鹽生肉蓯蓉中2種水溶性成分的薄層色譜鑒別

麥吾菊丹?阿力甫　楊建華　曹苑　譙明　胡君萍

摘要 [目的]建立鹽生肉蓯蓉藥材中2種水溶性成分尿囊素和半乳糖醇的薄層色譜分析方法。[方法]采用硅膠G薄層板，分別對(duì)乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸、氯仿∶異丙醇∶乙酸等6種不同的展開劑及25%對(duì)二氨基苯甲醛、10%硫酸乙醇、3%酸性高錳酸鉀溶液、10%香草醛濃硫酸4種不同的顯色劑進(jìn)行考察，確定鹽生肉蓯蓉提取物中尿囊素、半乳糖醇的最佳薄層分析條件，并對(duì)不同產(chǎn)地鹽生肉蓯蓉中的2種成分進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]尿囊素的展開劑為乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（8∶1∶3），顯色劑為25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液；半乳糖醇的展開劑為乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1），顯色劑為3%酸性高錳酸鉀溶液。不同產(chǎn)地鹽生肉蓯蓉中均含有尿囊素和半乳糖醇。[結(jié)論]該方法快速簡便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可快速鑒別肉蓯蓉藥材，是全面控制和評(píng)價(jià)鹽生肉蓯蓉藥材質(zhì)量的重要補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞 鹽生肉蓯蓉；尿囊素；半乳糖醇；薄層層析

中圖分類號(hào) S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-055-03

肉蓯蓉屬（Cistanche Hoffmg. et Link）為列當(dāng)科（Orobanchaceae）多年生草本，是寄生在沙漠樹木梭梭根部的寄生植物，為我國西北干旱地區(qū)特有的沙生瀕危藥材，素有“沙漠人參”之美譽(yù)[1]，具有增強(qiáng)免疫功能、補(bǔ)腎壯陽、抗氧化、抗衰老、抗輻射等功效[2]。肉蓯蓉作為一味傳統(tǒng)名貴中藥材，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)肉蓯蓉苯乙醇苷類成分進(jìn)行了廣泛的化學(xué)成分、藥理活性的研究，對(duì)肉蓯蓉中其他水溶性成分少見報(bào)道，降低了肉蓯蓉藥材的利用率[3]。研究顯示，肉蓯蓉中還含有多糖、生物堿、糖醇等多種化學(xué)成分，其中水溶性成分D-甘露醇具有免疫調(diào)節(jié)作用[4]；半乳糖醇是其潤腸通便作用的藥效成分[5]；尿囊素是肉蓯蓉藥材中水溶性很高的酰脲類化合物，具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長、清理壞死組織、刺激新的健康組織生長等生理活性[6]。堵年生等采用酵母雙雜交技術(shù)考察了尿囊素對(duì)高密度脂蛋白HDL中主要成分載脂蛋白apo-AI與其受體B族I型清道夫受體BSR-BI之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)尿囊素可增強(qiáng)apo-AI與SR-BI間的相互作用，提示其具有一定的降脂活性[7]。可見，建立肉蓯蓉藥材中水溶性成分定性定量方法對(duì)控制藥材質(zhì)量和闡明藥效活性非常重要。

上述化學(xué)成分由于缺乏生色基團(tuán)且極性較大，提取純化和定量分析具有一定困難。薄層色譜法具有操作簡便、設(shè)備簡單、展開速率快、混合物易分離、分辨力高的優(yōu)點(diǎn)，是中藥材質(zhì)量控制不可或缺的分離技術(shù)。王松芝等考察了肉蓯蓉中甜菜堿的TLC鑒別方法[8]，筆者在此擬建立鹽生肉蓯蓉中半乳糖醇和尿囊素的TLC分析方法，以期進(jìn)一步完善肉蓯蓉藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。鹽生肉蓯蓉藥材4批，于2013年5月分別采自新疆沙漠地區(qū)（20130501）、阿爾泰山（20130502）、準(zhǔn)葛爾盆地（20130503）及鹽堿地（20130504），經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)楊建華教授鑒定為列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物鹽生肉蓯蓉Cistanche salsa。

1.1.2 主要儀器。AB135-S電子分析天平（美國Mettler Toledo公司）；Linomat 5卡瑪半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；D-101大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20140702）。

1.1.3 主要試劑。25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液，即稱取對(duì)二甲氨基苯甲醛7.5 g，加入95%乙醇10 ml、濃鹽酸20 ml，溶解后置于棕色瓶中；尿囊素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)HJ0618HB13）；半乳糖醇對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備。

1.2.1.1 尿囊素對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品尿囊素0.040 g置于10 ml量瓶中，加蒸餾水溶解、定容，搖勻，得對(duì)照品貯備溶液4.0 mg/ml。

1.2.1.2 半乳糖醇對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品半乳糖醇0.040 g置于10 ml量瓶中，加蒸餾水溶解、定容，搖勻，得對(duì)照品貯備溶液4.0 mg/ml。

1.2.2 供試品溶液的制備。分別稱取不同產(chǎn)地（20130501～20130504）鹽生肉蓯蓉藥材干燥粉末100 g，加入70%乙醇100 ml加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，濃縮得乙醇浸膏，以適量水混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取后，獲得水提取物12 g，分別取水提取物0.3 g用50%甲醇溶解得供試品溶液Ⅰ～Ⅳ。取正丁醇萃取物10 g經(jīng)D-101大孔吸附樹脂柱層析，用水洗脫，將水洗脫部分減壓濃縮得提取物8 g，取0.3 g用50%甲醇溶解得供試品溶液Ⅴ。

1.2.3 尿囊素的薄層鑒別。

1.2.3.1 展開劑的選擇。吸取尿囊素對(duì)照品、供試液Ⅰ、供試液Ⅴ各6 μl ，分別點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，并分別以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（8∶1∶3）、乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸（8∶1∶3）、乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（8∶1∶1）展開，取出，晾干，噴25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液，置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示（圖1），乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（8∶1∶3）為展開劑時(shí)斑點(diǎn)清晰，無拖尾現(xiàn)象，淡藍(lán)色背景顯黃色斑點(diǎn)，Rf值為0.72。

1.2.3.2 顯色劑的選擇。分別吸取尿囊素對(duì)照品、供試液Ⅰ、供試液Ⅴ各6 μl，點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（8∶1∶3）為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，分別噴25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液、10%硫酸乙醇溶液、10%香草醛濃硫酸溶液，置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰進(jìn)行比較，結(jié)果顯示（圖2），25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液對(duì)尿囊素顯色效果最好。

1.2.4 半乳糖醇的薄層鑒別。

1.2.4.1 展開劑的選擇。分別吸取半乳糖醇對(duì)照品、供試液Ⅰ、供試液Ⅴ各6 μl，點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，分別以乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1）、氯仿∶正丁醇∶甲醇∶甲酸（6∶1∶6∶3）、氯仿∶異丙醇∶乙酸（3∶1∶1）為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干后噴3%酸性高錳酸鉀溶液，置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果顯示（圖3），乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1）為展開劑時(shí)斑點(diǎn)清晰，無拖尾現(xiàn)象，黃色背景顯白色斑點(diǎn)，Rf值為0.65。

1.2.4.2 顯色劑的選擇。分別吸取半乳糖醇對(duì)照品、供試液Ⅰ、供試液Ⅴ各6 μl，點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1）為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，分別噴3%酸性高錳酸鉀溶液、10%硫酸乙醇溶液、10%香草醛濃硫酸溶液置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果顯示（圖4），3%酸性高錳酸鉀溶液為顯色劑效果最佳。

注：A為乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1）；B為氯仿∶正丁醇∶甲醇∶甲酸（6∶1∶6∶3）；C為氯仿∶異丙醇∶乙酸（3∶1∶1）。1為半乳糖醇對(duì)照品；2為供試液Ⅰ；3為供試液Ⅴ。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地肉蓯蓉藥材中尿囊素的鑒別 分別吸取尿囊素對(duì)照品、供試液Ⅰ～Ⅳ各6 μl，點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸（8∶1∶3）為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴25%對(duì)二氨基苯甲醛溶液，置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果顯示（圖5），4批鹽生肉蓯蓉藥材中均含有尿囊素，由斑點(diǎn)大小和顏色深淺可知不同產(chǎn)地采集的藥材尿囊素含量存在差異。

2.2 不同產(chǎn)地肉蓯蓉藥材中半乳糖醇的鑒別 分別吸取半乳糖醇對(duì)照品、供試液Ⅰ～Ⅳ各6 μl，點(diǎn)在同一硅膠G 薄層板上，乙酸乙酯∶異丙醇∶水∶甲酸（3∶4∶2∶1）為展開系統(tǒng)展開，取出，晾干后噴3%酸性高錳酸鉀溶液，置110 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果顯示（圖6），4批鹽生肉蓯蓉藥材中均含有半乳糖醇，由斑點(diǎn)大小可知不同產(chǎn)地采集的藥材半乳糖醇含量存在差異。

3 結(jié)論與討論

中藥往往含多類、多種成分，其治療是一個(gè)整體協(xié)同的過程，中藥質(zhì)量不能僅從一個(gè)或幾個(gè)物質(zhì)成分進(jìn)行說明， 需要在整體性上進(jìn)行闡述，多指標(biāo)評(píng)價(jià)中藥藥材質(zhì)量是建立我國現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心[9]。目前以苯乙醇苷類成分評(píng)價(jià)肉蓯蓉藥材的壯陽、抗衰老、提高免疫功能、增強(qiáng)記憶力等療效，而肉蓯蓉降血脂、通便等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與尿囊素、甜菜堿、半乳糖醇等水溶性物質(zhì)有關(guān)，因此上述成分的定性定量分析方法建立對(duì)完善肉蓯蓉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系意義重大。

由于半乳糖醇沒有紫外吸收，多采用HPLC-ELSD（蒸發(fā)光散射檢測器）檢測[10]，尿囊素紫外光譜為末端吸收（224 nm），可采用HPLC-UV法檢測[11]。這些方法對(duì)樣品前處理要求高、測定時(shí)間長、經(jīng)濟(jì)成本高。薄層色譜法操作方便、設(shè)備簡單、展開速率快，不僅可以在短時(shí)間內(nèi)得到較好的結(jié)果，且可以同時(shí)測定大批樣品[12]。

文獻(xiàn)報(bào)道半乳糖醇的薄層鑒別方法以丁醇∶丙酮∶水或異丙醇∶丙酮∶0.1 mol/L乳酸[13]為展開系統(tǒng)，以0.1%高碘酸鈉、聯(lián)苯胺溶液[14]為顯色劑。尿囊素以氯仿-乙酸乙酯-丙酮-甲酸為展開系統(tǒng)，以20%對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液為顯

色劑[15]。該試驗(yàn)優(yōu)化了半乳糖醇和尿囊素的展開劑和顯色劑，并對(duì)不同產(chǎn)地鹽生肉蓯蓉藥材中的2種成分進(jìn)行了薄層鑒別，方法簡單快速、操作方便，所選顯色方法針對(duì)性強(qiáng)，斑點(diǎn)清晰。

尿囊素是鑒別鹽生肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的主要化學(xué)成分[16]，該方法可以短時(shí)間快速鑒別不同品種的肉蓯蓉藥材，為肉蓯蓉藥材不同品種鑒別提供技術(shù)參數(shù)，因此該方法是全面控制和評(píng)價(jià)肉蓯蓉藥材質(zhì)量的重要補(bǔ)充。

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