乙腈沉淀-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定2 種尿苯代謝物

摘要 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時快速測定人體尿液中反-反式黏糠酸（Trans，trans-muconic acid， t，t-MA）和苯巰基尿酸（S-Phenylmercapturic acid， S-PMA）2 種苯代謝物含量的方法。尿液樣品經(jīng)酸化處理后，再經(jīng)乙腈沉淀去除蛋白，收集上清液，經(jīng)過氮吹濃縮、溶劑復(fù)溶后進(jìn)行檢測分析。采用酸性甲酸銨溶液和甲醇溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫， BEH C18 色譜柱分離，在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。以96 孔樣品收集板為前處理容器，可以對大批量樣本進(jìn)行快速分析。t，t-MA 和S-PMA 的線性檢測范圍分別為20～2000 μg/L 和0.5～20.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)均為0.9998，檢出限分別為1.2 和0.06 μg/L；在實(shí)際尿液中的加標(biāo)回收率分別為90.6%～103.4%和87.3%～101.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.5%～3.5%和1.8%～4.2%。采用本方法檢測41 份苯接觸崗位職工的尿樣， t，t-MA 和S-PMA 的檢出率分別為95%和78%。與固相萃取法相比，本方法具有操作簡便、快速高效、靈敏度好和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量尿樣中t，t-MA 和S-PMA 的快速測定。

關(guān)鍵詞 乙腈沉淀法；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；尿液；反-反式黏糠酸；苯巰基尿酸

苯作為重要的化工原料，是常用的化學(xué)合成中間體和有機(jī)溶劑，被廣泛應(yīng)用于塑料、樹脂、染料、醫(yī)藥、涂料和石油化工等生產(chǎn)中[1-4]。長期接觸苯可引起白細(xì)胞減少及骨髓抑制，嚴(yán)重時能導(dǎo)致再生障礙性貧血以及白血病[5-6]。1982 年，苯被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[7]。長期接觸苯也會增加其它疾病的患病風(fēng)險，嚴(yán)重危害人體健康[8]。

通過優(yōu)化設(shè)計流程及采取預(yù)防措施，工作場所空氣中苯的含量逐漸減少[9]，因此，空氣中低濃度苯的檢測具有重要意義，但空氣中苯的監(jiān)測數(shù)據(jù)不能客觀地反映苯接觸人員的個人暴露實(shí)際情況，而敏感的生物標(biāo)志物能夠真實(shí)地反映接觸人員的職業(yè)接觸水平，更適合作為苯暴露個體的職業(yè)健康風(fēng)險的評估指標(biāo)[10]。苯進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟代謝生成反-反式黏糠酸（Trans， trans-muconic acid， t，t-MA）以及苯巰基尿酸（S-Phenylmercapturic acid， S-PMA），經(jīng)尿液排出體外。研究表明， t，t-MA 和S-PMA 是苯在人體中特異性強(qiáng)且靈敏度高的代謝產(chǎn)物，與低水平苯暴露具有良好的相關(guān)性，是理想的苯暴露生物標(biāo)志物[11-14]。

尿液中t，t-MA 和S-PMA 的檢測方法包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附分析法等[15-17]。氣相色譜法需要衍生化，樣品制備過程較繁瑣；液相色譜法[18]和酶聯(lián)免疫吸附分析法[17]的檢出限較高，靈敏度有限，不適用于低濃度苯代謝物的生物監(jiān)測；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可提供準(zhǔn)確的分子量和結(jié)構(gòu)信息，方法的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確度均顯著提高，具有較好的應(yīng)用前景。近年來，熒光探針法被用于檢測尿液中t，t-MA 含量[19-20]，雖然檢測過程較迅速，但熒光探針制備耗時較長，并且不能同時測定S-PMA。尿液樣品的基質(zhì)復(fù)雜，需要經(jīng)除雜和富集后才能進(jìn)行檢測，通常采用液液萃取或固相萃取對尿樣進(jìn)行前處理[21]。傳統(tǒng)的液液萃取或固相萃取前處理存在較大的缺點(diǎn)，如萃取步驟繁瑣、有毒試劑的用量大、成本較高、不能很好地兼顧便利性和經(jīng)濟(jì)性。磁性固相萃取法[22-23]具有優(yōu)良的選擇性和良好的可重復(fù)使用性，但磁性材料制備過程復(fù)雜且耗時長。分散液液微萃取法和分散固相微萃取法有機(jī)試劑消耗少、預(yù)富集系數(shù)高，是廣泛使用的方法，但分散固相微萃取法需要制備固體吸附劑，耗時長且昂貴；分散液液微萃取法簡單快速，但常需使用有毒溶劑[24]。

乙腈是沉淀生物基質(zhì)中蛋白和鹽類最有效的溶劑[25]。基于此，本研究采用乙腈沉淀蛋白法對樣品進(jìn)行凈化，同時使用96 孔樣品收集板代替離心管作為前處理容器，無需制備吸附劑，也無需采用固相萃取柱及大量有毒試劑，極大地優(yōu)化了前處理操作，加快了樣品處理速度，降低了檢測成本。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），使用同位素內(nèi)標(biāo)降低基質(zhì)效應(yīng)，同時測定人體尿液中的t，t-MA 和S-PMA 的含量。本研究前處理過程簡單快速、試劑耗材用量少、準(zhǔn)確度高和靈敏度高，為苯職業(yè)接觸生物監(jiān)測提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class PLUS 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；QTRAP 5500+三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；BEH C18 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm，美國Waters 公司）；Avanti J-15R 高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）；EVA-96D 全自動氮吹儀（廣州牛頓光學(xué)研究院有限公司）；MixMate 混勻儀（德國Eppendorf 公司）；MSA225S-CE 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；IQ7000 純水儀（美國Millipore 公司）；HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國Waters 公司）。

t，t-MA 標(biāo)準(zhǔn)品（阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司）；S-PMA 標(biāo)準(zhǔn)品、反-反式黏糠酸-d4 （t，t-MA-d4）標(biāo)準(zhǔn)品和（S）-苯巰基尿酸-d5 （S-PMA-d5）標(biāo)準(zhǔn)品（加拿大TRC 公司）。4 種標(biāo)準(zhǔn)品的詳細(xì)信息見表1。

甲醇（HPLC 級，德國Merck 公司）；甲酸銨（HPLC 級，美國Fluka 公司）；乙腈（HPLC 級，美國Sigma-Aldrich 公司）；甲酸（HPLC 級，美國ACS 公司）；HCl（UP 級，晶瑞電子材料股份有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

尿樣為常熟市第一人民醫(yī)院和太倉市中醫(yī)醫(yī)院采集的涉苯企業(yè)的苯暴露職工班后尿液樣本，用于江蘇省重點(diǎn)職業(yè)病監(jiān)測（職業(yè)病危害因素為苯），受試者知情同意。本研究將52 份樣本編號為1～52，其中，樣品12～52 用于實(shí)際樣品測定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg t，t-MA 和S-PMA 標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃儲存，備用。

分別準(zhǔn)確移取10 mL t，t-MA 和100 μL S-PMA 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液定容，配制成t，t-MA 和S-PMA 濃度分別為10 和0.1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃儲存，備用。

分別準(zhǔn)確稱取1.0 mg t，t-MA-d4 和S-PMA-d5 同位素內(nèi)標(biāo)物，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲備溶液，于4 ℃儲存，備用。

分別準(zhǔn)確移取5 mL t，t-MA-d4 和50 μL S-PMA-d5 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL 容量瓶中，用10%甲醇溶液定容，配制成t，t-MA-d4 和S-PMA-d5 濃度分別為10 和0.1 μg/mL 的混合內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃儲存，備用。

1.2.2 樣品前處理

將–20 ℃冷凍的尿液取出，于4 ℃下解凍8 h 后，放置至室溫。充分混勻尿樣后，準(zhǔn)確吸取500 μL 尿液于2 mL 96 孔樣品收集板中，加入10 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液，混勻；加入40 μL 6 mol/L HCl，振蕩混勻，靜置水解10 min；加入1 mL 乙腈，混勻，超聲振蕩提取10 min，離心10 min（10000 r/min）。將上清液置于氮?dú)庀碌退俅蹈桑驓堅(jiān)屑尤?00 μL 10%甲醇溶液，振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，待測。

1.2.3 分析條件

色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動相A為水（含2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸），流動相B 為甲醇；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～2.5 min， 90% A；2.5～5.0 min， 90%～5% A；5.0～7.0 min， 5% A；7.0～7.1 min， 5%～90% A；7.1～8.0 min， 90% A。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓：–4.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；霧化氣壓力：397 kPa；輔助加熱氣壓力：397 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸化條件的選擇

尿液中存在S-PMA 的前體（pre-SPMA），在酸性條件下可水解生成S-PMA[26]。為了測定S-PMA 的總量，需要加入強(qiáng)酸水解：用HCl 將尿液調(diào)至pH 0.5～1.0，尿液中的pre-SPMA 可完全轉(zhuǎn)化為S-PMA[27]。本研究比較了不同HCl 用量對不同尿樣中S-PMA 總量測定結(jié)果的影響。取500 μL 尿樣加入10 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入0、10、20、30、40、50 和60 μL 6 mol/L 的HCl 水解10 min，經(jīng)前處理后進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示，對于不同的尿樣，當(dāng)HCl 用量為40 μL 時， S-PMA 測定值均最大，表明pre-SPMA已最大程度地水解為S-PMA。

2.2 乙腈用量的選擇

考察了沉淀過程中，樣品與乙腈的體積比對加標(biāo)回收率的影響。取500 μL 加標(biāo)尿樣，分別加入1000、1250、1500、1750 和2000 μL 乙腈進(jìn)行沉淀，乙腈與樣品的體積比分別為2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1 和4∶1，經(jīng)前處理后，進(jìn)行檢測，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果如圖2 所示。乙腈與樣品的體積比對加標(biāo)回收率的影響不顯著，為節(jié)約試劑和減少污染，最終選擇乙腈與樣品的體積比為2∶1。

2.3 乙腈沉淀法與固相萃取法定量結(jié)果比較

對比了乙腈沉淀法與固相萃取法的定量分析結(jié)果。固相萃取操作參照文獻(xiàn)[28]，依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化HLB 固相萃取柱。將酸化后的樣品轉(zhuǎn)移至HLB 柱中，樣品過柱后，用2 mL 水淋洗并吹干，用2 mL 甲醇洗脫樣品。洗脫液經(jīng)過氮吹、復(fù)溶、過濾后再進(jìn)行UPLC-MS/MS 測定。如圖3 所示，對于不同的樣品，經(jīng)乙腈沉淀或固相萃取凈化后， 2 種苯代謝物的測試結(jié)果相近，表明以乙腈沉淀法代替固相萃取法可極大地簡化操作流程，降低成本。

2.4 流動相的選擇

分別考察了乙腈和甲醇作為流動相對待測物分離效果的影響。如圖4 所示，以乙腈為流動相時，由于乙腈的洗脫能力強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的t，t-MA 和S-PMA 分別于1.34 和4.29 min 出峰。但是，實(shí)際尿樣基質(zhì)復(fù)雜， t，t-MA 峰與雜質(zhì)峰不能完全分離，影響后續(xù)的積分定量分析。以甲醇為流動相，標(biāo)準(zhǔn)溶液中t，t-MA 和S-PMA 分別于2.44 和4.95 min 出峰。對于實(shí)際尿樣， t，t-MA 峰與雜質(zhì)峰可完全分離（圖5），雜質(zhì)不會產(chǎn)生干擾。因此，本研究選擇甲醇作為流動相。

此外，考察了水相添加劑甲酸銨的濃度（2、5 和10 mmol/L）對信號強(qiáng)度的影響。如圖6 所示，采用2 mmol/L 甲酸銨作為添加劑可得到更好的峰形和更強(qiáng)的信號。因此，本研究選擇2 mmol/L 甲酸銨溶液作為流動相的水相。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

由于t，t-MA 和S-PMA 均為羧酸，易電離產(chǎn)生羧酸根負(fù)離子，因此選擇在ESI– 模式下分析樣品。配制合適濃度的4 種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在Q1 MS 全掃描模式下，采用針泵連續(xù)進(jìn)樣，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，確定母離子信息。在MS2 掃描模式下，進(jìn)行子離子掃描，選擇最優(yōu)的2 個特征子離子作為定性離子和定量離子。在MRM 掃描模式下，優(yōu)化相應(yīng)的碰撞能量和去簇電壓等條件，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.6 方法的分析性能

2.6.1 線性范圍、檢出限和定量限

分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，用10%甲醇溶液為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列， t，t-MA 濃度范圍為20～2000 μg/L， S-PMA 濃度范圍為0.5～20.0 μg/L， t，t-MA-d4 濃度均為200 μg/L， S-PMA-d5 濃度均為2 μg/L。在1.2.3 節(jié)的分析條件下進(jìn)行測定，以待測物離子峰面積和同位素內(nèi)標(biāo)物離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度和內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。t，t-MA 和S-PMA 在各自濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表3。

考慮到實(shí)際樣品前處理過程中不可避免地會產(chǎn)生損失，儀器的3 倍信噪比和10 倍信噪比不能真實(shí)反映實(shí)際樣品檢測時的檢出限和定量限，本研究采用《職業(yè)人群生物監(jiān)測方法總則》（GBZ/T 295—2017）[29]中關(guān)于方法檢出限和方法定量下限相關(guān)要求進(jìn)行計算：按照標(biāo)準(zhǔn)方法分析用于預(yù)估方法定量下限的樣品（平行測定次數(shù)不少于7次），以樣品相應(yīng)信號的3倍/10倍標(biāo)準(zhǔn)差S、低劑量的待測物濃度C 及其響應(yīng)值b計算所得的濃度為方法檢出限（MDL）/方法定量下限（MQL），計算公式分別為：

MDL =k （3SC/ b）"（1）

MQL = k （10SC/b） （2）

其中， k 為樣品預(yù)處理體積轉(zhuǎn)換倍數(shù)。計算結(jié)果見表3。

2.6.2 回收率和精密度

取3 份不同濃度的尿樣，分別加入高、中、低3 個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行測定，每個水平在相同條件下進(jìn)行7 次平行預(yù)處理和測定，計算加標(biāo)回收率和日內(nèi)精密度（Intra-RSD）；連續(xù)3 d 重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測定結(jié)果計算日間精密度（Inter-RSD），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4 和表5。不同濃度樣品中t，t-MA 和S-PMA 的回收率分別為90.6%～103.4%和87.3%～101.7%，表明本方法準(zhǔn)確度高；日內(nèi)精密度分別為1.5%～2.2%和1.8%～2.5%，日間精密度分別為1.9%～3.5%和2.1%～4.2%，表明本方法的精密度良好，可用于尿液中苯的兩種代謝物t，t-MA 和S-PMA 的同時測定。

2.6.3 穩(wěn)定性

將尿樣置于–20 ℃條件下保存，分別在第0、10、20、30 和60 天對樣品進(jìn)行測定，濃度在85%～115%范圍內(nèi)變化認(rèn)為樣品穩(wěn)定。樣品11 中t，t-MA 和S-PM的初始（第0 天）測定值分別為570.1和5.83 μg/L，第60天的測定值分別555.2和5.74 μg/L，為初始測定值的97%和98%，表明樣品在–20 ℃條件下穩(wěn)定性良好，至少可以保存60 d。

2.6.4 方法性能比較

將本方法與近年來報道的測定尿液中t，t-MA 和S-PMA 的分析方法進(jìn)行對比，結(jié)果見表6。本方法采用乙腈沉淀蛋白對尿樣凈化，同時采用96 孔樣品收集板作為反應(yīng)容器，與其它方法相比，具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)。采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，可有效降低樣品前處理的差異和基質(zhì)效應(yīng)，方法靈敏度高、精密度好、回收率高，可以快速準(zhǔn)確地對大批量尿液中的苯代謝物進(jìn)行同時測定。

2.7 實(shí)際樣品分析

采用本方法對某涉苯企業(yè)的41 份苯暴露職工班后尿樣進(jìn)行檢測。結(jié)果表明， t，t-MA 和S-PMA 的檢出率分別為95%和78%，兩者陽性樣品檢出濃度平均值分別為68.0 和1.4 μg/L，最高檢出濃度分別為416.0 和7.2 μg/L。

3 結(jié)論

建立了一種基于UPLC-MS/MS 同時測定人尿液中2 種苯代謝物的分析方法，前處理采用乙腈沉淀法代替固相萃取法凈化樣品，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)約了試劑耗材，采用96 孔樣品收集板代替離心管作為反應(yīng)容器，極大地提高了樣品的處理效率。本方法簡便快捷、效率高，并且具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度，適合大批量職業(yè)暴露人員尿液中苯代謝物的檢測，為職業(yè)衛(wèi)生風(fēng)險監(jiān)測提供了高效、便捷和準(zhǔn)確的技術(shù)支持。

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2023年江蘇省預(yù)防醫(yī)學(xué)及血地寄防科研課題項(xiàng)目（No. Ym2023076）和蘇州市第四批重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（No. SZXK202117）資助。