不同產(chǎn)地山藥中總多糖及尿囊素的含量分析

閆沛沛　楊文華　曹俊嶺　李朝峰　戚姝婭　趙華葉　樊冬鶴　張玉君　張夢捷

100029　北京中醫(yī)藥大學中藥學院[閆沛沛(碩士研究生)、楊文華(碩士研究生)、李朝峰(碩士研究生)、戚姝婭(碩士研究生)、趙華葉(碩士研究生)、樊冬鶴(碩士研究生)、張玉君(碩士研究生)、張夢捷(碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥學部(曹俊嶺)；中國中醫(yī)科學院中藥資源中心(曹俊嶺)

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·論著·

不同產(chǎn)地山藥中總多糖及尿囊素的含量分析

閆沛沛楊文華曹俊嶺李朝峰戚姝婭趙華葉樊冬鶴張玉君張夢捷

100029北京中醫(yī)藥大學中藥學院[閆沛沛(碩士研究生)、楊文華(碩士研究生)、李朝峰(碩士研究生)、戚姝婭(碩士研究生)、趙華葉(碩士研究生)、樊冬鶴(碩士研究生)、張玉君(碩士研究生)、張夢捷(碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥學部(曹俊嶺)；中國中醫(yī)科學院中藥資源中心(曹俊嶺)

【摘要】目的對比河南產(chǎn)地和河北產(chǎn)地山藥的品質(zhì)，尋找優(yōu)良品種。方法總多糖含量采用苯酚硫酸法測定；尿囊素含量采用高效液相色譜法測定，色譜條件：色譜柱：資生堂SPOLAR C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水(2：98)，流速：0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長：224 nm。結(jié)果總多糖含量(%)河南產(chǎn)地山藥中為(14.65±1.43)%，河北產(chǎn)地山藥中為(7.78±2.83)%，二者有顯著性差異(P<0.01)；在尿囊素含量上二者沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論河南產(chǎn)地的山藥中含有較高的總多糖，可能藥用價值更高，品質(zhì)更優(yōu)，是值得關注的優(yōu)良品種。

【關鍵詞】總多糖；尿囊素；河南產(chǎn)地山藥；河北產(chǎn)地山藥

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，具有益氣養(yǎng)陰、養(yǎng)脾肺腎、固精止帶等功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)輯注》[1]記載：“補虛羸，除寒熱邪氣，補中，益

氣力，長肌肉。久服耳目聰明，輕身、不饑，延年?！薄侗静萁?jīng)集注》[2]記載：“補虛勞羸瘦，充五臟，除煩熱，強陰?！爆F(xiàn)代研究表明山藥含有豐富的總多糖、淀粉、氨基酸、尿囊素等化學成分，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、提高免疫力等藥理作用。

目前，山藥的兩大主要產(chǎn)區(qū)為河南、河北，在進行市場調(diào)研時，發(fā)現(xiàn)河南產(chǎn)地的山藥外觀筆挺均勻類圓柱形，直徑2～3 cm，斷面緊致、顆粒感不明顯；而河北產(chǎn)地的山藥外觀扁圓柱形，有的一端分叉成手掌狀，直徑5～7 cm，須根蓬亂，斷面疏松、顆粒感明顯。本研究以河南、河北兩個產(chǎn)地的山藥為研究對象，對二者總多糖和尿囊素的含量進行差異性分析，為山藥的研究提供參考依據(jù)。

1儀器與材料

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀(檢測器：SPDM20A)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，300 W，40 kHz)；CPA2250型分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

D-無水葡萄糖對照品(純度100.0%，批號：110833-200904)和尿囊素對照品(批號：111501-200202)均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水；苯酚、硫酸、乙醇均為分析純。

苯酚的純化方法：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，棄初餾分，收集182℃餾分。精密稱取該餾分2.5 g至50 mL棕色容量瓶中，加純水溶解并定容至刻度，得5%苯酚，用錫箔紙密封避光，放入冰箱中備用。

表1　山藥樣品目錄

鐵棍山藥主要采自道地產(chǎn)區(qū)河南焦作，普通山藥為河南、河北種植的普通品種山藥，采藥時間為2014年11月～12月，經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所馮學鋒研究員鑒定為薯蕷科植物薯蕷的塊莖。見表1。

2方法

2.1山藥總多糖含量的測定方法

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品約5 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取山藥粉末約1.5 g置100 mL三角錐形瓶中，加入50 mL純水，于80℃水浴中回流提取2小時，放至室溫補重，于3000 rmp下離心15分鐘，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，定容，備用。

2.1.3標準曲線分別精密量取對照品溶液各0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL具塞試管中，各加水至1.0 mL，精密加入新配置的5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10分鐘后30℃水浴20分鐘，取出，搖勻。室溫下按照紫外分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標(X)，濃度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，回歸方程為：Y=0.0869X+0.0003，r=0.9994，線性范圍為0.00～0.11 mg/mL。

2.1.4方法學考察(1)精密度試驗：取3號樣品約1.5g，精密稱定，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法連續(xù)測定6次，計算總多糖質(zhì)量分數(shù)，RSD為1.21%，表明該儀器精密度良好。(2)重復性試驗：精密稱取同一樣品6份，每份約1.5 g，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定并計算總多糖質(zhì)量分數(shù)，RSD為0.37%，表明重復性良好。(3)穩(wěn)定性試驗：精密稱取同一供試品溶液，分別于5、10、20、30、40、50、60、80分鐘測定吸光度，計算總多糖質(zhì)量分數(shù)，RSD為0.41%，表明供試品溶液在80分鐘內(nèi)穩(wěn)定。(4)加樣回收率試驗：采用加樣回收法。精密稱取3號樣品(已知含量為13.47%)6份，每份約0.75 g，分別精密加入無水葡萄糖對照品適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定，計算含量和回收率，結(jié)果如表2。

表2　回收率實驗

2.2尿囊素含量的測定方法

2.2.1色譜條件色譜柱：資生堂SPOLAR C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(2∶98)；流速：0.5 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：224 nm，進樣量：10 μL。見圖1。

A.對照品；B.樣品；1.尿囊素

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取尿囊素對照品適量至25 mL容量瓶中，加入20%乙醇溶解，定容至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇25 mL，稱重，超聲45分鐘，放置至室溫，稱重，用20%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液，過微孔濾膜(0.22 μm)即得。

2.2.4標準曲線精密稱取尿囊素對照品約13.65 mg，置25 mL容量瓶中，用20%乙醇定容至刻度，搖勻。依次進行等度稀釋，得0.0023、0.0046、0.0092、0.019、0.037、0.073、0.15、0.21、0.26 mg/mL的對照品溶液，進樣10 μL，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)制作標準曲線，回歸方程為Y=5.81×106X-2.42×103，r=0.9999，線性范圍為0.00057～0.26 mg/mL。

2.2.5方法學考察(1)精密度試驗：取4號樣品粉末約0.5g，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，計算尿囊素質(zhì)量分數(shù)，RSD為0.17%，表明該儀器精密度良好。(2)重復性試驗：精密稱取同一樣品6份，每份約0.50 g，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算尿囊素質(zhì)量分數(shù)，RSD為1.06%，表明重復性良好。(3)穩(wěn)定性試驗：精密稱取同一供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、8、10、12小時進樣，測定并計算尿囊素質(zhì)量分數(shù)，RSD為1.14%，表明該樣品在12小時內(nèi)穩(wěn)定。(4)加樣回收試驗：精密稱取4號樣品(尿囊素含量為1.04%)粉末6份，每份約0.25 g，加入尿囊素對照品適量，測定含量并計算回收率，結(jié)果見表3。

表3　尿囊素回收率實驗

3結(jié)果

3.1總多糖含量測定結(jié)果

精密稱取各個樣品粉末約1.5 g，分別按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定總多糖含量；按照水分測定法[3](第二法)測定山藥樣品的水分含量；計算山藥樣品的干燥品總多糖含量，采用SPSS 17.0對測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表4和表5。從表4可以看出，河南產(chǎn)地山藥中的總多糖含量明顯比河北產(chǎn)地的總多糖含量高，二者有顯著差異(P<0.01)。

表4　總多糖含量測定結(jié)果

表5　總多糖結(jié)果統(tǒng)計分析

注：aP<0.01。

3.2樣品尿囊素含量測定結(jié)果

精密稱取各個山藥樣品約0.5 g，按照“2.2.3”項下制備供試品溶液，“2.2.4”項下測定并計算尿囊素含量；對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果見表6和表7。

表6　尿囊素含量測定結(jié)果

表7　尿囊素結(jié)果統(tǒng)計分析

注：P>0.05

4討論

山藥總多糖可以調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，提高免疫力[4]；有顯著的抗疲勞[5]和降低血糖等作用[6]；還有清除自由基、抗氧化作用，其抗氧化性隨總多糖濃度的增加而增強，呈明顯的劑量依賴性[7-9]；總多糖鐵復合物可以較好地治療缺鐵性貧血[10]；從山藥總多糖中分離得到的RDPS-1在一定濃度時對Lewis肺癌和B16黑色素瘤有顯著的抑制效果[11]。何新蕾等[12]還發(fā)現(xiàn)鐵棍山藥總多糖對CCl4所誘導的小鼠肝損傷有一定的保護作用。尿囊素是山藥的活性成分之一，具有抗刺激、麻醉鎮(zhèn)痛、消炎抑菌等作用，常用于治療手足皸裂、魚鱗病、多種角化皮膚病等[13]。由此可以看出，總多糖可能是山藥產(chǎn)生補益等作用的主要活性成分。

本研究參照文獻[14]，對HPLC色譜條件進行了優(yōu)化，比較了流動相比例(10∶90、 5∶95、 2∶98、1∶99)、柱溫(25℃、30℃、35℃)、流速(1.0、0.8、0.5、0.4、0.2 mL/min)等條件，按照色譜條件：流動相：乙腈-水(2∶98)，流速：0.5 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：224 nm，進樣量：10 μL測定時，基線穩(wěn)定，出峰時間適當，分離效果好，確定此條件為HPLC測定條件。

對河南產(chǎn)地和河北產(chǎn)地的不同批次山藥樣品中總多糖和尿囊素的含量進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)河南產(chǎn)地山藥中的總多糖含量(%)為(14.65±1.43)，河北產(chǎn)地中為(7.78±2.83),P<0.01；河南產(chǎn)地和河北產(chǎn)地的山藥中尿囊素含量沒有顯著性差異。由結(jié)果可知，河南產(chǎn)地的山藥中含有較高的山藥總多糖。多糖類成分具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫力等作用，與山藥的臨床藥理作用相符，提示河南產(chǎn)地的山藥可能具有更高的藥用價值；同時，多糖類成分可以作為評價山藥品質(zhì)的重要指標性成分之一。

懷山藥的優(yōu)良品種鐵棍山藥，是山藥中的“珍品”，而本次研究所選取的山藥即為鐵棍山藥，因此，實驗具有一定的研究意義。

參考文獻

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(本文編輯： 董歷華)

Content analysis of polysaccharide and allantoin ofDioscoreaoppositeThunb. from different habitats

YANPei-pei，YANGWen-hua，CAOJun-ling，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

【Abstract】ObjectiveTo compare the quality of the Dioscorea opposite Thunb. from Henan and Hebei by determining the content of polysaccharide and allantoin. MethodsPhenol-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharide. Allantoin content was determined by high performance liquid chromatography. SPOLAR C18(250mm×4.6mm,5μm) was used. Mobile phase was acetonitrile-water (2：98). The flow rate was 0.5 mL/min. The column temperature was set at 25℃.The detection wavelength was set at 224 nm. ResultsThe polysaccharide content(%) in the Dioscorea opposite Thunb. from Henan was (14.65±1.43), while the Hebei was (7.78±2.83). There was significant statistical difference between the two varieties(P<0.01). There was no significant difference of the allantoin content between the varieties(P>0.05). ConclusionThe Dioscorea opposite Thunb. from Henan contains higher polysaccharide, which might have higher medicinal value and better quality, deserves paying close attention as a good variety.

【Key words】Polysaccharide；Allantoin；Dioscorea opposite Thunb. from Henan；Dioscorea opposite Thunb. from Hebei

(收稿日期：2015-12-19)

Corresponding author：CAO Jun-ling，E-mail：caojunling72@163.com

【中圖分類號】R284

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.010

作者簡介：閆沛沛(1989- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥材山藥等級規(guī)格標準的研究。E-mail：yanpeifighting@163.com通訊作者： 曹俊嶺(1972- )，博士，主任藥師。研究方向：臨床安全合理用藥。E-mail：caojunling72@163.com

基金項目：中央本級重大增減支項目(2060302)；國家自然科學基金(81130070)；江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新項目