苦參堿對合軸馬拉色菌麥角固醇生物合成的抑制作用

蔡玲玲　張豐川　 李元文　張小靜　 孫毅坤　李海聰

100078　北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院皮膚科(蔡玲玲、張豐川、李元文)；北京中醫(yī)藥大學藥學院[孫毅坤、李海聰(碩士研究生)]；寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科(張小靜)

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·論著·

苦參堿對合軸馬拉色菌麥角固醇生物合成的抑制作用

蔡玲玲張豐川 李元文張小靜 孫毅坤李海聰

100078北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院皮膚科(蔡玲玲、張豐川、李元文)；北京中醫(yī)藥大學藥學院[孫毅坤、李海聰(碩士研究生)]；寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科(張小靜)

【摘要】目的觀察苦參堿對合軸馬拉色菌麥角固醇生物合成的影響，探討苦參堿抑菌機理。方法本研究分為苦參堿組、酮康唑組及空白組，分別通過高效液相色譜法檢測8天后三組培養(yǎng)基中合軸馬拉色菌的麥角固醇含量，最后采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行分析處理。 結(jié)果苦參堿組、酮康唑組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明兩組均有抑制麥角固醇合成的作用，苦參堿組與酮康唑組兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.65>0.05)，說明兩組抑制麥角固醇合成的作用相當。體外抑菌試驗中兩組藥物對于合軸馬拉色菌臨床株和標準株的抑制強弱有明顯差異(P<0.05)，兩組藥物對于標準菌株的抑菌效果均明顯強于臨床菌株。結(jié)論苦參堿可以抑制合軸馬拉色菌麥角固醇合成，作用與酮康唑相當，考慮其抑菌機制可能與破壞麥角固醇合成有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】苦參堿；合軸馬拉色菌；麥角固醇；酮康唑；高效液相色譜法

苦參堿是由中草藥植物苦參SophoraflavescensAit的根、植株、果實或苦豆子SophoraalopecuroidesL.、廣豆根SophorasubprostrataChun et T．Chen提取制成的,是中藥苦參、山豆根的主要活性成分。近幾年，很多學者都把對苦參堿的相關(guān)研究作為自己的研究方向，發(fā)現(xiàn)苦參堿具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗病原微生物[1]、抗心律失常、抗炎作用及調(diào)節(jié)免疫[2]、抑制增殖、抗過敏、抑制肝纖維化和抑制病毒復制等作用，因此苦參堿的研究受到各方面極大的關(guān)注。本文主要研究苦參堿對于合軸馬拉色菌麥角固醇合成的影響及探討苦參堿抑制馬拉色真菌的作用機制。

1材料與方法

1.1材料

苦參堿粉由湖北午時藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準字:H20059335)。酮康唑粉由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，含量99.9%，溶于2.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，控制DMSO終濃度低于1%。橄欖油固體培養(yǎng)基(成分為：橄欖油、土豆、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、氯霉素、蒸餾水)、酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose，YEPD)(成分為：酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、氯霉素、蒸餾水)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、氫氧化鉀溶液、Fisher甲醇溶液、石油醚(沸程30～60℃)、無水Na2SO4。

1.2菌種來源

實驗菌種:實驗用合軸馬拉色菌菌株(臨床菌株:01780 CBS7222; 標準菌株:01899 Malassezia sympodida-lis)，來自北大醫(yī)院微生物室真菌實驗室培養(yǎng)與鑒定。

1.3設(shè)備

FM生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、超凈臺、超聲波細胞粉碎儀(JYD-150，上海芝信)；顯微鏡(OLYMPUS-BX60F5)；冷凍離心機(珠海黑馬)；恒溫振蕩儀、恒溫水浴箱(HH-W420，金壇)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；電子天平、培養(yǎng)平皿、移液器(Eppendorf)；移液器槍頭(Axygen)；燒杯、燒瓶、量筒、藍蓋試劑瓶(Schott)；玻璃棒、藥匙、試管、離心管、錐形燒瓶、梨形漏斗、容量瓶、45 mm濾膜。

1.4色譜條件

色譜柱： Waters symmetry shield TMRP C18， 4.6 mm×250 mm,5 μm；流動相：100%甲醇(Fisher公司)；體積流量：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；進樣量20 μL。Waters 2487雙波長UV檢測器；Waters 1525泵；Waters 1500系列柱溫箱；Breeze色譜數(shù)據(jù)處理工作站；CINTRA型紫外分光光度計。

1.5體外抑菌實驗

通過美國國家臨床實驗室標準化委員會制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對合軸馬拉色菌標準株和臨床株進行體外抑菌試驗，在同一條件下找到苦參堿、酮康唑2組藥物的最佳抑菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)?；静襟E：(1)制備菌懸液：將合軸馬拉色菌標準菌株和臨床株各1株，接種于橄欖油固體培養(yǎng)基上，35℃恒溫溫箱培養(yǎng)2天；連續(xù)傳代培養(yǎng)2次；用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，做好標記。用麥氏管和細胞計數(shù)板調(diào)整濃度為1.0×107CFU/mL。(2)藥液加樣：按照每孔分別含藥液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%的比例，將苦參堿、酮康唑貯備液直接用馬拉色菌液體培養(yǎng)基各配置10個濃度。同時設(shè)一組陰性對照：每孔加入馬拉色菌液體培養(yǎng)基200 μL；一組陽性對照：每孔加入制備好的菌液100 μL及合軸馬拉色菌液體培養(yǎng)基100 μL。在搖床上將菌液及藥液混勻5分鐘,放入35℃恒溫箱孵育。(3)結(jié)果判讀：48小時后觀察結(jié)果，由于馬拉色菌為嗜脂性的，菌落浮在液體表面，微黃色，薄薄一層漂浮在透明的液基表面，肉眼觀察非常清晰，采用直接法讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷的前提是陽性對照生長良好，陰性對照無菌生長清晰，其他孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長受到抑制。若存在拖尾現(xiàn)象，則將每孔內(nèi)生長情況與陽性對照做比較，以生長被抑制80%判定為MIC值，用麥氏管做參照，根據(jù)菌液的清濁程度尋找MBC。最佳抑菌濃度判定標準：達到一定濃度后，即使再增加藥物濃度，細菌抑制程度也不會變化，觀察麥氏比濁管對比所得的濁度保持一致。

1.6檢測麥角固醇的高效液相色譜實驗

1.6.1配置含藥培養(yǎng)基根據(jù)體外藥敏結(jié)果選取苦參堿、酮康唑?qū)?組馬拉色菌的最佳抑菌濃度，于無菌、直徑為60 mm的平皿內(nèi)分別加入的苦參堿粉、酮康唑粉，將40℃左右尚未凝固的橄欖油固體培養(yǎng)基10 mL迅速倒入上述平皿內(nèi)，混勻，待其凝固。加入藥物的質(zhì)量=最佳抑菌濃度×10 mL。

1.6.2制備供試品將新制備的菌液分別接種在含藥和不含藥的橄欖油固體培養(yǎng)基上，設(shè)不含藥的為空白對照組，共10個空白組+10個苦參堿組+10個酮康唑組，最后將30組均置于35℃恒溫培養(yǎng)5天，刮取平皿上的菌苔，分別接種于YEPD液中，用恒溫振蕩儀在35℃下，振蕩培養(yǎng)3天，使真菌處于活化狀態(tài)。然后對于含馬拉色菌的培養(yǎng)液抽濾、用蒸餾水洗滌3次，將濾下的真菌濕菌的試管中再加入PBS液(PH 7.4的磷酸鹽緩沖液)10 mL混懸。將試管放置在盛有冰鹽的燒杯里，放入超聲波細胞粉碎儀臺上，用超聲波細胞粉碎儀內(nèi)的手型夾固定試管，聲波探頭放入試管液面下2 cm和溫度計探頭放入冰塊中。設(shè)置粉碎儀數(shù)據(jù)如下：70 W功率，破碎5秒，間隔3秒，反復90次。破碎后的菌液裝入離心管內(nèi)，放入冷凍離心機10000 rmp，-4℃，離心10分鐘，取上清液作為酶液。酶液中加入新配置的皂化劑(10%KOH+甲醇溶液)20 mL混勻，倒入50 mL錐形燒瓶中，放置在恒溫水浴箱中80℃水浴皂化2小時。得到的皂化物，加石油醚(沸程30～60℃)30 mL，用梨形漏斗萃取3次，加飽和的NaCl溶液20 mL洗滌2次。萃取液合并提取液用無水Na2SO4干燥脫水，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70℃減壓濃縮至干，得到非皂化物(non-saponifiable lipids，NSLs)，加甲醇溶解定容10 mL裝入100 mL容量瓶中，-20℃保存。

1.6.3樣品測定Sigma公司的麥角固醇標準品母液(CAS號: 57-87-4)濃度為10 mg/mL溶于氯仿，也同樣用甲醇溶解稀釋100倍，定容后放置100 mL容量瓶中，濃度為100 ug/mL，-20℃保存。標準品和樣品分別進樣20 μL，每個樣品進樣2次。麥角固醇含量是通過面積歸一法計算，公式：測得樣品的峰面積/標準品的峰面積=樣品濃度/標準品濃度。因此可以測定樣品中的麥角固醇的含量。本實驗反復操作10次，8天為一個實驗周期，本實驗時間為2個月。每個樣品進樣2次×實驗10次，每組樣品分別測200個數(shù)據(jù)，最終麥角固醇含量取均值。

1.7統(tǒng)計學方法

檢測麥角固醇的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)實驗由統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 計算出。藥物作用后的三組數(shù)據(jù)分別經(jīng)過正態(tài)檢驗，結(jié)果：P<0.05，不符合正態(tài)，因此采用非參檢驗中K個獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1體外抑菌實驗

臨床菌株在MIC、MBC值上，無論是苦參堿組還是酮康唑均大于標準菌株，P=0.03<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。臨床菌株之間兩組藥物MIC和MBC差異無統(tǒng)計學意義，P=0.47>0.05。標準菌株之間兩組藥物MIC和MBC差異無統(tǒng)計學意義，P=0.68>0.05。

2.2檢測麥角固醇的HPLC實驗

三組數(shù)據(jù)比較P=0.00<0.01差異有顯著統(tǒng)計學意義，苦參堿組與酮康唑比較P=0.54>0.05兩組差異無統(tǒng)計學意義，苦參堿組與酮康唑分別與空白組比較，P<0.01，有統(tǒng)計學意義。具體結(jié)果見表2。

表1　藥物作用后合軸馬拉色菌臨床菌株和

表2　HPLC測得8天后三組培養(yǎng)基中合軸馬拉色菌

3討論與展望

中藥單體成分簡單、容易配制不同劑型、簡便易推廣，隨著抗菌藥耐藥、不良反應(yīng)多等問題的出現(xiàn)，中藥單體抗真菌的研究越來越多。其中苦參堿抑菌研究較多，朱敏等[1]采用連續(xù)7天涂菌法誘導豚鼠皮膚感染馬拉色菌，篩選出有效的抗馬拉色菌的中草藥單體苦參堿、檸檬醛、丁香酚等3種。楊雪云等[3]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿和氧化苦參堿對供試林木病原真菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中苦參堿對楊褐斑病菌和龍竹材霉變菌抑制作用較強。桂蜀華等[4]采用培養(yǎng)基藥物濃度稀釋法測定苦參堿對13株皮膚癬菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)，發(fā)現(xiàn)苦參堿有較強的抗真菌活性，能抑制和殺滅羊毛狀小孢子菌、白色念珠菌等多種真菌，其中對武漢羊毛狀小孢子菌、武漢白色念珠菌38253的抑制能力最好。

筆者及科研團隊近年一直在研究中藥苦參及單體苦參堿對馬拉色菌及其感染所致的皮膚病的療效和機制[5-8]。本次研究通過麥角固醇測定，說明苦參堿具有較好的抑制合軸馬拉色菌麥角固醇合成的作用，抑制強度與酮康唑相當。以酮康唑為代表抗真菌藥的抑菌機理是通過抑制麥角固醇合成達到破壞真菌細胞膜來抑制真菌繁殖。 該實驗一定程度上說明苦參堿抑制馬拉色菌繁殖的機理可能與影響麥角固醇合成有關(guān)。

此外，通過觀察合軸馬拉色菌臨床菌株和標準菌株的MIC值、MBC值、麥角固醇含量，發(fā)現(xiàn)苦參堿對于標準菌株抑菌效果均強于臨床菌株，說明苦參堿抑菌作用強弱和菌種有關(guān)。SD臨床上容易反復、難以徹底治愈與臨床菌株抑制作用相對欠佳有一定關(guān)系。雖然SD的發(fā)病是多種因素綜合作用的結(jié)果，目前研究發(fā)現(xiàn)SD和皮脂分泌、遺傳因素、神經(jīng)因素、激素水平、馬拉色真菌感染、免疫缺陷以及HIV感染等有相關(guān)性。然而馬拉色菌局部大量繁殖一定會加重局部皮損的炎癥、甚至破壞毛囊，因此將馬拉色菌抑制在一定的程度內(nèi)是治療必要的手段?？鄥A在體外實驗中證明了它對馬拉色菌較好的抑菌作用，然而臨床使用和推廣必須要確保藥物使用的安全性，因此今后可以開展相關(guān)的研究，如MIC值到MBC值范圍內(nèi)的小劑量外用研究等。

參考文獻

[1]朱敏，王俠生，李莉，等.3種中草藥單體治療豚鼠皮膚馬拉色菌感染的實驗研究[J].臨床皮膚科雜志，2008，37(3)：160-162.

[2]劉太華，劉德芳，王駿，等.苦參堿、氧化苦參堿和槐定堿對巨噬細胞RAW264.7表達CD91、CD13和分泌TNF-α的抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學學報，2010，31(4)：399-403.

[3]楊雪云，趙博光，巨云為，等.苦參堿和氧化苦參堿的抑菌活性及增效作用[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，2008,32(2)：79-82.

[4]桂蜀華，付濤，梁遠園，等.苦參堿體外抗真菌活性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011,22(4)：382-385.

[5]張豐川.馬拉色菌中醫(yī)藥治療及研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010,25(12)：2079-2081.

[6]張豐川，蔡玲玲，李元文，等.苦參不同制劑及成分對合軸馬拉色菌標準株體外抑菌實驗研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2012,5(8)：576-581

[7]張豐川. 苦參對合軸馬拉色菌的體外抑菌作用及其機制研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2011.

[8]蔡玲玲.苦參堿對3種常見馬拉色菌體外抑菌研究及臨床療效觀察[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2012.

(本文編輯： 禹佳)

(上接本期第286頁)

化氫，降低脂質(zhì)過氧化物[9]。GSH以多種形式存在于機體內(nèi)，其中GST pi形式在膠質(zhì)細胞與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中高度表達[10-11]。研究表明，GST pi敲除小鼠對四氧嘧啶的神經(jīng)毒性更易感，而GST pi的過表達可降低魚藤酮誘導的皮層神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，從而減少氧化應(yīng)激[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)糖痹康可顯著上調(diào)GCLc和GST pi的蛋白和基因表達，說明糖痹康通過調(diào)節(jié)II相代謝酶保護和修復DPN坐骨神經(jīng)損傷。

Nrf2-Keap1-ARE信號通路是體內(nèi)重要的抗氧化信號通路，在II相酶的表達中起著關(guān)鍵作用[14]。生理狀況下，Nrf2存在于胞漿中并被Keap1抑制，當受到外來物質(zhì)的刺激后，Nrf2與Keap1迅速解離進入核內(nèi)，并與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，促進II相酶基因轉(zhuǎn)錄[15]。本研究團隊將進一步研究糖痹康對Nrf2-Keap1-ARE 信號通路的影響，以進一步解釋糖痹康對DPN坐骨神經(jīng)的保護機制。

[1]中華醫(yī)學會糖尿病學分會糖尿病慢性并發(fā)癥調(diào)查組.中國住院糖尿病患者并發(fā)癥及其相關(guān)危險因素10年回顧性調(diào)查分析[J].中國糖尿病雜志，2003，11(4)：232-237.

[2]Monteiro SM， Boyko EJ， Ribeiro J， et al. Risk stratification systems for diabetic foot ulcers：a systematic review[J]. Diabetologia，2011，54(5)：1190-1199.

[3]Elizabeth L，Marjana TC，Robert SK，et al. The role of surgical debridement in healing of diabetic foot ulcers[J].Wound Repair an Regeneration，2010，18(5)：433-438.

[4]Mayfield JA，Reiber GE，Sanders LJ，et al. Preventive Foot Care in People WithDiabetes[J].Diabetes Care,1998，21(12)：2161-2177.

[5]Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature， 2001，414(6865)：813-820.

[6]劉曉平.銀杏葉提取物(EGb)通過 Keap1-Nrf2-ARE通路誘導藥物代謝二相酶的研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，2007.

[7]Xin WY， Feng QL， Guo JJ，et al. Antioxidation and anti-inflammatory activity of Tang Bi Kang in rats with diabetic peripheral neuropathy[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine，2015，15：66.

[8]Argoff C E，Cole B E，F(xiàn)ishbain D A，et al.Diabetic peripheral neuropathic pain：clinical and quality-of-life issues[J]. Mayo Clinic Proceedings，2006，81(4)：S1-S11.

[9]Dringen. R，Hirrlinger. J. Glutathione pathways in the brain[J]. Biological Chemistry， 2005，384(4)：505-516.

[10]Castro-Caldas M，Neves Carvalho A，Peixeiro I，et al.GSTpi Expression in MPTP-Induced Dopaminergic Neurodegeneration of C57BL/6 Mouse Midbrain and Striatum[J].Journal of Molecular Neuroscience,2009，38(2)：114-127.

[11]Johnson JA1，el Barbary A，Kornguth SE，et al.Glutathione S-transferase isoenzymes in rat brain neurons and glia[J]. Journal of Neuroscience, 1993，13(5)：2013-2023.

[12]Shi M，Bradner J，Bammler TK，et al.Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression[J].American Journal of Pathology,2009，175(1)：54-65.

(本文編輯： 蒲曉田)

Inhibition of matrine on ergosterol biosynthesis of Malassezia sympodialis

CAILing-ling，ZHANGFeng-chuan，LIYuan-wen，etal.DermatologicalDepartment，DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China.

【Abstract】ObjectiveTo test the Malassezia sympodialis ergosterol concentrations by HPLC to discuss mechanism on matrine inhibition of malassezia.MethodsThe ergosterol concentrations of Malassezia sympodialis was checked after matrine or ketoconazole affected by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). ResultsTwo groups can both inhibite ergosterol(P=0.65>0.05),and have no significance. Two groups had abvious differences of malassezia inhibitions on clinical strains when compared with standard strains, two treatment groups both had stronger inhibition in standard groups than clinical groups(P=0.02<0.05). ConclusionMatrine has inhibitions of ergosterol of Malassezia sympodialis as well as ketoconazole. Its inhibition mechanism of Malassezia sympodialis might have relationship of inhibition of ergosterol biosynthesis.

【Key words】Matrine;Malassezia sympodialis;Ergosterol;Ketoconazole;High performance liquid chromatography(HPLC)

(收稿日期：2013-02-15) 2015-12-28)

Corresponding author：ZHANG Feng-chuan， E-mail: bjzfc@sina.com

【中圖分類號】R285

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.011

作者簡介：蔡玲玲(1982- )，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：皮膚性病學。 E-mail: lingling89159166@126.com通訊作者： 張豐川(1968- )，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，中國性學會中醫(yī)性學專業(yè)委員會秘書長。研究方向：真菌感染性皮膚病學。E-mail: bjzfc@sina.com

基金項目：北京市教委科研共建項目