷二磷酸激酶（NDPK）基因，根據(jù)片段序列設(shè)計(jì)3′RACE引物，并擴(kuò)增3′端序列，經(jīng)拼接比對(duì)分析，預(yù)測(cè)獲得含開放閱讀框的cDNA序列；進(jìn)一步設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，然后PCR擴(kuò)增獲得準(zhǔn)確全長(zhǎng)基因序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和不同組織器官的表達(dá)模式分析，旨在為進(jìn)一步探明芒果核苷二磷酸激酶基因的功能作用、調(diào)控逆境脅迫及免疫應(yīng)答通路方面的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試芒果品種為貴妃芒，保存于海南省儋州市的農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)資源圃。選擇生長(zhǎng)一致的貴妃芒，采集芒果根、莖、葉、花、果，用于不同組織器官的表達(dá)分析；采集芒果從花芽分化期至果實(shí)成熟期之間不同時(shí)期組織材料，用于芒果果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)分析。所有采集組織材料液氮速凍并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 提取芒果RNA，參照天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit說明書進(jìn)行，采用TAKARA的 3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase反轉(zhuǎn)錄獲得3′RACE擴(kuò)增cDNA模版，采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA模板，具體操作參照說明書進(jìn)行。

1.2.2 NDPK1基因克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)序列片段，運(yùn)用Primer 5設(shè)計(jì)3′RACE特異引物3′-GSP1、3′-GSP2；以拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)MiNDPK1基因的全長(zhǎng)特異引物MiNDPK1-F1、MiNDPK1-R1（表1）。以3′RACE cDNA模板擴(kuò)增NDPK1基因3′端序列，使用上游外側(cè)特異性引物（3′-GSP1）和3′RACE Outer Primer進(jìn)行1st PCR反應(yīng)。如果1st PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物，再使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物（3′-GSP2）和3′RACE Inner Primer進(jìn)行2nd PCR反應(yīng)。 外側(cè)PCR反應(yīng)體系設(shè)置為：cDNA模板2 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 2 μL，3′RACE Outer Primer和3′-GSP1引物各（10 μm） 2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+）4 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，LA Taq（5 U/μL）0.25 μL，補(bǔ)足水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；第二輪PCR反應(yīng)則以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，取2 μL作為模版進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，除引物更換為內(nèi)側(cè)引物外，其余體系同第一輪PCR，PCR反應(yīng)程序同第一輪，但循環(huán)數(shù)改為30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，取 5～10 μL的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)3′RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再進(jìn)行回收純化，連接到pMD18-T克隆載體上并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的DH5α大腸桿菌中，涂板培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證獲得陽(yáng)性單克隆送往英俊公司測(cè)序。

1.2.3 MiNDPK1基因生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder查找基因開放閱讀框ORF，采用DNAMAN軟件推導(dǎo)氨基酸序列；采用CLUSTA W進(jìn)行NDPK1氨基酸多重序列比對(duì)；采用MEGA6構(gòu)建不同物種NDPK1蛋白氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用NCBI BlastP對(duì)芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析；使用ProtParam在線預(yù)測(cè)MiNDPK1蛋白理化性質(zhì)；使用Subloc v1.0在線亞細(xì)胞定位；采用SMART和Motif Scan、Scanprosite在線分析蛋白功能結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA在線預(yù)測(cè)NDPK1的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

1.2.4 MiNDPK1基因的表達(dá)分析 根據(jù)獲得的芒果NDPK1基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物MiNDPK1-F2、MiNDPK1-R2；以芒果Actin1肌動(dòng)蛋白基因設(shè)計(jì)內(nèi)參引物Actin-F、Actin-R（表1）。實(shí)時(shí)定量PCR在Thermo PikoReal上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為10 μL，具體參照TAKARA公司SYBRTMTPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程度為：95 ℃ 7 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理與圖標(biāo)制作采用Excel 2013和DPS7.05統(tǒng)計(jì)軟件，差異顯著性分析采用Ducan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiNDPK1基因克隆

以芒果總RNA反轉(zhuǎn)錄的3′RACE cDNA為模板擴(kuò)增芒果NDPK基因的3′端序列，得到500 bp的條帶（圖1-A），經(jīng)回收、純化、亞克隆，將陽(yáng)性單克隆送樣測(cè)序后，獲得序列與轉(zhuǎn)錄組獲得的原序列片段拼接。以拼接的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物擴(kuò)增獲得含ORF的全長(zhǎng)編碼序列，約為450 bp（圖1-B），經(jīng)NCBI比對(duì)，確認(rèn)獲得含有ORF的芒果核苷二磷酸激酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為MiNDPK1。其cDNA全長(zhǎng)1 019 bp，5′-UTR長(zhǎng)度為348 bp，3′-UTR長(zhǎng)度為224 bp，且含有16 bp的ployA尾巴，完整開放閱讀框ORF全長(zhǎng)為447 bp，編碼148個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2 MiNDPK1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 MiNDPK1同源性分析 采用NCBI BlastP對(duì)芒果MiNDPK1基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，芒果MiNDPK1與其他物種的氨基酸序列同源性在82%～90%，其中與麻瘋樹Jatropha curcas（ADB85102）、橡膠樹Hevea brasiliensis（ADR30796）、木薯Manihot esculenta（OAY49435）同源性最高為89%，與菠菜Spinacia oleracea（KNA14344）同源性最低為82%。不同物種NDPK氨基酸序列同源性均高達(dá)82%以上，結(jié)合由Clustal W多重序列比對(duì)結(jié)果（圖3），說明NDPK1蛋白在進(jìn)化上的高度保守性。進(jìn)一步用MEGA6.0軟件將芒果MiNDPK1與其他物種的25個(gè)NDPK蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），芒果與毛果楊Populus trichocarpa（ABK95604）、風(fēng)信子Hyacinthus orientalis（AAT08712）、可可樹Thebroma cacao（EOX96493）、野山茶Camellia sinensis（AEC10975）、橡膠樹、木薯等聚為一大類，形成木本植物中熱帶亞熱帶植物較近的親緣關(guān)系。而與花生Archis hypogaea（AAZ20283）、大豆Glycine max（ACU14249）、玉米Zea mays（DAA46325）等草本植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此，利用同源基因的進(jìn)化距離可明顯區(qū)分各科屬間的進(jìn)化關(guān)系。

2.2.2 MiNDPK1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam在線分析結(jié)果表明，MiNDPK1蛋白分子式為C748H1 163N195O213S5，相對(duì)分子質(zhì)量為16.45 ku，等電點(diǎn)為6.58，正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為18，負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為17；脂肪系數(shù)為86.22，總平均疏水性為-0.142，不穩(wěn)定系數(shù)為29.53，是穩(wěn)定蛋白；亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)（RI=9），無信號(hào)肽，也不存在跨膜區(qū)域。經(jīng)過SMART和Scanprosite軟件在線分析，MiNDPK1編碼氨基酸中第2～136為典型核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinases）活性結(jié)構(gòu)域，76～79、83～86為酰胺化位點(diǎn)，43～46為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，12～17、99～104為N端肉蔻?；稽c(diǎn)，31～33、53～55、83～85、100～102為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，102～104為細(xì)胞連接序列，42～49為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，112～120為核苷二磷酸激酶活性位點(diǎn)。利用SOPMA在線預(yù)測(cè)NDPK1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，42個(gè)α-螺旋占28.38%，43個(gè)隨機(jī)卷曲占29.05%，41個(gè)延伸鏈占27.70%，22個(gè)β-轉(zhuǎn)角占14.86%。

2.3 MiNDPK1基因的表達(dá)分析

2.3.1 MiNDPK1基因在不同組織器官中的表達(dá)分析 檢測(cè)芒果不同組織器官中MiNDPK1基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，MiNDPK1基因在根、莖、葉、花、果實(shí)等器官中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)量最高，其次是果皮和花，在莖和種子中的表達(dá)量最低（圖5）。

2.3.2 MiNDPK1基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 根據(jù)芒果MiNDPK1基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)模式分析可知，MiNDPK1基因在芒果花芽分化期表達(dá)量最高，其后進(jìn)入花期迅速下降，下降幅度為66.59%，進(jìn)入果期后在種子發(fā)育過程中平穩(wěn)表達(dá)（圖6）。

3 討論與結(jié)論

NDPK1蛋白是屬于NDPK家族蛋白之一，布于真核、原核生物中。動(dòng)物中主要有平衡細(xì)胞內(nèi)ATP和NTP濃度及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能[1，13-15]。在植物中存在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答、病蟲害感應(yīng)等作用[26，30，33，36]。目前，已經(jīng)從菠菜Spinacia oleracea（KNA14344）[39]、擬南芥Arabidopsis thaliana（AEE82742）[40]、煙草Nicotiana tabacum（AAZ85394）[41]、豌豆Pisum sativum（BAA12982）、嗜冷假交替單胞菌Psychrophilic Pseudoalteromonas sp.[42]等物種中克隆到NDPKs基因。本實(shí)驗(yàn)首次從芒果葉片中克隆到MiNDPK1基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1 019 bp，開放閱讀框477 bp，編碼148個(gè)氨基酸，定位于細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白不具有信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，說明其不存在膜受體功能，亦不能定位于膜的錨定蛋白或離子通道等，這與其他如甘蔗[25]等物種NDPK1基因具有相似的結(jié)構(gòu)功能。另外，該蛋白含有酪蛋白激酶ii、蛋白激酶C、酪氨酸激酶，特別是核苷二磷酸激酶等多個(gè)磷酸化活性位點(diǎn)，使得NDPK1蛋白可通過磷酸化與去磷酸化調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶活性功能，并使之對(duì)外界刺激產(chǎn)生迅速的反饋調(diào)節(jié)。這表明NDPK1具有重要的化學(xué)反應(yīng)催化功能及其調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫的作用機(jī)制。NDPK1的進(jìn)一步深入研究將有助于揭示其生物學(xué)特性并開發(fā)可能存在的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

已有研究結(jié)果表明，植物胞質(zhì)中的NDPK1是NDPKs的主要存在形式，占NDPKs總活性的70%以上，幾乎分布于根尖葉片、塊莖等所有再生組織中[43]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)芒果MiNDPK1基因在不同組織器官表達(dá)量分析結(jié)果表明，MiNDPK1在根、莖、葉、花、果實(shí)等器官中中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)量最高，其次為果皮，這可能是因NDPKs能夠結(jié)合植物光敏色素的紅激發(fā)形式提高自身活性功能，參與植物光敏色素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[20]及通過調(diào)控其他相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響葉綠體發(fā)育和葉綠素的生物合成[44]有關(guān)，表明NDPKs對(duì)植物光合作用起到關(guān)鍵作用。其在芒果花芽分化期的高表達(dá)量也印證了NDPKs主要分布于根尖、葉片等再生組織，并在植物早期生長(zhǎng)和分化階段發(fā)揮作用的觀點(diǎn)[31]，與Galvis等[45]研究豌豆MtNDPK基因在幼嫩葉片及花蕾生殖器官表達(dá)量高于其他組織器官的結(jié)論一致。

NDPK1也參與植物傷害、熱休克、低溫、干旱、鹽、金屬離子和化學(xué)藥劑等逆境脅迫應(yīng)答，并起到正向調(diào)控的作用[25-29，32，46-47]，脅迫消失后應(yīng)答終止[27]。如干旱處理甘蔗幼苗和鷹嘴豆莖后NDPK基因均表達(dá)上調(diào)[25，48]；NDPK還可誘導(dǎo)冷脅迫相關(guān)基因pBC442、病程相關(guān)蛋白基因OsPR2a、氧化脅迫相關(guān)蛋白基因POD、CAT、OsPR4等保護(hù)防御相關(guān)基因或參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[36，46，49]。本試驗(yàn)所用序列片段亦是從芒果病害轉(zhuǎn)錄組樣本差異基因中獲得，預(yù)示芒果MiNDPK1也可能參與芒果病害的響應(yīng)或調(diào)控其他抗病相關(guān)基因的表達(dá)而提高其抗病能力。但具體的抗病機(jī)理和調(diào)控機(jī)制還需深入到蛋白質(zhì)組水平上研究才能予以明確。

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