表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)用于生鮮山藥中尿囊素含量的快速檢測(cè)

摘要 尿囊素作為山藥的功能性成分，在醫(yī)學(xué)及化妝品領(lǐng)域有重要的作用。本研究基于實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)，以生鮮鐵棍山藥為研究對(duì)象，分析了尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品粉末的拉曼光譜以及生鮮山藥的尿囊素提取液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，確定了生鮮山藥中尿囊素的表面增強(qiáng)拉曼特征峰為644、1027 和1398 cm?1。探究了生鮮山藥中尿囊素和銀溶膠吸附時(shí)間以及山藥厚度對(duì)拉曼特征峰強(qiáng)度的影響，建立了直接獲取生鮮山藥中尿囊素表面增強(qiáng)拉曼特征信息的方法?；诒痉椒ú杉?2 個(gè)生鮮山藥的表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立了644、1027 和1398 cm?1 處尿囊素拉曼特征峰一元線(xiàn)性回歸（Unary linear regression， ULR）預(yù)測(cè)模型、多元線(xiàn)性回歸（Multivariable linear regression， MLR）預(yù)測(cè)模型以及全波段光譜偏最小二乘回歸（Partialleast squares regression， PLSR）預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明，多元線(xiàn)性回歸模型效果最佳，其驗(yàn)證集決定系數(shù)（R2V）為0.93，均方根誤差（RMSEV）為0.35 mg/g。但是，尿囊素特征峰易受溶液極性和基底變化的影響，其特征峰會(huì)發(fā)生一定偏移，影響檢測(cè)精度，而利用全波段拉曼光譜建立PLSR 定量預(yù)測(cè)模型可提升模型的魯棒性。基于隨機(jī)蛙跳（Random frog， RF）算法篩選特征變量建立了尿囊素的RF-PLSR 定量預(yù)測(cè)模型， R2V 提升為0.96，RMSEV 降低至0.26 mg/g。采用未參與建模的10 個(gè)生鮮山藥樣本對(duì)此模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，最大殘差絕對(duì)值為0.74 mg/g。研究結(jié)果表明，本方法可以實(shí)現(xiàn)生鮮山藥中尿囊素含量的快速定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 山藥；尿囊素；表面增強(qiáng)拉曼光譜；預(yù)測(cè)模型

山藥是薯蕷科植物的干燥塊莖，具有藥食兩用的功能，富含尿囊素、多糖和蛋白質(zhì)等多種活性成分。尿囊素作為山藥塊莖中的重要活性物質(zhì)，具有抗氧化和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1]。尿囊素可用于治療糖尿病、骨髓炎、肝硬化及癌癥，作為山藥功能性成分，其含量在山藥品質(zhì)評(píng)價(jià)中占據(jù)重要地位[2-4]。因此，建立一種山藥中尿囊素含量的快速定量檢測(cè)方法非常重要。

相比于蛋白質(zhì)和淀粉等山藥的主要成分，尿囊素含量相對(duì)較少。目前，山藥中尿囊素含量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[5-6]和毛細(xì)管電泳法[7]等。研究人員針對(duì)HPLC 法進(jìn)行了精度和流程優(yōu)化[8-9]，在檢測(cè)范圍內(nèi)，含量與峰值面積的線(xiàn)性關(guān)系的相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99 以上。此類(lèi)傳統(tǒng)檢測(cè)方法精度高，但耗費(fèi)大量的人力和物力，不適合推廣應(yīng)用于山藥加工產(chǎn)業(yè)。目前，很多研究者基于近紅外光譜開(kāi)展了山藥及其產(chǎn)品的產(chǎn)地鑒別及總糖、多糖等含量檢測(cè)，精度約為90%[10-14]。近紅外光譜主要針對(duì)山藥中蛋白質(zhì)和總糖等主要成分進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于尿囊素等含量較低的成分檢測(cè)效果并不理想。因此，亟需建立一種尿囊素的快速檢測(cè)方法。表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）因具有簡(jiǎn)單、快速和高靈敏等特點(diǎn)，在食品質(zhì)量安全方面尤其是抗生素等微量成分的檢測(cè)方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)和潛力。Liao 等[15]采用傅里葉變換（FT）-拉曼光譜對(duì)32 種常用山藥蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析，還有研究者基于拉曼光譜[16-18]對(duì)山藥產(chǎn)地進(jìn)行了鑒別，但尚未見(jiàn)對(duì)生鮮山藥中尿囊素快速檢測(cè)的報(bào)道。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室自行研制的表面增強(qiáng)拉曼光譜采集系統(tǒng)，以生鮮鐵棍山藥為研究對(duì)象，分析其中尿囊素的SERS 光譜特征峰，建立了生鮮山藥中尿囊素特征信息的快速獲取方法，以及生鮮山藥中尿囊素含量定量預(yù)測(cè)模型和檢測(cè)方法，為山藥中尿囊素的直接快速定量檢測(cè)提供了新思路和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

表面增強(qiáng)拉曼光譜采集系統(tǒng)[19]如圖1 所示，包括10785MM0350MS 激光器（美國(guó)Innovative PhotonicSolutions 公司）、RPB 拉曼探頭（美國(guó)InPhotonics 公司）、Raman Explorer 785 光譜儀（美國(guó)HeadwallPhotonics 公司）和DU920PBR-DD 高性能CCD 相機(jī)（英國(guó)Andor Technology 公司）；TDZ5-WS 低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

檸檬酸鈉（分析純，北京化工廠）；AgNO3（≥99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司）。微孔濾膜（0.22 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

山藥樣本為鐵棍山藥，購(gòu)于北京某超市，洗凈擦干后置于室溫中，以消除溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表面增強(qiáng)劑銀溶膠的制備

采用文獻(xiàn)[20]的方法，以檸檬酸鈉還原AgNO3 法制備銀溶膠。將400 mL 1.0 mmol/L 的AgNO3 溶液加熱至沸騰，在1000 r/min 的轉(zhuǎn)速下攪拌，并滴加10 mL 1%檸檬酸鈉溶液，控制全部檸檬酸鈉溶液的滴加時(shí)間為3 min，以確保銀溶膠制備程序的一致性。在持續(xù)加熱下反應(yīng)1 h 后，將溶液自然冷卻至室溫，以3000 r/min 離心30 min，棄上清液，收集濃縮20 倍的銀溶膠置于玻璃瓶中，在4 ℃下避光保存，備用。

1.2.2 生鮮山藥中尿囊素的提取及標(biāo)準(zhǔn)理化值的測(cè)定

分別截取用于采集拉曼光譜的山藥樣本兩側(cè)塊莖（15 mm，如圖2 所示），采用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后，研磨成均勻的漿糊。稱(chēng)取0.8 g 樣品于50 mL 離心管中，加入20%乙醇40 mL，渦旋1 min，再超聲提取1 h，每隔10 min 更換一次水，防止水溫過(guò)高。在100 r/min 下振蕩提取8 h 后，再渦旋1 min， 5000 r/min 離心10 min，收集上清液，用20%乙醇稀釋5 倍，作為尿囊素提取液。

以生鮮山藥中提取的尿囊素提取液為研究對(duì)象，基于QB/T 5095—2017[21]方法對(duì)生鮮山藥中的尿囊素含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品及其水溶液的SERS 光譜檢測(cè)

基于實(shí)驗(yàn)室自行研制的表面增強(qiáng)拉曼光譜采集系統(tǒng)進(jìn)行拉曼光譜采集，拉曼光譜系統(tǒng)激光波長(zhǎng)為785 nm、激光功率為150 mW、積分時(shí)間為1 s，利用MATLAB R2016b 附帶的PLS Toolbox 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲光譜曲線(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑降噪（Savitsky-Golay， Filter width 5， Polynomial order 1）和特征峰值提取，并利用Origin 2022 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3 拉曼光譜預(yù)處理方法

為消除暗電流造成的激光斑點(diǎn)大小、激光功率波動(dòng)及光程變化等物理因素對(duì)拉曼光譜產(chǎn)生隨機(jī)噪聲干擾，所有光譜均經(jīng)過(guò)SG（Savitzky-golay）平滑和多元散射校正（Multiplicative scatter correction， MSC）預(yù)處理。利用非對(duì)稱(chēng)最小二乘（Asymmetric least squares， ALS）[22]進(jìn)行基線(xiàn)擬合和背景消除，進(jìn)一步表征目標(biāo)物的拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿囊素拉曼特征峰的確定

利用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜采集系統(tǒng)采集尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜，經(jīng)ALS扣除背景后的尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜如圖3A 所示。尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品具有豐富的拉曼特征峰信息，特別是在320、658、877、1019、1389和1769 cm–1 處出現(xiàn)了較強(qiáng)的拉曼特征峰，其中， 320 cm–1 處的特征峰為N—H的搖擺振動(dòng)峰[23]，877 cm–1 處的特征峰是N—C 的拉伸振動(dòng)峰， 1769 cm–1 處的特征峰是C=O的拉伸振動(dòng)峰， 1019 cm–1 處的特征峰是由N—H鍵面拉伸振動(dòng)產(chǎn)生， 658和1389 cm–1 處的特征峰均為N—C鍵的拉伸振動(dòng)峰。

采集的不同濃度的尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的SERS 光譜以及生鮮山藥尿囊素提取液的SERS 光譜如圖3B 所示。3 個(gè)不同濃度梯度的尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的SERS 光譜均在664、1027 和1398 cm–1 處出現(xiàn)了顯著的拉曼特征峰。隨著尿囊素濃度增加，這3 處的拉曼特征強(qiáng)度逐漸增大，但是與尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品在658、1019 和1389 cm–1 處的特征峰相比，表面增強(qiáng)后特征峰發(fā)生了偏移。這是因?yàn)槟蚰宜胤肿右揽快o電吸附至銀納米粒子的電負(fù)性表面，拉曼信號(hào)增強(qiáng)；同時(shí)，尿囊素分子吸附至銀納米粒子表面后，電子密度分配發(fā)生了扭曲，改變了分子鍵的極化率，導(dǎo)致光譜中的波段發(fā)生偏移[24]。生鮮山藥尿囊素提取液的SERS 光譜同樣在664、1027 和1398 cm–1 處出現(xiàn)了較強(qiáng)的拉曼特征峰。綜上，確認(rèn)上述3 處特征峰為生鮮山藥中尿囊素的SERS 特征峰。

2.2 生鮮山藥中尿囊素特征信息直接獲取方法

切取厚度為5 mm 的山藥樣品置于鋁箔紙上，利用自行搭建的拉曼光譜采集系統(tǒng)采集山藥斷面的拉曼光譜。如圖4 中譜線(xiàn)c 所示，直接采集的山藥斷面拉曼光譜未出現(xiàn)任何拉曼信號(hào)，但滴加1 μL 銀溶膠表面增強(qiáng)劑后，采集的山藥SERS 光譜在664、1027 和1398 cm–1 處均出現(xiàn)了明顯的尿囊素特征峰，與尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的SERS 特征峰完全相符，如圖4 中譜線(xiàn)a 和譜線(xiàn)b 所示。這說(shuō)明基于SERS 光譜可以直接快速獲取山藥中尿囊素的特征信息，為建立山藥中尿囊素的快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

采集SERS 光譜時(shí)，滴加表面增強(qiáng)劑后，尿囊素可依靠靜電作用吸附至電負(fù)性的銀納米粒子的表面，使拉曼信號(hào)增強(qiáng)。表面增強(qiáng)劑與樣品的作用時(shí)間直接影響尿囊素的特征信號(hào)。為確定尿囊素與銀溶膠的最佳吸附時(shí)間，對(duì)同一個(gè)山藥樣本滴加銀溶膠后，每隔5 s 采集一次光譜，連續(xù)采集5 次。如圖5 所示，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，拉曼特征峰強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)吸附時(shí)間為10 s 時(shí)，拉曼特征峰強(qiáng)度達(dá)到最高；當(dāng)吸附時(shí)間為15 s 時(shí)，拉曼特征峰強(qiáng)度變小。這是因?yàn)殂y溶膠在空氣中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致吸附能力逐漸下降[19]。因此，本研究中選擇尿囊素與銀溶膠的最佳吸附時(shí)間為10 s。

采集山藥SERS 光譜時(shí)，滴加的表面增強(qiáng)劑銀溶膠會(huì)逐漸滲透至山藥內(nèi)部。為探討山藥厚度與SERS 信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系，將同一個(gè)山藥樣品分別切取厚度為10、8、6、4、2 和1 mm 的薄片置于鋁箔紙上，分別滴加1 μL 銀溶膠后，采集山藥的SERS 光譜。如圖6 所示，隨著山藥厚度增加，拉曼信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。這可能是因?yàn)樯剿帢颖据^厚時(shí)滴加的銀溶膠直接滲透至山藥內(nèi)部，采集部位的尿囊素?zé)o法充分地吸附至銀納米粒子表面；但是當(dāng)生鮮山藥樣本較薄時(shí)，山藥下方的鋁箔紙使山藥中尿囊素與銀納米粒子充分接觸，達(dá)到較好的增強(qiáng)效果。綜合考慮，本研究選擇光譜采集用的山藥樣本厚度為2 mm。

2.3 生鮮山藥中尿囊素的SERS 特征信息穩(wěn)定性分析

切取10 個(gè)厚度為6 mm 的生鮮山藥樣本，分別將每個(gè)樣本均勻切分為厚度為2 mm 的3 段，每個(gè)樣本分別采集3 個(gè)位點(diǎn)的SERS 光譜（圖7），并分析每個(gè)樣本在664、1027 和1398 cm–1 處尿囊素特征峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如圖8 所示，在664 cm–1 處， 10 個(gè)樣本的尿囊素特征峰強(qiáng)度的RSD 為1.66%～7.20%，平均值為4.56%；1027 cm– 1 處尿囊素特征峰強(qiáng)度的RSD 為2.78%～7.56%，平均值為5.42%；1398 cm–1 處尿囊素特征峰強(qiáng)度的RSD 為1.35%～7.17%，平均值為4.18%。以上結(jié)果說(shuō)明，直接獲取生鮮山藥中尿囊素SERS 特征信息的方法穩(wěn)定性良好。

2.4 生鮮山藥中尿囊素含量的預(yù)測(cè)模型的建立

基于實(shí)驗(yàn)室自行搭建的SERS 光譜采集系統(tǒng)采集生鮮山藥中尿囊素的拉曼光譜。共切取32 個(gè)厚度為2 mm 的山藥樣品，將樣本置于鋁箔紙上，滴加1 μL 銀溶膠，吸附10 s 后，分別采集四周與中心共5 個(gè)位點(diǎn)的拉曼光譜，取平均值作為每個(gè)樣本的原始SERS 光譜。

生鮮山藥的原始SERS 光譜如圖9 所示。生鮮山藥中存在大量的淀粉和多糖，除了位于664、1027 和1398 cm–1 處的尿囊素特征峰外，還有許多代表其它物質(zhì)的拉曼特征峰，如500 cm–1 附近淀粉以及多糖的特征峰[25]。

基于KS（Kennard-stone）算法，以3∶1 的比例劃分校正集與驗(yàn)證集，分別建立了664、1027 和1398 cm–1 處ULR、MLR 和全光譜的PLSR 尿囊素預(yù)測(cè)模型，結(jié)果如表1 所示。664、1027 和1398 cm–1處尿囊素的拉曼特征峰值均與濃度具有較高的相關(guān)性，基于尿囊素這3 處特征峰強(qiáng)度建立的MLR 預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果最佳，其驗(yàn)證集決定系數(shù)（R2V）為0.93，均方根誤差（RMSEV）為0.35 mg/g。但是，尿囊素特征峰受溶液極性和基底的影響較大，其拉曼特征峰容易偏移，因此，利用特征峰建立模型難以保證模型的魯棒性，而利用全波段光譜的PLSR 定量預(yù)測(cè)模型可以避免這種情況，但包含許多其它無(wú)關(guān)變量。利用全光譜信息的PLSR 定量預(yù)測(cè)模型的R2V 為0.91， RMSEV 為0.38 mg/g。

為去除山藥全波段拉曼特征光譜中與尿囊素分子結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的其它變量并進(jìn)一步簡(jiǎn)化提升全波段光譜預(yù)測(cè)模型效果，利用隨機(jī)蛙跳（Random frog， RF）算法篩選全光譜信息中尿囊素的特征變量，根據(jù)RMSEV 最小原則，最終確定尿囊素特征變量數(shù)為12 個(gè)，特征變量選擇過(guò)程如圖10 所示。

如圖11 所示，基于RF 算法篩選的特征變量主要集中在664、1027 和1398 cm–1 處尿囊素特征峰附近。此外， 478 和770 cm–1 處一些強(qiáng)度較弱的信號(hào)變化也得到識(shí)別，可能是因?yàn)橐恍┬Ｕ蟮墓庾V基線(xiàn)的變化能夠間接反映分析物的濃度變化。

基于RF 算法篩選的特征變量建立的生鮮山藥中尿囊素的PLSR 定量預(yù)測(cè)模型結(jié)果如圖12 所示。經(jīng)變量篩選算法消除大量無(wú)關(guān)信息后，所建立的模型的R2V 提高到0.96， RMSEV 降低至0.26 mg/g。

2.5 生鮮山藥中尿囊素含量快速檢測(cè)系統(tǒng)外部驗(yàn)證

選取10 個(gè)未參與建模的生鮮山藥樣品對(duì)RF-PLSR 定量預(yù)測(cè)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。生鮮山藥中尿囊素含量的模型預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)理化值的對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2，樣品殘差絕對(duì)值范圍為0.05～0.74 mg/g（圖13）。上述結(jié)果表明，利用生鮮山藥的SERS 光譜結(jié)合RF-PLSR 可以實(shí)現(xiàn)生鮮山藥中尿囊素含量的快速檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究以生鮮鐵棍山藥為研究對(duì)象，利用實(shí)驗(yàn)室自行研制的表面增強(qiáng)拉曼光譜采集系統(tǒng)建立了生鮮山藥中尿囊素特征信息的直接快速獲取方法，以及生鮮山藥中尿囊素含量定量預(yù)測(cè)模型，實(shí)現(xiàn)了生鮮山藥中尿囊素含量的快速定量檢測(cè)。首先，基于實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)分析了尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品粉末的拉曼光譜以及不同濃度尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液和生鮮山藥中尿囊素提取液的SERS 光譜，確定了生鮮山藥中尿囊素的SERS 光譜特征峰。其次，探討了生鮮山藥中尿囊素和銀溶膠吸附時(shí)間以及山藥厚度等對(duì)拉曼光譜特征峰強(qiáng)度的影響，確定了生鮮山藥中直接獲取尿囊素SERS 光譜特征信息的方法，尿囊素拉曼光譜在664、1027 和1398 cm–1 處的特征峰強(qiáng)度的平均RSD 分別為4.56%、5.42%和4.18%。基于本研究采集的32 個(gè)生鮮山藥的SERS 光譜，建立了尿囊素的RF-PLSR 定量預(yù)測(cè)模型，其R2V 為0.96，RMSEV 為0.26 mg/g。采用未參與建模的10 個(gè)生鮮山藥樣本對(duì)此模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，最大殘差絕對(duì)值為0.74 mg/g。本方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，為農(nóng)產(chǎn)品中尿囊素的直接快速定量檢測(cè)提供了新的思路和技術(shù)參考。

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