甘蔗環(huán)斑病菌鑒定及其生物學(xué)特性分析

汪全偉　吳偉懷　兀旭輝　梁艷瓊　董俊葉　賀春萍

摘 要 甘蔗環(huán)斑病是甘蔗較為常見的一種真菌性病害。針對(duì)海南昌江十月田甘蔗種植地出現(xiàn)一種嚴(yán)重危害疑似環(huán)斑病的葉斑病，本文通過對(duì)其病原菌的形態(tài)學(xué)特征觀察，并結(jié)合ITS序列系統(tǒng)聚類分析，將葉斑病病菌鑒定為引起環(huán)斑病的甘蔗小球腔菌Leptosphaeria sacchari。生物學(xué)特性分析結(jié)果表明：適宜該菌生長(zhǎng)的溫度為13～30 ℃，最適溫度為 25 ℃；適宜菌絲體生長(zhǎng)的pH為4～11，最適pH為5，全黑暗有利于菌絲體的生長(zhǎng)；適宜生長(zhǎng)的碳源為麥芽糖和葡萄糖、氮源為硝酸鈉和L-絲氨酸。采用生長(zhǎng)速率法對(duì)6種殺菌劑敏感性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果揭示咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈、腈菌唑等4種藥劑對(duì)甘蔗環(huán)斑病菌具有顯著的抑制效果，其EC50值分別為0.397 6、2.251 9、2.163 4、4.827 3 μg/mL。

關(guān)鍵詞 甘蔗環(huán)斑??；小球腔菌；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

甘蔗環(huán)斑?。⊿ugarcane ring spot）又名輪斑病，是甘蔗上較常見的一種真菌性病害。自1890年印度尼西亞爪哇首次報(bào)道該病以來，迄今幾乎所有植蔗國(guó)家都有發(fā)生。此病多危害糖蔗老葉，當(dāng)條件適宜時(shí)，也可為害葉鞘和蔗莖。嚴(yán)重時(shí)，該病使葉片提早枯死，直接影響甘蔗的產(chǎn)量與含糖量。此外，環(huán)斑病也能危害果蔗，且該病在果蔗上具有感病快、傳染快，連作地易發(fā)病等特點(diǎn)[1]。目前該病在中國(guó)蔗區(qū)普遍發(fā)生[2-8]。然而，針對(duì)此病的相關(guān)研究比較少。目前關(guān)于甘蔗環(huán)斑病的研究?jī)H限于病害調(diào)查及大田防控試驗(yàn)。貴州果蔗病害重災(zāi)區(qū)的調(diào)查結(jié)果表明，環(huán)斑病是危害果蔗的主要病害之一，該病可導(dǎo)致果蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響[9]；李向勇與易代勇則對(duì)黔糖3號(hào)環(huán)斑病作了田間藥效防控試驗(yàn)[9]。

2015年7月本課題組在對(duì)海南甘蔗種植區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，海南昌江十月田甘蔗種植地出現(xiàn)一種疑似甘蔗環(huán)斑病的葉斑病，嚴(yán)重影響其甘蔗產(chǎn)量。為了明確其病原菌，以及掌握該病的發(fā)生與流行條件，本研究對(duì)采集的典型病樣進(jìn)行了分離與鑒定，并進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)特性分析和防治藥劑的篩選，以期為掌握該病的病菌流行規(guī)律以及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 病葉樣品采自海南昌江十月田甘蔗種植地。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試馬鈴薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基按如下配方進(jìn)行配制：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水定容至1 000 mL；而Czapek基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制為：硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水定容至1 000 mL。上述培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.1.3 試劑、引物及菌株 真菌DNA小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。rDNA-ITS通用引物ITS1/ ITS4序列[10]，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司采用普通脫鹽方式合成；大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與形態(tài)觀察 利用常規(guī)組織分離法，對(duì)具有典型癥狀的甘蔗葉片進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)。記錄病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與菌絲體顏色，并于顯微鏡下對(duì)分生孢子器及分生孢子的形態(tài)、顏色、大小等進(jìn)行觀察。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定 利用柯赫氏法對(duì)分離物進(jìn)行致病性測(cè)定。將分離物在PDA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)6 d左右。采用菌餅法，利用健康新臺(tái)糖22號(hào)甘蔗離體葉片接種，保濕，5 d后觀察其是否發(fā)病，并從病部對(duì)病原菌進(jìn)行再分離，觀察所分離物是否與原分離物的形態(tài)特征一致。

1.2.3 基于r DNA-ITS 區(qū)序列的病原菌分子鑒定

病原菌基因組總DNA的提取參照OMEGA真菌DNA小量提取說明書進(jìn)行提取。利用引物ITS1/ ITS4對(duì)病原菌基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物回收采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TaKaRa），按試劑盒說明書進(jìn)行操作。取4 μL回收產(chǎn)物與pEASYTM Cloning Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，選取3個(gè)陽性克隆子送英濰捷基（廣州）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.4 rDNA-ITS序列比對(duì)分析 將測(cè)序得到的rDNA-ITS序列經(jīng)兩端去載體序列后，于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST比對(duì)及同源序列分析，并利用MEGA 4.0軟件中鄰接法 （neighbor-joining，NJ）進(jìn)行聚類分析，繪制出相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性分析

（1）不同溫度下菌落生長(zhǎng)速率測(cè)定。以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種菌絲塊（5 mm，下同），分別于5、13、20、25、28、30、37 ℃等7個(gè)梯度溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。重復(fù)3次，下同。

（2）不同酸堿度下菌落生長(zhǎng)速率測(cè)定。以1為梯度，分別將已滅菌的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為pH4.0至pH11，迅速倒制平板。冷卻后，接種菌絲塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后測(cè)量菌落直徑（重復(fù)3次；下同）。

（3）光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。將直徑為5 mm的菌絲塊接種于PDA平板中央，分別置于全日光照、12 h光照/12 h黑暗、全日黑暗等3種條件下培養(yǎng)。

（4）不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響。以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以等量的蔗糖（20 g）、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-木糖、和D-半乳糖作為碳源，配制成不同碳素營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基。接種菌絲塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后測(cè)量菌落直徑。

（5）不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響。以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)供試硝酸鈉、L-精氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸等其氮素均折算為0.329 4 g/L純氮素進(jìn)行配制，配制成不同氮素營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基，備用。

1.2.6 不同藥劑對(duì)甘蔗環(huán)斑病菌敏感性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定甘蔗環(huán)斑病菌對(duì)6種殺菌劑的敏感性（表1）。將甘蔗環(huán)斑病菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃預(yù)培養(yǎng)6 d。于菌落邊緣打取菌餅（內(nèi)徑5 mm），后將菌餅分別接入含藥平板中央，每處理設(shè)3次重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表，將抑制百分率換算成抑制機(jī)率值。以處理濃度（mg/L）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)抑制機(jī)率值為縱坐標(biāo)求出毒力回歸方程，并求出抑制中濃度EC50、EC95和相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與形態(tài)特征

甘蔗環(huán)斑病主要侵染老葉，有時(shí)也會(huì)危害嫩葉、葉鞘以及蔗莖。葉片被危害時(shí)，呈墨綠色至褐色，長(zhǎng)卵圓形，病斑具有輪廓分明的淡黃色邊緣，中心為枯白色或草黃色，有時(shí)整個(gè)病斑保持紅色或紅褐色（圖1-A、B）。于田間采集典型病葉帶回實(shí)驗(yàn)室分離，經(jīng)單孢分離獲得菌株，編號(hào)為SL10。病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形、邊緣整齊；菌絲體白色后期變灰色、生長(zhǎng)旺盛，棉絮狀，中部稍隆起，菌落背面呈淡青色（圖2）。分生孢子器扁球形，黑色；分生孢子初無色，老熟時(shí)淡褐色，單胞，大小為2.713～8.395 μm-1.432～5.010 μm（隨機(jī)測(cè)量100個(gè)分生孢子）（圖3）。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則將SL10菌株進(jìn)行致病性測(cè)定（圖4），5 d后觀察到不規(guī)則病斑，顏色形狀與在田間自然發(fā)病得到的病斑顏色一致，再分離獲得的菌株鏡檢后，觀察到病原菌形態(tài)及分生孢子特征也一樣。由此表明，該病菌確為致病菌。

2.3 病原菌分子鑒定

通過ITS1/ITS4引物進(jìn)一步對(duì)該菌進(jìn)行分子確認(rèn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得一條大小約為0.5 kb的條帶（圖5），經(jīng)測(cè)序最后所得534 bp全長(zhǎng)序列。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTn序列經(jīng)比對(duì)分析，結(jié)果表明，該序列與數(shù)據(jù)庫中KC005678～KC005680（Leptosphaeria sacchari）來自玉米甘蔗小球腔菌ITS的復(fù)蓋度為100%，其同源性高達(dá)99%。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的13條Leptosphaeria屬序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹揭示，SL10與Leptosphaeria sacchari的同源性最高，聚為一個(gè)分枝（圖6）。最終結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將SL10鑒定為甘蔗小球腔菌Leptosphaeria sacchari。

2.4 病原菌生物學(xué)特性分析

根據(jù)病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，甘蔗小球腔菌菌絲體生長(zhǎng)的合適溫度為13～30 ℃，最適宜溫度為25 ℃，低于13 ℃或高于30 ℃時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)受抑制或不能生長(zhǎng)（圖7-A）；合適pH值范圍為4～11，最適宜的pH值為5（圖7-B）；全黑暗培養(yǎng)最有利于病原菌生長(zhǎng)（圖7-C）；該病菌在含麥芽糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)狀況最好，菌絲致密茂盛，生長(zhǎng)速率快，由此表明麥芽糖和葡萄糖是該菌生長(zhǎng)的最適合碳源（圖7-D）；該病原菌在含L-絲氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快（圖7-E），菌絲體生長(zhǎng)濃密，為該菌生長(zhǎng)的最適氮源。

2.5 病原菌殺菌劑敏感性測(cè)定

敏感性實(shí)驗(yàn)表明，各供試藥劑濃度對(duì)數(shù)與生長(zhǎng)抑制率幾率值之間表現(xiàn)出線性相關(guān)，只是不同殺菌劑對(duì)甘蔗環(huán)斑病菌的毒理存在明顯差異。在6種供試藥劑中，其中咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈、腈菌唑等4種藥劑對(duì)甘蔗環(huán)斑病菌菌絲體生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，其平均EC50值分別為0.397 6、2.251 9 L、2.163 4、4.827 3 μg/mL。比較而言，代森錳鋅的抑制作用較差，其EC50值為19.919 8 μg/mL；而百菌清對(duì)環(huán)斑病菌抑制效果最差，其EC50值高達(dá)385.064 4 μg/mL（表2）。在EC95方面藥劑之間差異則更加明顯，其最小值與最大值范圍介于5.583 4～63 268.18 μg/mL之間，兩者相差達(dá)113 957倍（表2）。

3 討論與結(jié)論

甘蔗環(huán)斑病是甘蔗葉片上一種普遍發(fā)生的真菌性病害。一直以來，該病害并未被引起足夠重視。近年來，該病呈現(xiàn)出危害加重之勢(shì)[2，4-5]。根據(jù)調(diào)查顯示，在貴州甘蔗環(huán)斑病由以前的次要病害上升為主要病害了[9]。本研究針對(duì)海南昌江十月田甘蔗種植地出現(xiàn)一種疑似甘蔗環(huán)斑病的葉斑病，開展了病原菌的分離與鑒定，最終將疑似葉斑病其病原菌鑒定為引起環(huán)斑病的小球腔菌[Leptosphaeria sacchari V. Breda. de Haan]。本研究中無論是觀察到的病癥還是病原鑒定結(jié)果均與易代勇等[1]報(bào)道的甘蔗小球腔菌危害癥狀以及形態(tài)特征相一致。隨后，進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與山楊黑色小球腔菌相似，在溫度為25 ℃左右條件下有利于病害的發(fā)生[11]。據(jù)了解，本研究系第一次較為詳細(xì)報(bào)道甘蔗環(huán)斑病病原鑒定及生物特性。

有關(guān)該病的化學(xué)藥劑防治研究方面，李向勇和易代勇對(duì)果蔗黔糖3號(hào)環(huán)斑病作了田間藥效防控試驗(yàn)，篩選出防效較好的藥劑為70%甲托+50%代森錳鋅混合液和50%氯溴異氰尿酸600倍液[9]。為了獲得更多防治該病害藥劑，本研究對(duì)6種化學(xué)藥劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定。藥劑篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，95%咪鮮胺抑菌效果最好；其次是80%多菌靈，96.4%丙環(huán)唑次之，百菌清的抑菌效果最差。需要注意的是，此次藥劑試驗(yàn)中，僅在室內(nèi)做了毒力測(cè)定，篩選出了幾種效果較好的殺菌劑，并未得到室外或大田試驗(yàn)的驗(yàn)證，所以上述幾種殺菌劑對(duì)環(huán)斑病菌的抑菌作用還有待進(jìn)一步的明確，以便更科學(xué)地指導(dǎo)大田防治。

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