呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式與纖毛擺動(dòng)頻率的研究進(jìn)展

李童斐 秦生輝

[摘要] 呼吸道上皮細(xì)胞在呼吸疾病的發(fā)生發(fā)展中占有重要的地位，哺乳動(dòng)物呼吸道上皮表面覆蓋有纖毛，纖毛的擺動(dòng)可以保護(hù)呼吸系統(tǒng)免于細(xì)菌、病毒以及其他致病因素的損害。因此纖毛擺動(dòng)頻率（CBF）的調(diào)控成為許多呼吸疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，可以用來研究呼吸道炎癥、吸煙、感染、呼吸系統(tǒng)腫瘤等多種疾病。體外研究CBF的方法多是采用借助呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)以及活體呼吸道上皮分離等手段，但呼吸道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)具有雜細(xì)胞多、不易分化纖毛等諸多問題。呼吸道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)模式不斷發(fā)展，本文簡述了呼吸道上皮細(xì)胞主要的兩種原代培養(yǎng)模式及各自的主要培養(yǎng)方法及改進(jìn)發(fā)展情況，同時(shí)介紹并總結(jié)了呼吸道上皮細(xì)胞纖毛分化的鑒定及其擺動(dòng)頻率的檢測(cè)，明確了各類培養(yǎng)模式對(duì)操作流程、培養(yǎng)周期、尤其是纖毛分化及擺動(dòng)頻率的影響，為在現(xiàn)有培養(yǎng)模式下改進(jìn)技術(shù)得到能夠誘導(dǎo)纖毛分化的有效培養(yǎng)方法奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 呼吸道上皮細(xì)胞；纖毛擺動(dòng)頻率；培養(yǎng)模式；纖毛分化

[中圖分類號(hào)] R56 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（b）-0040-04

[Abstract] Respiratory epithelial cell plays an important role in the development of respiratory diseases. The respiratory epithelial surface of mammalian airway were covered with cilia. The beat of the cilia can protect the respiratory system from bacteria， virus and other harmful factors. Therefore， cilia beat frequency （CBF） became a crucial element of regulating the progress of many kinds of respiratory diseases. It can be used to research inflammation， smoke， infection and respiratory tumor. The technologies of respiratory epithelial cell culture and separation of epithelium in vivo were applied to research CBF. These culture methods， however， had many problems which include low differentiation of cilia and many mixed cells. With the culture mode developed continuously， this paper focused on the major culture mode of respiratory epithelial cells and the culture methods which were improved constantly under relevant culture mode. It also summarized the detection of differentiation of cilia and the CBF， defined the influence on the culture cycle， culture process， especially the differentiation of cilia which were subject to the culture mode， laid the foundation of improving the technology of respiratory epithelial cell culture.

[Key words] Respiratory epithelial cells； Cilia beat frequency； culture mode； Cilia differentiation

呼吸道上皮是呼吸系統(tǒng)的重要組成部分，是抵御外界環(huán)境中細(xì)菌、病毒、小分子粉塵等有害危險(xiǎn)致病因素的首道防線，一旦呼吸道上皮受到損傷，各種有害微生物以及其他危險(xiǎn)致病因素很快就侵入到下呼吸道，直接引發(fā)各類急性呼吸系統(tǒng)疾病，除此之外，在失去具有正常功能的呼吸道上皮保護(hù)下，危險(xiǎn)致病因素也可對(duì)呼吸系統(tǒng)深部組織呈現(xiàn)慢性刺激，導(dǎo)致發(fā)生諸如慢性阻塞性氣道疾病、腫瘤、硅肺、慢性氣道炎癥等各類呼吸系統(tǒng)慢性疾病的可能性升高。呼吸道上皮組織學(xué)結(jié)構(gòu)主要由包括以呼吸道上皮細(xì)胞為主的各類細(xì)胞所構(gòu)成，在鼻黏膜以及諸如氣管、主支氣管、段支氣管等呼吸道，呼吸道上皮層被密集的纖毛所覆蓋，這主要是由于構(gòu)成呼吸道上皮的氣道上皮細(xì)胞多為具有纖毛分化能力的纖毛上皮細(xì)胞，覆蓋在細(xì)胞表面的纖毛擺動(dòng)可以保護(hù)深部呼吸系統(tǒng)免于各類細(xì)菌、病毒、粉塵、煙霧的在呼吸道的滯留引發(fā)的慢性損傷，同時(shí)纖毛的定向節(jié)律運(yùn)動(dòng)也可以推動(dòng)呼吸道分泌黏液排除體外[1-2]，纖毛的擺動(dòng)快慢及其密度與呼吸道的黏液運(yùn)輸系統(tǒng)密切相關(guān)[3]，纖毛每秒的擺動(dòng)次數(shù)稱之為纖毛擺動(dòng)頻率（CBF），是判斷呼吸道上皮纖毛排除異物，保護(hù)呼吸系統(tǒng)的重要指標(biāo)之一，CBF的調(diào)控是許多呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵因素，其中研究發(fā)現(xiàn)鈣離子在調(diào)節(jié)纖毛運(yùn)動(dòng)中被認(rèn)為發(fā)揮了很大的作用[4]，同時(shí)在臨床上也有研究表明鼻部藥物的給藥方式及藥物溶解方式對(duì)CBF的影響很大[5]，在過敏性鼻炎的急性期，組胺能夠調(diào)節(jié)呼吸道纖毛的擺動(dòng)頻率[6]，近期也有研究表明，生物的年齡是影響呼吸道上皮纖毛擺動(dòng)的一個(gè)重要因素，且受到蛋白激酶Cε（PKCε）的調(diào)節(jié)[7]。因此，基于以上原因，在體外構(gòu)建呼吸道上皮細(xì)胞纖毛擺動(dòng)模型顯得至關(guān)重要，體外研究呼吸道上皮細(xì)胞以及CBF的方法主要是借助于呼吸道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)以及活體急性分離呼吸道組織體外培養(yǎng)，但由于呼吸道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)本身具有雜細(xì)胞多，細(xì)胞培養(yǎng)周期短，細(xì)胞表面不易分化纖毛等特點(diǎn)，隨著其培養(yǎng)模式不斷發(fā)展，眾多學(xué)者不斷探索更好的培養(yǎng)模式，以便于培養(yǎng)的細(xì)胞純度以及細(xì)胞功能與在人體呼吸道的上皮細(xì)胞更具相似性，能夠更好地分化纖毛，觀測(cè)到纖毛的擺動(dòng)，檢測(cè)到CBF。至今為止，關(guān)于呼吸道纖毛上皮細(xì)胞的培養(yǎng)模式的研究并不多，本文簡述了呼吸道上皮細(xì)胞兩種主要的原代培養(yǎng)模式及各自的主要培養(yǎng)方法及改進(jìn)發(fā)展情況，同時(shí)介紹并總結(jié)了呼吸道上皮細(xì)胞纖毛分化的鑒定及其擺動(dòng)頻率的檢測(cè)，明確了各類培養(yǎng)模式對(duì)操作流程、培養(yǎng)周期，尤其是纖毛分化及擺動(dòng)頻率的影響，為在現(xiàn)有培養(yǎng)模式下改進(jìn)技術(shù)得到能夠誘導(dǎo)纖毛分化的有效培養(yǎng)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 呼吸道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)模式

雖然在以往的研究中眾多學(xué)者建立的培養(yǎng)方式有很多，但根據(jù)其培養(yǎng)原理的差異性，呼吸道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)可以歸納起來分為兩大類，一類是借助呼吸道組織活性，利用快速處理過的急性分離的呼吸道組織，培養(yǎng)呼吸道細(xì)胞，這類方法的特點(diǎn)是爬出的細(xì)胞具有高度的組織活性，根據(jù)技術(shù)手段的不同，操作時(shí)間一般在數(shù)十分鐘至兩小時(shí)之內(nèi)，但根據(jù)處理方式及培養(yǎng)條件的各異，培養(yǎng)的上皮細(xì)胞可能含有較多的雜細(xì)胞甚至雜細(xì)胞含量過高抑制了上皮細(xì)胞的生長，這一類方法可歸納為活性組織培養(yǎng)模式。另一類培養(yǎng)模式是借助不同種類的蛋白酶將呼吸道上皮表面的細(xì)胞從呼吸道骨架上消化下來，將消化下來的細(xì)胞處理后重懸浮培養(yǎng)，這一類培養(yǎng)方法由于采用了各種不同的蛋白酶，氣道上皮細(xì)胞的活性受到了破壞，細(xì)胞的分化功能會(huì)受到損傷，細(xì)胞的純度也會(huì)根據(jù)所使用酶的種類不同也有所區(qū)別，且細(xì)胞培養(yǎng)周期一般較長，操作過程根據(jù)酶消化的條件不同可達(dá)2～24 h不等，這一類方法被歸納為酶消化細(xì)胞培養(yǎng)模式，也是目前報(bào)道較多的一類培養(yǎng)模式。

1.1 酶消化細(xì)胞培養(yǎng)模式

酶消化細(xì)胞培養(yǎng)是首例呼吸道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，其上皮組織取材來源于人的主支氣管，研究者利用型蛋白酶溶解在磷酸鹽緩沖液中，在4℃環(huán)境下對(duì)主支氣管的上皮細(xì)胞進(jìn)行消化，消化時(shí)間為24 h，結(jié)果通過透射電鏡與免疫組化等方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞的纖毛分化進(jìn)行檢測(cè)，該方法培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞纖毛分化較好，但由于過夜消化使得操作時(shí)間較長，且消化的細(xì)胞貼壁生長不好，對(duì)細(xì)胞的纖毛分化功能有一定的影響[8]。在此培養(yǎng)模式的基礎(chǔ)上，眾多學(xué)者在操作流程及培養(yǎng)材料及細(xì)節(jié)上進(jìn)行了修改，有學(xué)者使用人的主支氣管以及小鼠的鼻黏膜作為取材來源，同時(shí)采用了改良的氣液相聯(lián)合培養(yǎng)的方法，在使用相似的蛋白酶消化后，將消化下的細(xì)胞離心后重懸浮置于氣液相培養(yǎng)皿裝置中，該裝置模擬哺乳動(dòng)物氣道上皮層的生理解剖學(xué)環(huán)境，裝置中加入適量的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，使得細(xì)胞浸沒在含有上皮細(xì)胞培養(yǎng)基的溶液中，而同時(shí)又可以暴露在空氣環(huán)境中，這種模擬人體氣道上皮層的氣液相環(huán)境可以有效地在體外刺激并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的纖毛分化[9-10]。近期又有國內(nèi)學(xué)者利用類似的方法使用特殊培養(yǎng)基和鼠尾膠原包被的培養(yǎng)器皿成功培養(yǎng)了人鼻黏膜以及小鼠呼吸道上皮細(xì)胞，并詳細(xì)記錄了其生長情況，同時(shí)使用免疫組化和高速數(shù)碼攝像機(jī)檢測(cè)了纖毛的分化，培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的CBF對(duì)ATP刺激的反應(yīng)性很好，特殊培養(yǎng)基和膠原包被的培養(yǎng)器皿可以增強(qiáng)上皮細(xì)胞的貼壁能力，對(duì)細(xì)胞的生長和分化起到促進(jìn)作用[11-13]。不僅如此，該方法在改進(jìn)后還可以建立纖毛運(yùn)動(dòng)障礙模型，用以研究原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙（primary ciliary dyskinesia，PCD）等疾病[14]。氣液相培養(yǎng)結(jié)合酶消化細(xì)胞培養(yǎng)模式可以在體外快速獲取大量上皮細(xì)胞并且容易建立細(xì)胞的生長以及細(xì)胞表面纖毛分化的模型，但該方法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的纖毛分化也能受到多種因素的調(diào)控，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)諸如4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone（NNK）的化學(xué)試劑對(duì)于體外氣液相培養(yǎng)氣道上皮具有重要的調(diào)控作用，能在短時(shí)間內(nèi)影響細(xì)胞的正常生長與纖毛分化[15]，以上這些研究也為如何精準(zhǔn)調(diào)控體外酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞生長及纖毛分化墊定了基礎(chǔ)。

1.2 活性組織培養(yǎng)模式

運(yùn)用活性組織法培養(yǎng)模式的學(xué)者最早可追溯到1995年Dirksen ER，在他的研究中采用了分離的活性氣道上皮組織，并依靠其組織活性進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)使用鼠尾膠原作為其培養(yǎng)的鋪墊底物，利用了特殊的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，成功在體外培養(yǎng)出呼吸道上皮細(xì)胞，該方法雖然能獲得大量氣道上皮細(xì)胞，但操作過程繁瑣且精細(xì)，需要在顯微操作下完成氣道上皮層的分離，培養(yǎng)者在一定的訓(xùn)練后方能完成[16]。國內(nèi)部分學(xué)者在此方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，分別從兔、人的主支氣道及鼻黏膜取材，使用鼠尾膠原包被培養(yǎng)器皿，將有活性的氣道上皮組織或鼻黏膜組織剪碎，使其固定在培養(yǎng)器皿上，在培養(yǎng)的第4～7天，上皮細(xì)胞爬出并融合，可觀察到纖毛分化及穩(wěn)定的節(jié)律性擺動(dòng)[17-18]，研究者同時(shí)對(duì)纖毛的特定標(biāo)記蛋白黏蛋白5AC（mucin-5AC，MUC5AC）進(jìn)行了檢測(cè)，其表達(dá)呈陽性，掃描電鏡也可以觀察到濃密的纖毛分化[19]，充分肯定了這種培養(yǎng)模式可成功誘導(dǎo)有纖毛分化的細(xì)胞從組織周圍爬出。在近期，又有學(xué)者比較了采用呼吸道組織體外直接種植培養(yǎng)以及在體外培養(yǎng)后將組織分離開，發(fā)現(xiàn)前者培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞纖毛分化豐富，但后者纖毛分化較少，細(xì)胞在第7～10天時(shí)生長達(dá)到最佳狀態(tài)，且二者分化的纖毛擺動(dòng)頻率也較好，且對(duì)ATP的刺激反應(yīng)性也均較好[20]，這些研究為如何在體外選擇性構(gòu)建研究所需要的模型提供了基礎(chǔ)；與此同時(shí)，研究者檢測(cè)了纖毛上皮細(xì)胞的特定標(biāo)志物β-tubulin Ⅳ以及ZO-1的表達(dá)，表達(dá)呈陽性，結(jié)果顯示了培養(yǎng)的細(xì)胞纖毛分化豐富，且密度較高?；钚越M織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵主要在于取材的離體組織上皮活性是否完好，組織取下后能否在顯微鏡下直接觀察到組織上纖毛的擺動(dòng)；除此以外，培養(yǎng)器皿的膠原包被、特殊培養(yǎng)基的使用，這些都是誘導(dǎo)具有纖毛分化細(xì)胞爬出的關(guān)鍵因素。

2 呼吸道上皮細(xì)胞的纖毛分化

在通過以上培養(yǎng)模式獲取了大量的呼吸道上皮細(xì)胞或是活體取出了具有纖毛的氣道組織后，要檢測(cè)細(xì)胞的纖毛分化或組織的纖毛分化情況，目前常用的檢測(cè)方法包括免疫組織化學(xué)檢測(cè)上皮細(xì)胞特定蛋白表達(dá)、掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細(xì)胞或組織表面纖毛的生長密度及高度，以及采用高速顯微攝像技術(shù)觀察CBF并直接記錄纖毛擺動(dòng)情況。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的特定標(biāo)記蛋白主要包括前面所提到的β-tubulin Ⅳ以及mucin-5AC，這兩種蛋白為纖毛上皮細(xì)胞所特定的表達(dá)，而ZO-1則是用來反映上皮細(xì)胞融合程度的標(biāo)志物，除此以外，角蛋白也可以作為上皮細(xì)胞的特定表達(dá)蛋白用以檢測(cè)細(xì)胞的生長情況。SEM則可以通過掃描上皮細(xì)胞表面或氣道組織表面的超微結(jié)構(gòu)，直接觀察上皮細(xì)胞或組織表面纖毛的生長情況，但SEM樣本的制樣過程繁瑣，且樣本經(jīng)固定脫水后，細(xì)胞及表面的纖毛均已死亡，不能在活體狀態(tài)下反映出纖毛的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。相比之下，高速顯微攝像技術(shù)則可以讓研究人員通過連接高速電荷耦合元件（CCD）的顯微鏡，并通過可視化的視頻分析軟件直接地觀察到纖毛的擺動(dòng)，是判斷細(xì)胞纖毛分化以及檢測(cè)CBF最直接可靠的方法，然而由于哺乳動(dòng)物CBF較快，且不同種屬來源的呼吸道上皮纖毛擺動(dòng)有所區(qū)別，小鼠的擺動(dòng)頻率最高，而人的相對(duì)較慢，但均高達(dá)8～15次/s，因此需要使用專門的儀器設(shè)備以及軟件系統(tǒng)才可以記錄并檢測(cè)其擺動(dòng)頻率。隨著呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式的發(fā)展以及光學(xué)數(shù)碼顯微技術(shù)的進(jìn)步，纖毛擺動(dòng)的記錄及檢測(cè)方法也不斷發(fā)生變化。在記錄纖毛高速擺動(dòng)時(shí)，高速影像系統(tǒng)是記錄纖毛高速擺動(dòng)所必須的，為保證其客觀提交相同，其記錄條件一般在標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)溫度37℃，將細(xì)胞或組織浸沒在磷酸鹽緩沖液中；而影像系統(tǒng)的采集幀數(shù)多為60～100幀/s，這樣可以保證上皮細(xì)胞纖毛的有效擺動(dòng)均被記錄下來[21]。對(duì)于采集的圖像信息，利用Hcimage等圖像分析軟件，詳細(xì)分析纖毛擺動(dòng)區(qū)域的灰度值，由于纖毛的定向節(jié)律擺動(dòng)，引起了區(qū)域內(nèi)灰度值的變化，因此通過分析單位時(shí)間幀數(shù)內(nèi)灰度曲線的周期變化情況，可以準(zhǔn)確地反映出纖毛每秒擺動(dòng)的次數(shù)[22]。

3 小結(jié)與展望

呼吸道上皮的纖毛擺動(dòng)及其調(diào)控和呼吸道黏液運(yùn)輸、臨床給藥以及多種呼吸系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生發(fā)展均具有密不可分的關(guān)系，在體外構(gòu)造簡便快速可靠的培養(yǎng)模式以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的纖毛分化并檢測(cè)其擺動(dòng)頻率在分析氣道上皮細(xì)胞功能上顯得至關(guān)重要。但由于氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)以及檢測(cè)的復(fù)雜性，目前對(duì)這方面的研究相對(duì)較少，在目前主要的兩種培養(yǎng)模式下，操作流程及培養(yǎng)周期均較長，但各自的操作流程及對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞纖毛分化的能力均各具特點(diǎn)，最可靠的檢測(cè)方法主要是通過連接高速CCD的顯微鏡直接記錄纖毛擺動(dòng)情況并間接分析纖毛擺動(dòng)導(dǎo)致的圖像灰度變化從而計(jì)算CBF。但隨著細(xì)胞生物學(xué)以及光學(xué)顯微攝像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，在未來，將會(huì)探索出更加便捷可靠的培養(yǎng)模式，為研究呼吸系統(tǒng)重大疾病、尋找呼吸道上皮纖毛擺動(dòng)參與的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-11-30 本文編輯：趙魯楓）