乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌劑抑菌效力研究

通信作者:丁勃，男，研究方向：微生物檢驗，Tel：0531-81216552，E-mail：muscularding@126.com

乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌劑抑菌效力研究

劉艷1,王志宏2,曲金瑤3,丁勃4

(1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264000；2.龍口市出入境檢驗檢疫局，山東 龍口 265700；

3.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264000；4.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

摘要：目的對乙酰半胱氨酸口服溶液中所添加的抑菌劑抑菌效力進行確認。方法將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉作為挑戰(zhàn)菌株，分別加入到抑菌劑含量為處方濃度0、80%、100%和120%的4組乙酰半胱氨酸口服溶液中，在不同時間段檢測樣品中微生物的存活情況。結(jié)果不含抑菌劑的乙酰半胱氨酸不具有充分的抗菌活性，抑菌劑含量為處方濃度80%、100%和120%的乙酰半胱氨酸口服溶液，均可有效抑制微生物的生長繁殖。結(jié)論可選擇1.95 mg·mL-1的苯甲酸鈉和1.49 mg·mL-1的羥苯甲酯鈉，復合使用，作為乙酰半胱氨酸口服溶液的抑菌劑。

關(guān)鍵詞：乙酰半胱氨酸口服溶液；抑菌劑；抑菌效力；苯甲酸鈉；羥苯甲酯鈉

作者簡介：劉艷，女，研究方向：保健食品、化妝品及藥品檢驗，E-mail:liuyan4u@163.com

中圖分類號：R927.1文獻標識碼：A

Studies on antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives for Acetylcysteine Oral Solution

LIUYan1，WANGZhi-hong2,QUJin-yao3，DINGBo4

(1.YantaiCityInstituteforFoodandDrugControl，Yantai264000，China;2.LongkouEntry-ExitInspection

andQuarntine,Longkou265700，China;3.ShandongLuyePharmaceuticalCo.,Ltd.,Yantai264000,China;

4.ShandongInstituteforFoodandDrugControl，Jinan250101，China)

Abstract：ObjectiveTo demonstrate the effectiveness of antimicrobial preservatives that were added to Acetylcysteine Oral Solution.MethodsStaphylococcus aureus，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida albicans and aspergillus niger were used as challenging strains and added into four sets of Acetylcysteine Oral Solution with concentrations of antimicrobial preservatives at 0，80%，100% and 120% respectively.Survival rates of microbes were then examined at different points in time.ResultsThe Acetylcysteine Oral Solution with concentrations of antimicrobial preservatives at 0，80%，100% and 120% could inhibit the growth of microorganisms sufficiently，except for the sample with no antimicrobial preservatives.Conclusion1.95 mg·mL-1 sodium benzoate and 1.49 mg·mL-1 sodium methyl parahydroxybenzoate can be used as antimicrobial preservative for Acetylcysteine Oral Solution.

Key words:Acetylcysteine Oral Solution;Antimicrobial preservatives;Antimicrobial effectiveness;Sodium benzoate;Sodium methyl parahydroxybenzoate

乙酰半胱氨酸口服液主要適用于慢性支氣管炎等咳嗽有黏痰而不易咳出的患者。本品為多劑量口服制劑，主藥為乙酰半胱氨酸，另含有依地酸二鈉、香精、羧甲基纖維素鈉和純化水等輔料，10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值在6.4左右。本品不含明顯抗菌活性物質(zhì)，且所含水分、pH值環(huán)境等較適宜微生物存活。《中國藥典》2010年版(二部)附錄ⅪⅩ N抑菌效力檢查法指導原則規(guī)定，如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常儲藏和使用過程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物發(fā)生變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑[1]。通過對未加入抑菌劑的乙酰半胱氨酸口服液進行抑菌效力檢查試驗，表明本品不能有效抑制挑戰(zhàn)微生物的生長繁殖。因此，本品應(yīng)加入適宜的抑菌劑，并對其抑菌效力的有效性進行確認。

1試驗儀器、菌種與培養(yǎng)基

1.1試驗儀器HFsafe-900生物安全柜；MJ-250-I生化培養(yǎng)箱；GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；INFORS AG CH-4103電熱培養(yǎng)相；MLS-3780型壓力蒸汽滅菌器；VITEK 2 DensiCHEK plus比濁儀；Sartorius CP225D電子天平。

1.2試驗菌種銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；白色念珠菌 (Candidaalbicans) [CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillusniger) [CMCC(F)98003]。以上菌種0代均來自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學菌種保藏中心，工作使用第3代傳代菌種。

1.3試驗培養(yǎng)基胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB，批號：3102321)；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號：3102359)；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：3102267)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：3102306)，均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)培養(yǎng)基的適用性檢查，結(jié)果符合規(guī)定。

2菌液制備方法

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h。取上述培養(yǎng)物加適量的0.9%無菌氯化鈉溶液，將瓊脂表面的培養(yǎng)物洗脫，無菌操作將上述洗脫物轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，加入適量0.9%無菌氯化鈉溶液并采用比濁法制成每1 mL含菌數(shù)為108 cfu的菌懸液。接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌量約為108 cfu的孢子懸液。

3未添加抑菌劑樣品的抑菌效力測試

對未添加抑菌劑樣品的抑菌效力進行測試，考察其在未添加抑菌劑的情況下對微生物的抑制或殺滅能力。根據(jù)結(jié)果，評估本品加入抑菌劑的必要性。

取未添加抑菌劑的樣品5瓶，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液1 mL，使接種后供試液染菌量約為105～106 cfu·mL-1，充分混勻，模擬正常的使用條件20～25 ℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，分別在14 d和28 d對供試品中存活的微生物進行計數(shù)。同時，以0.9%無菌氯化鈉溶液作為對照，按上述操作方法進行測試。

表1　樣品接種菌量計數(shù)結(jié)果

3.1未添加抑菌劑樣品中試驗菌計數(shù)方法驗證為準確計數(shù)14 d和28 d供試品中所含微生物，應(yīng)對樣品菌數(shù)測定方法進行驗證，驗證方法按《中國藥典》2010年版(二部)附錄Ⅺ J中計數(shù)方法的驗證項下要求進行。菌數(shù)測定方法驗證試驗采用上述5種試驗菌，細菌計數(shù)采用胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，真菌計數(shù)采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

表2　取1∶10供試液平皿法驗證結(jié)果

菌落計數(shù)方法驗證表明，可采用樣品1∶10供試液，平皿法計數(shù)，作為未添加抑菌劑樣品中試驗菌計數(shù)方法。

3.2未添加抑菌劑樣品的抑菌效力測試結(jié)果用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將樣品稀釋成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級，采用平皿法進行計數(shù)。細菌、白色念珠菌選取30～300 cfu，黑曲霉選取小于100 cfu作為菌數(shù)報告依據(jù)。未添加抑菌劑樣品14 d和28 d對數(shù)減少值見表3。

表3　未添加抑菌劑樣品14 d和28 d對數(shù)減少值

抑菌效力試驗測定結(jié)果表明，相比較0.9%的無菌氯化鈉溶液，不含抑菌劑的乙酰半胱氨酸口服液對上述試驗菌，整體表現(xiàn)出一定的抑制作用，但是對個別微生物抑制作用并不明顯。例如，銅綠假單孢菌在14 d菌量減少值僅為0.701 g，不符合抑菌劑抑菌效力判定標準。而且，在藥物的正常儲存和使用過程中，可能會發(fā)生的微生物污染情況更為復雜。綜上分析表明，乙酰半胱氨酸口服液本身并不具備充分的抗菌活性，為保證用藥安全，應(yīng)加入適宜的抑菌劑。

4添加抑菌劑樣品的抑菌效力測試

本品以苯甲酸鈉和羥苯甲酯鈉聯(lián)合應(yīng)用，作為抑菌劑，苯甲酸鈉濃度為1.95 mg·mL-1，羥苯甲酯鈉1.49 mg·mL-1，在保證抑菌效能的同時降低了抑菌劑的使用總量。根據(jù)藥用輔料手冊記載，本品成分及包裝與上述抑菌劑均無配伍禁忌[2]。本次試驗擬對包含處方濃度抑菌劑(A組)、80%標準濃度抑菌劑(B組)和120%標準濃度抑菌劑(C組)3種樣品進行抑菌效力試驗測試。

每組樣品取5瓶，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液1 mL，使接種后供試液染菌量約為105～106cfu·mL-1，充分混勻，模擬正常的使用條件20～25 ℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，分別在14 d和28 d對供試品中存活的微生物進行計數(shù)。

4.1添加抑菌劑樣品試驗菌計數(shù)方法驗證A、B、C 3種樣品中，C樣品抑菌劑含量最高，因此，相同稀釋級A和B樣品組菌落計數(shù)方法可按C樣品方法進行。方法驗證結(jié)果表明(見表4)，C樣品1∶10供試液可采用平皿法進行菌落計數(shù)。

表4　C樣品1∶10供試液平皿法驗證結(jié)果

4.2添加抑菌劑樣品的抑菌效力測試結(jié)果用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將樣品稀釋成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級，采用平皿法進行計數(shù)。細菌、酵母菌選取30～300 cfu，真菌選取小于100 cfu作為菌數(shù)報告依據(jù)。樣品14 d和28 d菌落計數(shù)結(jié)果見表5、6；與試驗菌初始值比較，計算A、B、C組樣品中微生物的菌數(shù)lg減少值見表7。

5結(jié)果

表5　添加抑菌劑樣品14 d菌落計數(shù)結(jié)果

表6　添加抑菌劑樣品28 d菌落計數(shù)結(jié)果

表7　添加抑菌劑樣品14 d和28 d菌數(shù)lg下降值

由上表計算結(jié)果分析，含有處方濃度抑菌劑的樣品(A組)、含有80%處方濃度抑菌劑的樣品(B組)和含有120%處方濃度抑菌劑的樣品(C組)，14 d菌數(shù)下降值均不少于1.01 g，14 d到28 d菌數(shù)均不增加，按抑菌劑抑菌效力判定標準，3組乙酰半胱氨酸口服液抑菌效力均符合規(guī)定。

6討論

6.1《中國藥典》2010年版附錄中，首次收載了抑菌劑效力檢查法指導原則。即將頒布的《中國藥典》2015年版，將抑菌效力檢查法指導原則調(diào)整為抑菌效力檢查法。對藥物抗菌活性的確認，確保藥物在貯藏和使用過程中的安全性，已經(jīng)逐漸成為常規(guī)的檢查項目。新標準執(zhí)行之初，如何具體的去操作該項實驗，許多實驗人員在細節(jié)上仍較為迷茫，本文就乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌劑的抑菌效力進行了確認，詳細介紹了口服溶液抑菌效力試驗的操作流程。

6.2在藥物的生產(chǎn)過程中，抑菌劑添加量的允許偏差是±20%[5]。因此，在藥物的研發(fā)階段應(yīng)對抑菌劑處方濃度的80%和120%進行有效性確認，保證抗菌活性的有效性不受投料偏差的影響。

6.3采用復合防腐劑，利用防腐劑間的協(xié)同作用，可以擴大殺菌和抑菌范圍，并使作用強而迅速[6]。乙酰半胱氨酸口服溶液采用1.95 mg·mL-1的苯甲酸鈉和1.49 mg·mL-1的羥苯甲酯鈉復合使用，試驗結(jié)果表明對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭陰性菌(大腸埃希菌和銅綠假單孢菌)繁殖體、酵母菌(白色念珠菌)和真菌(黑曲霉)有較強的抗菌活性，有效避免樣品在正常貯藏和使用過程中的微生物污染和繁殖。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄215-216.

[2]R.C.羅,P.J.舍斯基,P.J.韋勒.藥用輔料手冊[M].鄭俊民譯.北京:化學工業(yè)出版社,2005：447.

[3]蘇德模，馬緒榮，許華玉，等.藥品微生物學檢驗技術(shù)[M].上海:華齡出版社,2007:546-550.

[4]俞樹榮.微生物學和微生物學檢驗[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:451-460.

[5]寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國藥學雜志,2007,42(23):1836-1838.

[6]成海平.藥品研發(fā)中防腐劑的應(yīng)用及質(zhì)控[J].中國新藥雜志,2005,14(8)：954-956.

[7]丁勃,徐曉潔,謝元超.氫溴酸加蘭他敏口服液添加抑菌劑篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2011,31(12)：2312-2317.

[8]胡春紅,陳龍,李季平,等.苯甲酸鈉和山梨酸鉀的復配抑菌效果研究[J].中國調(diào)味品，2012，37(3)：46-49.