超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物殘留

摘 要 建立了超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜快速簡單地同時測定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物（賽庚啶、可樂定及28種β.受體激動劑類）殘留的方法。對液相色譜分離條件、MS/MS檢測參數(shù)及樣品前處理方式進行了優(yōu)化。試樣經(jīng)5000 r/min離心5 min后直接經(jīng)MCX柱凈化，分別用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，5%氨化甲醇進行洗脫，N2吹干后以流動相進行復(fù)溶，UPLC.MS/MS進行測定。結(jié)果表明，30種藥物可在5.0 min內(nèi)有效分離； 各藥物在0.1～10 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.992； 方法的檢出限為0.1 μg/L，定量限為0.3 μg/L。在3個濃度水平下的平均回收率為67.6%～103.2%，日內(nèi)、日間相對標準偏差分別為2.8%～16.8%和2.6%～15.8%。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜法； 痕量殘留； 豬尿液； 瘦肉精

1 引 言

“瘦肉精”（Lean meat agents）最早是鹽酸克倫特羅的俗稱，現(xiàn)在泛指一類可以促進動物生長，提高瘦肉率的藥物[1]，主要包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林等β.受體激動劑，以及近年來監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的賽庚啶、可樂定等具有促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率的化合物[2]。由于上述藥物在動物性食品中的極易殘留，會對食用者產(chǎn)生系列毒副作用，因此，包括我國在內(nèi)的許多國家和國際組織已經(jīng)制定了極其嚴格的規(guī)定。到目前為止，我國已明確禁止在食品動物養(yǎng)殖過程中使用克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林、多巴胺、班布特羅、齊帕特羅、馬布特羅、西馬特羅、溴布特羅、福莫特羅/阿福特羅、特布他林、賽庚啶、可樂定共15種具有促進動物生長、提高瘦肉率的藥物[1]。

近年來，我國加大了對明令禁止的上述15種“瘦肉精”非法使用的打擊力度，“瘦肉精”藥物在畜禽養(yǎng)殖中的非法使用得到了有效遏制，然而具有促進動物生長、提高瘦肉率功效、而未被列入國家禁用藥物名單的β.受體激動劑同系物或衍生物（如克羅潘特、羥甲基克倫特羅、克倫丙羅、西布特羅、妥布特羅、馬噴特羅、噴布特羅、卡布特羅、丁酚胺、利托君、克倫己羅、克倫塞羅、異克倫潘特、溴氯特羅、苯氧丙酚胺等）極易被不法分子利用，作為新型“瘦肉精”替代物，用于生豬養(yǎng)殖過程中，達到非法牟利的目的，進而威脅廣大消費者的健康安全。

尿液常被選擇作為藥物代謝、殘留消除實驗的重要靶組織，而且，與其它組織樣品相比，尿液在樣品采集過程中可有效避免對動物造成損傷，因此，動物尿液通常作為大批量樣品監(jiān)測的測試對象[3]。近年來，研究者針對動物尿液中β.受體激動劑藥物殘留建立了包括液相色譜[4]、氣相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜[5]、液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜[3，6～11]、ELISA[12]、膠體金試紙法[13]、免疫傳感器[14]、液相芯片法[15]等一系列快速檢測及定量確證檢測方法。而賽庚啶、可樂定作為新型“瘦肉精”藥物，分別屬于H1受體拮抗藥和α2.受體激動劑[14，15]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與β.受體激動劑藥物有較大的差異（各藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），理化特性、色譜行為也有較大差別，因而同時檢測賽庚啶、可樂定與β.受體激動劑的方法鮮有報道[16]。

本研究建立了超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜快速、簡單地同時測定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物（賽庚啶、可樂定及28種β.受體激動劑類）殘留的方法，為加強生豬養(yǎng)殖、屠宰過程中違法使用不同種類“瘦肉精”的監(jiān)管提供了可靠的技術(shù)支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC.Xevo TQ MS超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）、UPLC CSH C 18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取裝置、Oasis MCX固相萃取柱（60 mg， 3 mL）均為美國Waters公司產(chǎn)品； 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； 氮吹儀（美國Organomation公司）。

標準品： 鹽酸克侖特羅（Clenbuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸溴布特羅（Brombuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸班布特羅（Bambuterol hydrochloride， 98.0%）、萊克多巴胺（Ractopamine， 97.0%）、沙丁胺醇（Salbutamol， 100%）、鹽酸克倫潘特（Clenpenterol hydrochloride， 99.5%）、羥甲基克倫特羅（Hydroxy.methyl clenbuterol， 99.0%）、克倫丙羅（Clenproperol， 99.0%）、特布他林（Terbutaline， 985%）、非諾特羅（Fenoterol， 100 mg/L， 溶于乙腈）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司； 苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A， 98.0%）、鹽酸馬布特羅（Mabuterol hydrochloride， 99.0%）、齊帕特羅（Zilpaterol， 98.0%）、卡布特羅半硫酸鹽（Carbuterol Hemisulfate Salt， 98.0%）、硫酸丁酚胺（Bamethane sulfate， 98.0%）、苯氧丙酚胺（Isoxsuprine， 98.0%）購自Toronto Research chemicals INC公司； 鹽酸利托君（Ritodrine， 98.0%）購自Tokyo Chemical Industry公司； 鹽酸可樂定（Clonidine hydrochloride）、鹽酸賽庚啶（Cyproheptadine hydrochloride）購自European Pharmacopoeia公司； 氯丙那林（Clorprenaline， 99.0%）、西布特羅（Cimbuterol， 99.0%）、西馬特羅（Cimaterol， 99.0%）、妥布特羅（Tulobuterol， 99.0%）、克倫己羅（Clenhexerol， 99.6%）、鹽酸克倫塞羅（Clencyclohexerol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸異克倫潘特（Clenisopenterol hydrochloride， 99.7%）、鹽酸馬噴特羅（Mapenterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸溴氯特羅（Bromchlorbuterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸噴布特羅（Penbutolol hydrochloride， 99.0%）購自Witega Laboratorien BerlinAdlershof GmbH公司； 酒石酸福莫特羅 （Formoterol tartrate， 98.0%）購自美國International Laboratory 公司。

2.2 標準溶液配制

分別準確稱取各標準品（10.00±0.10）mg， 以甲醇溶解并定容至10 mL， 即為各標準物質(zhì)儲備液。分別量取適量的30種藥物儲備液于另一潔凈10 mL容量瓶中混合，配制100 μg/L混合標準工作液， 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品前處理

準確量取尿液5.00 mL于50 mL具塞離心管中，5000 r/min離心5 min，將上清液用5%乙酸溶液調(diào)至pH 3.0后，加入經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX柱，分別用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，真空泵抽干后以3 mL 5%氨化甲醇洗脫，45℃水浴條件下N2吹近干，用1 mL 0.1%甲酸.乙腈（9∶1， V/V）溶液復(fù)溶，UPLC.MS/MS檢測。

2.4 色譜.質(zhì)譜條件

色譜條件： 流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，液相洗脫梯度程序： 0～1.0 min，95% A； 1.0～3.0 min，95%～87% A； 3.0～4.0 min，87%～60% A； 4.0～5.0 min，60%～10% A； 5.0～5.1 min，10%～95% A； 5.1～7.0 min，95% A。進樣量： 5 μL，柱溫： 35℃，流速： 0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。毛細管電壓2700 V，離子源溫度150℃，霧化室溫度450℃，去溶劑氣（氮氣）流量： 1000 L/h； 錐孔氣（氮氣）流量： 50 L/h； 碰撞氣（氬氣）流量： 0.24 L/h。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

選擇一定濃度的標準溶液，利用Intelstart軟件，以ESI正離子模式對待測藥物進行母離子確認及子離子全掃描。確定以[M+H]+作為各藥物的分子離子，分別對儀器的錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，進行子離子掃描，選取2個豐度強、穩(wěn)定的碎片離子作為定性與定量離子，以滿足歐盟2002/657/EC[17]對于禁用藥物L(fēng)C.MS/MS方法的定性監(jiān)測的規(guī)定，即滿足1個母離子、2個子離子共4個鑒定點數(shù)的要求。因此，本方法根據(jù)待測藥物的保留時間，采用分段掃描的方式對不同藥物的特征離子進行數(shù)據(jù)采集，以提高靈敏度。30種藥物的保留時間及定性、定量離子等參數(shù)見表1。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

由于28種β.受體激動劑藥物具有較為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)及相近的色譜保留特性，而可樂定和賽庚啶與β.受體激動劑藥物化學(xué)性質(zhì)、色譜行為差異較大[16]，為了將上述藥物在盡可能短的時間內(nèi)有效分離，本實驗分別考察了BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）4種型號的色譜柱對30種目標化合物的分離效果。結(jié)果表明，HSS T3色譜柱對目標化合物的保留能力較弱，尤其是沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林等12種極性較強的藥物，即使用含量低于5% 的乙腈進行淋洗，其保留時間均小于1.0 min， 且不能有效分離。其余3種色譜柱均能有效保留30種藥物，而采用CSH C 18色譜柱較BEH C 18和Shield RP 18色譜柱，可有效分離上述藥物，且各化合物峰形尖銳。圖2為30種典型的瘦肉精的空白和加標樣品色譜圖。

為了更好地將待測物有效分離，降低共流出物基質(zhì)干擾，本實驗還考察了甲醇、乙腈分別與水、0.1%甲酸及含 50 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液等作為流動相，對目標化合物的峰形、分離度、靈敏度等的影響。結(jié)果表明，流動相中添加甲酸后，待測物的信號強度明顯提高，且藥物保留時間有所提前； 而以50 mmol/L甲酸銨.0.1%甲酸溶液作為流動相時，待測物的信號強度、分離度等與0.1%甲酸溶液無顯著差異。甲醇和乙腈作為流動相對信號強度的影響不顯著，而甲醇作為流動相進行梯度洗脫時，色譜柱壓差變化范圍較大，平衡時間延長。因此，本實驗采用UPLC CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分析柱，以乙腈.0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫。30種“瘦肉精”藥物可在5.0 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離，各藥物的定量離子的提取離子色譜圖如圖2所示。

3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

本方法采用將尿液簡單離心，直接用MCX固相萃取柱凈化的樣品前處理方法。為了充分確保本方法的可靠性，本實驗考察了文獻[5，19～21]所采用的樣品前處理方法（需酶解、液液萃取和/或固相萃取等步驟），分別采用叔丁醇.叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯/異丙醇[5，20]、HClO4[20，21]等試劑對豬尿樣品中待測藥物的提取，對各操作方法的提取操作步驟、所需的主要化學(xué)試劑及數(shù)量、方法的回收率、精確度等技術(shù)參數(shù)進行比較。檢測結(jié)果表明，本方法不僅可獲得較為滿意的方法準確度、精確度（如表2所示，本實驗采用尿液經(jīng)離心后直接凈化，30種藥物的回收率在67.6%～103.2%，相對標準偏差為2.8%～16.8%），滿足藥物殘留定量確證檢測的要求，而且操作步驟簡單、快速，試劑使用量少，不需要復(fù)雜的樣品前處理步驟，平均每個樣品的提取、凈化過程僅使用很少量的有機溶劑（約7 mL甲醇），較文獻[5，19～21]大大減少了有機溶劑的使用量，尤其是高氯酸等鹵素試劑的使用量。本方法可作為環(huán)境友好型的樣品前處理方法，適用于豬尿液樣品中不同種類“瘦肉精”多殘留大批量樣品的篩選及確證檢測。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 基質(zhì)添加標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限 在上述最佳色譜.質(zhì)譜條件下，將空白豬尿樣品按照2.3節(jié)進行樣品處理，在洗脫液中加入一系列30種藥物混合標準溶液（0.1， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10.0 μg/L），LC.MS/MS進行檢測，以各組分的濃度與其定量離子峰面積進行線性回歸，呈良好的線性關(guān)系（r2>0.992）。以3倍信噪比（S/N）計算，本方法測定豬尿液中30種“瘦肉精”藥物的檢出限為0.1 μg/L； 以l0倍信噪比（S/N）計算，定量限為0.3 μg/L。

3.4.2 準確度和精密度 本實驗，分別在豬尿液中以3個濃度水平（0.3， 0.6和3.0 μg/L）進行空白樣品加標回收實驗，考察方法的回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，以基質(zhì)添加標準曲線進行校正，結(jié)果如表2所示。30種“瘦肉精”藥物的平均回收率在67.6%～103.2%之間，日內(nèi)、日間相對標準偏差分別為2.8%～16.8%和2.6%～15.8%。

3.5 實際樣品的檢測

運用本方法對浙江省某生豬屠宰場隨機抽取的100份豬尿液進行測定，與農(nóng)業(yè)部1025號公告.11.2008[5]和農(nóng)業(yè)部1063號公告.3.2008[19]兩個標準方法的測定結(jié)果基本一致，有1份樣品檢出萊克多巴胺殘留，其余樣品均未檢出“瘦肉精”藥物殘留。利用本方法及兩個行業(yè)標準測定的檢出值分別為6.58、7.03和6.46 μg/L，變異系數(shù)小于4.5%； 而本方法卻極大地節(jié)省了檢測時間， 有機溶劑使用較少， 說明本方法簡單快速、靈敏、可靠。

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Abstract An ultra.high performance liquid chromatography.tandem mass spectrometric （UPLC.MS/MS） method for simultaneous determination of thirty different species of 'lean meat agents' （including clonidine， cyproheptadine， and other 28 β.agonists） residues in swine urine was developed. The parameters of separation conditions of liquid chromatography， MS/MS detection parameters and sample preparation procedure were optimized. After centrifuged at 5000 r/min for 5 min， the swine urine samples were performed directly by MCX column. Then the column was washed with 3 mL of water and 3 mL of methanol， respectively， and then the compounds were eluted with 5% ammonium hydroxide in methanol. The analytes were detected by UPLC.MS/MS after the elution was evaporated to dryness at 45℃ under a stream of nitrogen gas. Under the optimum conditions， thirty of analytes could be well separated in less than 5 min. The linear ranges were 0.1-10 μg/L for all analytes with the correlation coefficient （r2） higher than 0.992. Limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） of this method were less than 0.1 μg/L and 0.3 μg/L， respectively. The mean recoveries of three spiked concentration levels in blank sample varied from 67.6% to 103.2% with the intra. and inter.relative standard deviations of 2.8% to 16.8% and 2.6% to 15.8%， respectively. Overall， the proposed method is simple， quick， reliable， sensitivity， and can be applied in large scale supervision of illegal usage of 30 kinds of 'lean meat agents′.

Keywords Ultra.high performance liquid chromatography.tandem mass spectrometry； Trace residues； Swine urine； Lean meat agents