高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方尿囊素乳膏中尿囊素的含量

丁志軍，李小蘭，付志媛

江西省皮膚病?？漆t(yī)院，江西 南昌 330001

復(fù)方尿囊素乳膏是江西省皮膚病專科醫(yī)院外用乳膏制劑，主要由尿囊素、維生素E、二甲硅油、羥苯乙酯及基質(zhì)組成。臨床上主要用于皮膚干燥皸裂、皮膚瘙癢、鱗屑性皮膚病，療效顯著。尿囊素能增加皮膚角質(zhì)層細(xì)胞粒合質(zhì)的吸濕能力，并直接作用于角質(zhì)蛋白分子，促進(jìn)其吸收水分，使皮膚光滑柔軟。制劑原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)尿囊素含量測(cè)定采用紫外分光光度法［1-2］，專屬性不強(qiáng)，其測(cè)定操作過(guò)程復(fù)雜、過(guò)濾困難，影響測(cè)定重復(fù)性。為了更好的控制制劑質(zhì)量，保證制劑療效，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定復(fù)方尿囊素乳膏中尿囊素的含量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（美國(guó)），BT-125D Sartorius型電子天平；島津UV-1800型紫外分光光度計(jì)。

1.2 試藥

尿囊素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111501-200202）；磷酸二氫鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20190829）；磷酸氫二鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20190829）；復(fù)方尿囊素乳膏（江西省皮膚病?？漆t(yī)院，批號(hào)：210301、210302、210303），蒸餾水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉0.87 g、磷酸氫二鈉1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為0.4 mL/min；柱溫：20 ℃。理論塔板數(shù)按尿囊素峰計(jì)應(yīng)不低于8 000。主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取尿囊素對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含13.2 μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品約0.45 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加水適量，置于65 ℃水浴中加熱約10 min，振搖使尿囊素溶解，放涼至室溫后，用水稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻2 h 以上，取出，迅速過(guò)濾，濾液放至室溫，備用。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

稱取按復(fù)方尿囊素乳膏處方工藝方法制備的不含尿囊素的陰性樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備。

2.5 專屬性試驗(yàn)

按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的尿囊素峰，而陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.溶劑；B.陰性對(duì)照溶液；C.對(duì)照品溶液；D.樣品溶液

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取尿囊素對(duì)照品16.07 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置25 mL 量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，尿囊素的回歸方程為：Y=2 503.415 6X+4.802 4（r=0.999 95），線性范圍為0.064 28～0.642 80 μg。

2.7 檢出限

取尿囊素對(duì)照品適量，用水溶解并逐級(jí)稀釋后測(cè)定，尿囊素的檢出限為0.117 ng。

2.8 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)得尿囊素平均峰面積值，RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，室溫條件下連續(xù)進(jìn)樣3 d，測(cè)得尿囊素平均峰面積值，結(jié)果顯示尿囊素有降解現(xiàn)象，配制后8 h 內(nèi)RSD 為0.68%（n=5），24 h 內(nèi)RSD 為2.27%，48 h 內(nèi)RSD 為4.33%，72 h 內(nèi)RSD為15.44%，建議對(duì)照品溶液在配制后8 h 內(nèi)使用。

將新配制的對(duì)照品溶液用環(huán)己烷液封于冰箱（5 ℃）中放置保存，室溫條件下連續(xù)15 d 測(cè)定，測(cè)得其RSD 為1.13%，結(jié)果顯示，尿囊素對(duì)照品水溶液在5 ℃至少可穩(wěn)定15 d。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6 份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)得峰面積值，計(jì)算尿囊素含量，RSD 分別為0.19%，表明此法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的樣品（批號(hào)210301）7 份，分別精密加入尿囊素對(duì)照品溶液（精密稱取尿囊素對(duì)照品16.39 mg，置25 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

2.12 樣品含量測(cè)定

取本品3批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，按外標(biāo)法計(jì)算復(fù)方尿囊素乳膏中尿囊素標(biāo)示量的百分含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

參考文獻(xiàn)［3-4］，尿囊素的檢測(cè)波長(zhǎng)有210、217、224 nm，同時(shí)考慮到磷酸鹽緩沖液的截止波長(zhǎng)為200 nm，結(jié)合尿囊素對(duì)照品水溶液紫外分光光度計(jì)在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描結(jié)果，最終選擇210 nm 為尿囊素的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考文獻(xiàn)［5-15］的方法，選擇甲醇-水（5 ∶95）、甲醇-0.1%磷酸溶液（5 ∶95）、0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液、水等作為流動(dòng)相。經(jīng)摸索，結(jié)果以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉0.87 g、磷酸氫二鈉1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）為流動(dòng)相跑出的基線平坦、峰形對(duì)稱，分離效果最好，故選其作為流動(dòng)相。

3.3 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)曾采用普通C18 柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果尿囊素在幾分鐘內(nèi)就出峰，與溶劑峰分不開，為進(jìn)一步延長(zhǎng)尿囊素的出峰時(shí)間，需降低流動(dòng)相中有機(jī)相甲醇的比例，采用純水為流動(dòng)相的SB Aq 色譜柱，能使尿囊素峰分離且基線穩(wěn)定。也曾考察過(guò)氨基柱，但跑出的色譜圖基線不平，影響尿囊素峰積分的準(zhǔn)確性，同時(shí)氨基柱的使用壽命短。因此，采用Agilent ZORBAX SB-Aq 為本試驗(yàn)的色譜柱。

3.4 溶媒的選擇

尿囊素在熱水、氯化鈉試液中溶解，在乙醇中不溶，因此，先后選擇用純化水以及流動(dòng)相為提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果采用純化水、流動(dòng)相作為樣品處理的提取溶劑均能將尿囊素提取完全。考慮到鹽對(duì)色譜柱的影響，最終選擇水為提取溶劑。另外，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)考察，結(jié)果水浴溫度為65 ℃、提取時(shí)間10 min 時(shí)含量最高，故選擇65 ℃水浴加熱提取10 min。

綜上所述，利用HPLC 法檢測(cè)復(fù)方尿囊素乳膏中尿囊素含量快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，該方法能有效控制復(fù)方尿囊素乳膏的含量。