基于立足點(diǎn)介導(dǎo)的熵驅(qū)動(dòng)雙足DNA 步行器及樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一步式循環(huán)腫瘤DNA 微流控傳感研究

摘要 血液中低豐度的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是一類關(guān)鍵癌癥標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)ctDNA 的精準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)于疾病的早期診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估均具有重要意義。本研究設(shè)計(jì)了一種基于微流控芯片的熵驅(qū)動(dòng)雙足DNA 步行器與樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略，用于檢測(cè)血液中的ctDNA。當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，立足點(diǎn)A與靶標(biāo)相互作用，借助燃料鏈F 觸發(fā)雙向鏈置換反應(yīng)，從而釋放靶標(biāo)及8-17 DNAzyme 活性中心。其中，釋放的靶標(biāo)進(jìn)入新一輪熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)；同時(shí)， Pb2+激活的8-17 DNAzyme 活性中心將作用于微珠表面的切割位點(diǎn)，暴露出微珠表面的捕獲探針，進(jìn)而誘導(dǎo)樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使熒光信號(hào)富集于微珠表面。以乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 為靶標(biāo)模型，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，此傳感器的線性范圍為50～10000 fmol/L，檢出限（LOD， 3σ）為0.94 fmol/L，回歸方程為y=31.6539 lgCT+474.0801（CT 為突變基因PIK3CAE545K 濃度， fmol/L）。將此方法應(yīng)用于人血清中突變基因PIK3CAE545K 含量的檢測(cè)，加標(biāo)回收率在98.8%～106.5%之間。本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)，并具有高通量和一步式操作的特點(diǎn)，在復(fù)雜樣品的快速分析中具有良好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 DNA 步行器；熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)；微流控芯片；8-17 DNAzyme；樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

癌癥每年導(dǎo)致超過820 萬人死亡[1]，其中，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因[2]，對(duì)女性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。早期診斷和治療是降低癌癥死亡率的關(guān)鍵因素，而高靈敏性、高特異性且便捷的檢測(cè)方法是其中的關(guān)鍵[3-6]。循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA， ctDNA）是由腫瘤細(xì)胞釋放到外周血中的DNA片段[7-9]，可作為癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物，例如乳腺癌突變基因PIK3CAE545K（Mutation1633 Ggt;A）是攜帶腫瘤特異性基因突變的ctDNA 片段[10-11]。近年來，基因測(cè)序[12]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）[13]被用于檢測(cè)ctDNA，但其操作流程復(fù)雜，并且儀器設(shè)備昂貴[14-15]。因此，開發(fā)高靈敏度、高特異性且簡(jiǎn)單、快速的ctDNA 檢測(cè)方法對(duì)癌癥的精準(zhǔn)診斷和有效治療至關(guān)重要。

等溫信號(hào)放大技術(shù)相比于熱循環(huán)擴(kuò)增具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單且無需專用設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，如3D DNA 步行器[16]、鏈置換反應(yīng)（Strand replacement reaction， SDR）[17]、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization strand reaction， HCR）[18]和支鏈雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[19]等。立足點(diǎn)（Toehold）介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)[20]是由Toehold 結(jié)構(gòu)域開始的鏈置換反應(yīng)，基于Watson-Crick 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則和熵驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的雙重條件使其具有高特異性。然而，鏈置換反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度有限，因此，研究者提出結(jié)合多種等溫信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，以提高檢測(cè)靈敏度。3D DNA 步行器[16，21]是一種受化學(xué)能（如鏈置換和酶切反應(yīng)）驅(qū)動(dòng)、能沿著特定軌跡移動(dòng)的納米機(jī)器，可通過提高反應(yīng)物的局部濃度，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高靈敏度。Yuan 等[22]提出了一種鏈置換反應(yīng)結(jié)合蛋白酶驅(qū)動(dòng)的3D DNA 步行器，用于檢測(cè)病毒DNA，雖然該方法可有效提高檢測(cè)靈敏度，但其依賴于蛋白酶切割，易受復(fù)雜實(shí)驗(yàn)條件（如緩沖液和溫度）的影響。8-17 DNAzyme 是一種具有催化活性的DNA 序列[23-25]，克服了蛋白酶的一些局限性。盡管如此，多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的操作仍然繁瑣，限制了其實(shí)際應(yīng)用。

微流控芯片技術(shù)以其便攜性和高度集成的特性，為血液中低豐度ctDNA 的檢測(cè)提供了新思路[26]。該技術(shù)同時(shí)具有高通量平行分析能力和高效物質(zhì)傳輸效率，可提高檢測(cè)靈敏度[27-29]。Peng 等[30]設(shè)計(jì)了一種基于功能化微珠的多通道微芯片，僅需30 min 即可同時(shí)檢測(cè)人類、兔、雞和鼠的免疫球蛋白G，展現(xiàn)出微流控芯片快速檢測(cè)、高靈敏度以及操作簡(jiǎn)便的顯著優(yōu)勢(shì)。

本研究設(shè)計(jì)了一種三通道平行的微流控微珠陣列芯片，并構(gòu)建了一步式立足點(diǎn)介導(dǎo)的熵驅(qū)動(dòng)雙足3D DNA 步行器，用于ctDNA 的高靈敏度檢測(cè)。以靶標(biāo)和8-17 DNAzyme 為3D DNA 步行器的雙足，通過多種DNA 納米技術(shù)實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大；以乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 為靶標(biāo)，驗(yàn)證了一步式微流控微珠陣列芯片生物傳感器的性能。本方法具有高靈敏度、高特異性和高效、便捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于乳腺癌突變基因PIK3CAE545K 的高靈敏的檢測(cè)，為癌癥的早期篩查提供參考和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IX73 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；ChemiDoc XRS+電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；KVB-30D紫外曝光機(jī)（中國(guó)臺(tái)灣金電子股份有限公司）。

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA?2Na）、30%聚丙烯酰胺（29∶1）、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清白蛋白（BSA）、6 × Loading 緩沖溶液和25 bp DNA Marker（上海生物工程（上海）股份有限公司）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）和PbCl2（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，上海麥克林生化科技股份有限公司）；15 μm 聚苯乙烯微珠（蘇州知益微珠科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化劑（Dow Corning 公司）；人血清（上海金馬生物技術(shù)有限公司）。

HPLC 純化的寡核苷酸序列購(gòu)于上海生物工程（上海）股份有限公司，序列見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 序列設(shè)計(jì)及探針預(yù)處理

DNA 探針凍干粉用TE 緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl， 0.1 mmol/L EDTA， pH 8.0）溶解，濃度為100 μmol/L，于?20 ℃儲(chǔ)存。使用HEPES 緩沖溶液（25 mmol/L HEPES， 50 mmol/L NaCl， 20 mmol/LMgCl2， pH 7.4）將Biotin-C1、C2 和C3 稀釋至10 μmol/L， SH 底物探針稀釋至5 μmol/L， H1-TMR、H2 和H3 探針稀釋至5 μmol/L，燃料鏈（F）稀釋至200 nmol/L，均于?20 ℃儲(chǔ)存。

復(fù)合鏈S 的構(gòu)建：將3 μL Bio-C1（10 μmol/L）、3 μL C3（10 μmol/L）、6 μL C2（10 μmol/L）和8 μLHEPES 緩沖溶液混合，總體積為20 μL，于95 ℃孵育5 min 后，以0.1 ℃/s 的速度緩慢冷卻至室溫，形成復(fù)合鏈S（Bio-C1/C2/C3）。

發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成：將含SH（5 μmol/L）、H1-TMR（5 μmol/L）、H2（5 μmol/L）和H3（5 μmol/L）探針的HEPES 緩沖溶液在95 ℃下孵育5 min，并以0.1 ℃/s 的速度緩慢冷卻至室溫，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

1.2.2 微流控芯片的陽模板制備

按照微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，采用菲林打印制備光掩膜，將其覆蓋在PCB 板上并紫外曝光110 s，隨后采用100 mL 顯影液進(jìn)行顯像6 min。用水沖洗后，避光放入200 mL 刻蝕液（FeCl3·6H2O-水， 1∶2， m/V）中，靜置10～45 min，刻蝕10～30 μm 的深度，最后采用丙酮清除光刻膠，制得芯片陽模板。

1.2.3 微流控微珠陣列芯片的裝配及微通道處理

將PDMS 與固化劑按質(zhì)量比10∶1 混勻，靜置20 min，平鋪于陽模板上（約1 mm 厚），在70 ℃烘箱中固化40 min后從陽模板上剝離下來，進(jìn)行沖壓打孔，支撐進(jìn)樣口/出樣口。將基片a （Slip a）與基片b （Slip b）的通道面貼合，組裝成微流控芯片。用5 μL 1% 的BSA 對(duì)通道內(nèi)壁進(jìn)行改性，減少非特異性吸附。最后將功能化的微珠流入微室中，得到微流控微珠陣列芯片。

1.2.4 微珠的表面功能化

取100 μL 聚苯乙烯微珠，用100 μL Binding 緩沖溶液（20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， 1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， 0.0005% Triton X-100， pH=7.4）洗滌3 次（3500 r/min， 5 min），棄去上清液，然后以摩爾比為1∶20 的比例加入復(fù)合鏈S 與SH 底物發(fā)夾混合（4 μL S （1.5 μmol/L）、24 μL SH （5 μmol/L）和22 μLHEPES 緩沖溶液，總體積為50 μL），室溫下反應(yīng)1 h。隨后用HEPES 緩沖溶液洗滌3 次，并在HEPES 緩沖溶液中于4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.5 一步式微流控芯片檢測(cè)突變基因PIK3CAE545K

將功能化微珠稀釋10 倍后注入微室中。將4 μL F（200 nmol/L）、2 μL Pb2+ （2 mmol/L）、18 μL H1-TMR （25 nmol/L）、6 μL H2 （25 nmol/L）、6 μL H3 （25 nmol/L）和4 μL HEPES 緩沖溶液混勻，總體積為40 μL。取4 μL 上述溶液和2 μL Target 混勻后滴加于微流控微珠陣列芯片的進(jìn)樣口，在液壓驅(qū)動(dòng)下，溶液流通至微室中，在30 ℃下恒溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)完成后，用5 μL HEPES 緩沖溶液洗滌通道。最后，采用熒光倒置顯微鏡在549 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

微流控芯片由兩層PDMS 基片組成，可平行檢測(cè)3 份樣品，如圖1A 所示。其中，上層基片a（Slip a）設(shè)有進(jìn)樣口和出樣口，微室尺寸為120 μm×120 μm×10 μm；底層基片b（Slip b）僅設(shè)有進(jìn)樣通道和微室，無出樣通道，尺寸為100 μm×100 μm×15 μm。直徑為15 μm 的微珠在重力與毛細(xì)作用的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入微室中，微珠利用深度差被固定于微室中，以提高反應(yīng)溶液與微珠表面的接觸效率。

如圖1B 所示，功能化微珠由復(fù)合鏈S 和底物發(fā)夾SH 構(gòu)成。復(fù)合鏈S 由Bio-C1/C2/C3 組成，其中，C3 鏈5′端的Toehold A 用于特異性識(shí)別靶標(biāo)；Bio-C1 鏈構(gòu)成的DNA 步行器含有封閉的8-17 DNAzyme活性中心。功能化微珠注入微室后，形成微流控微珠陣列芯片。當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)， Toehold A 與靶標(biāo)結(jié)合使C2 鏈解離，暴露出Toehold B。Toehold B 與燃料鏈F 相結(jié)合，觸發(fā)雙向鏈置換反應(yīng)，釋放靶標(biāo)且顯露出Bio-C1 鏈中的8-17 DNAzyme 催化活性中心。靶標(biāo)作為DNA 步行器的“一條腿”在微珠之間行走，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)。Pb2+激活8-17 DNAzyeme， Bio-C1 作為DNA 步行器的“另一條腿”沿著三維軌道催化裂解SH，使捕獲探針顯露于微珠表面，啟動(dòng)H1-TMR、H2 和H3 進(jìn)行樹枝狀的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Dendritichybridization chain reaction， D-HCR）。值得注意的是，發(fā)夾H1 的3′端標(biāo)記有四甲基羅丹明分子，捕獲探針（a）與H1 的5′端結(jié)合，暴露發(fā)夾序列（c、b*），并進(jìn)一步與H2 發(fā)夾的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；被觸發(fā)的H2 發(fā)夾（b*、a*）與新的H1 發(fā)夾進(jìn)行雜交，而H2 的5′端序列（d、e）與H3 的3′端序列（d*、e*）相互作用，完成D-HCR 過程，隨著D-HCR 的發(fā)生，微珠表面的熒光信號(hào)增強(qiáng)。

2.2 可行性分析

為驗(yàn)證微流控微珠陣列芯片構(gòu)建的有效性，對(duì)其進(jìn)行流通性測(cè)試。圖2A為顯微鏡下的Slip a和Slip b的結(jié)構(gòu)，以及兩層基片貼合后的完整芯片。圖2B 為功能化微珠在重力和毛細(xì)作用下引入微室中的過程，證實(shí)了微珠通過深度差可固定于微室內(nèi)。采用黑色墨水驗(yàn)證了3 個(gè)通道的流通性（圖2C）。圖2D 為構(gòu)建的微流控微珠陣列檢測(cè)平臺(tái)實(shí)物圖。

通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分別對(duì)鏈置換反應(yīng)與樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的可行性進(jìn)行分析，各組分終濃度均為1 μmol/L。如圖3A 泳道7 所示，進(jìn)行鏈置換反應(yīng)后， S 亮帶減弱， Fuel/C3 亮帶明顯變亮，表明鏈置換反應(yīng)已完成。樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)電泳表征如圖3B 所示，泳道4、5 和6 的結(jié)果顯示各發(fā)夾處于亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，無引發(fā)序列時(shí)，無法自組裝成納米聚合物；泳道7 為捕獲探針P/H1/H2 在30 ℃下反應(yīng)3 h 發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，泳道8 為P/H1/H2/H3 在相同條件下進(jìn)行D-HCR，泳道8 亮帶分子量顯著大于泳道7，證明樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的納米聚合物分子更大。

通過去除關(guān)鍵影響因素的方式進(jìn)行可行性分析，設(shè)計(jì)了4 組實(shí)驗(yàn)，分別為不加PbCl2、不加燃料鏈F、不加靶標(biāo)探針以及完整實(shí)驗(yàn)組，未加變量均以等體積緩沖溶液替代。如圖3C 所示，缺少Pb2+時(shí)，無法激活8-17 DNAzyme 進(jìn)行底物鏈切割；缺少F 鏈或靶標(biāo)時(shí)，無法進(jìn)行熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)，背景信號(hào)較低；完整體系的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，證明此體系可有效檢測(cè)突變基因PIK3CAE545K。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了金屬離子種類與濃度、D-HCR 組裝中3 個(gè)發(fā)夾比例及傳感器反應(yīng)時(shí)間對(duì)8-17 DNAzyme 切割效率的影響，所有實(shí)驗(yàn)均在1 pmol/L 突變基因PIK3CAE545K 條件下進(jìn)行。

2.3.1 激活8-17 DNAzyme 的金屬離子種類及濃度的優(yōu)化

二價(jià)金屬離子（如Co2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+和Pb2+）可促進(jìn)8-17 DNAzyme 催化磷酸二酯鍵的斷裂[31]，因此，考察了二價(jià)金屬離子的種類對(duì)8-17 DNAzyme 催化活性的影響。如圖4A 所示，相同濃度的二價(jià)金屬離子（100 μmol/L）存在時(shí)，對(duì)1 pmol/L 靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明， Pb2+存在時(shí)8-17 DNAzyme 具有較高的催化活性。如圖4B 所示，在靶標(biāo)存在情況下，隨著Pb2+濃度從5 μmol/L 增高至100 μmol/L， 8-17DNAzyme 的切割效率加快，熒光信號(hào)在25 μmol/L 時(shí)趨于穩(wěn)定。因此，選擇Pb2+最佳濃度為25 μmol/L。

2.3.2 樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)夾比例的優(yōu)化

H1-TMR、H2 和H3 發(fā)夾比例對(duì)樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)具有顯著影響。如圖4C 所示，隨著H1-TMR 濃度增加，熒光信號(hào)增強(qiáng)。H1-TMR、H2 和H3 發(fā)夾比例為1∶1∶1 時(shí)，含有四甲基羅丹明的H1 濃度較低，難以迅速結(jié)合至微珠表面；當(dāng)H1-TMR、H2 和H3 發(fā)夾比例為3∶1∶1 時(shí)，信號(hào)趨于穩(wěn)定。因此，選擇H1-TMR、H2 和H3 發(fā)夾的最佳比例為3∶1∶1。

2.3.3 一步式檢測(cè)體系反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

一步式微流控微珠陣列生物傳感器的反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光信號(hào)有較大影響。如圖4D 所示，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)， 30～120 min 時(shí)熒光信號(hào)不斷增加，反應(yīng)至180 min 時(shí)，信號(hào)趨于穩(wěn)定。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為180 min。

2.4 檢測(cè)性能分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用制備的芯片對(duì)不同濃度的突變基因PIK3CAE545K 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著靶標(biāo)濃度增加，熒光信號(hào)增強(qiáng)，濃度達(dá)到50 pmol/L 時(shí)，信號(hào)趨于穩(wěn)定（圖5A），在50～10000 fmol/L 濃度范圍內(nèi)，熒光信號(hào)與靶標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系（圖5B），線性回歸方程為y=31.65 lgCT+474.08（R2=0.9890），檢出限（LOD， 3σ）為0.94 fmol/L。在相同條件下，未采用微流控芯片（芯片外）對(duì)不同濃度的突變基因PIK3CAE545K 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，熒光信號(hào)隨著PIK3CAE545K 濃度增加而增強(qiáng)， PIK3CAE545K 濃度為1 nmol/L 時(shí)，熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定（圖5C），在10～5000 pmol/L 濃度范圍內(nèi)，熒光信號(hào)與靶標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系（圖5D），線性方程為y=19.78 lgCT+221.92（R2=0.9879），檢出限（LOD， 3σ）為1.03 pmol/L。微流控芯片的高效傳質(zhì)作用使檢測(cè)靶標(biāo)的熒光信號(hào)顯著高于芯片外信號(hào)，檢測(cè)靈敏度提升了約3 個(gè)數(shù)量級(jí)，這歸因于不同的反應(yīng)裝載方式。在芯片外檢測(cè)靶標(biāo)采用EP 管進(jìn)行反應(yīng)，靜置3 h 后，微珠沉降至管底，導(dǎo)致反應(yīng)不充分。采用微流控芯片檢測(cè)靶標(biāo)時(shí)，溶液在重力和毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)下持續(xù)流入微室，提高了分子碰撞效率，增強(qiáng)了熒光信號(hào)。綜上，相較于文獻(xiàn)中報(bào)道的ctDNA 檢測(cè)方法（表2），本研究通過級(jí)聯(lián)信號(hào)放大技術(shù)和微流控芯片的高效傳質(zhì)特性，獲得了更高的靈敏度。

2.5 特異性分析

為考察一步式微流控微珠陣列芯片檢測(cè)方法對(duì)突變基因PIK3CAE545K 檢測(cè)的特異性，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法分別對(duì)1 pmol/L 濃度的單堿基錯(cuò)配（M1）、雙堿基錯(cuò)配（M2）和三堿基錯(cuò)配（M3）目標(biāo)基因序列，以及正?；騊IK3CAE545K（WT）與突變基因PIK3CAE545K 靶標(biāo)（Target）進(jìn)行檢測(cè)。如圖6 所示，Target 的熒光信號(hào)明顯高于相同濃度的其它堿基錯(cuò)配目標(biāo)基因序列，通過t 檢驗(yàn)計(jì)算p 值，結(jié)果顯示存在顯著性差異，表明本方法對(duì)突變基因PIK3CAE545K 序列具有良好的特異性。

2.6 實(shí)際樣品分析

為考察本方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的檢測(cè)性能，對(duì)模擬實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。將突變基因PIK3CAE545K 加入至已稀釋20 倍的健康人血清中，加標(biāo)濃度分別為0.5、1 和3 pmol/L。結(jié)果如表3 所示，加標(biāo)回收率為98.8%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.1%，表明本方法可用于實(shí)際復(fù)雜樣品中突變基因PIK3CAE545K 的檢測(cè)。

3 結(jié)論

構(gòu)建了一種基于立足點(diǎn)介導(dǎo)的熵驅(qū)動(dòng)雙足DNA 步行器與樹枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的信號(hào)放大策略，并結(jié)合微流控芯片傳感平臺(tái)，檢測(cè)了血液中的突變基因PIK3CAE545K。本方法采用微流控芯片實(shí)現(xiàn)一步法檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度顯著高于其它生物傳感器，檢出限低至0.94 fmol/L，并具備單堿基識(shí)別能力，展現(xiàn)出極高的特異性。本方法能夠在3 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)血液中PIK3CAE545K 的快速檢測(cè)，為癌癥的早期診斷提供了新策略。

References

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