天然抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母的抑菌作用

王璇，胡仲秋，袁亞宏，任婷婷，岳田利

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（楊凌），國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

很多食品中都含有水分，但水分多有利于大多微生物的生長(zhǎng)從而導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)[1]。研究表明，溶液滲透壓是食品貨架期的主要影響參數(shù)[1]。許多食品為了延長(zhǎng)其保質(zhì)期，會(huì)適量增加食品中糖或鹽的濃度如蜂蜜、糖漿、醬油和濃縮蘋(píng)果汁等[2]。高滲透壓的食品可以抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，但是有些微生物如耐高滲酵母菌能在高糖和高鹽濃度下生長(zhǎng)。

魯氏接合酵母是一種耐高滲酵母，也是一種重要的食品腐敗菌，由于它具有耐酸、耐高滲、耐弱酸抑菌劑和適應(yīng)高滲環(huán)境及高溫的特性，能夠引起低 pH值、高糖的食品變質(zhì)[3～5]。據(jù)報(bào)道有從濃縮蘋(píng)果汁（糖度70 °Brix，pH值3.5）中分離出魯氏接合酵母菌并可在濃縮蘋(píng)果汁中生長(zhǎng)繁殖[6]，導(dǎo)致脹罐、果汁營(yíng)養(yǎng)成分的損失與破壞、糖度和pH的改變，影響人類(lèi)的身體健康。因此，控制濃縮蘋(píng)果汁中魯氏接合酵母的生長(zhǎng)是果汁加工企業(yè)亟待解決的問(wèn)題[7]。

為延長(zhǎng)濃縮蘋(píng)果汁的保藏期限，傳統(tǒng)的方法是向果汁中添加抑菌劑來(lái)抑制果汁中微生物的生長(zhǎng)從而起到延長(zhǎng)果汁貯藏期的目的，這也是一種方便有效的控制微生物生長(zhǎng)的方法。目前世界上食品工業(yè)中常用的抑菌劑以化學(xué)合成抑菌劑居多，在歐洲國(guó)家山梨酸以及苯甲酸是被允許添加到食品中的抑菌劑，但是對(duì)被添加食品以及添加量有著嚴(yán)格的規(guī)定[8,9]。Arroyo-Lopez等人與Rojo等人曾報(bào)道山梨酸鉀和苯甲酸鈉均可有效抑制橄欖油及濃縮葡萄汁中魯氏接合酵母的生長(zhǎng)[10]，但山梨酸鉀是一種低毒性化學(xué)抑菌劑，苯甲酸鈉可在人體腸道的酸環(huán)境下轉(zhuǎn)化為毒性較強(qiáng)的苯甲酸，會(huì)導(dǎo)致體重下降、腹瀉、出血、癱瘓甚至死亡[11]。化學(xué)合成抑菌劑因其具有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問(wèn)題無(wú)法解決，且對(duì)人體的健康帶來(lái)一定的負(fù)面影響，這與人們追求安全、健康飲食方式的愿望相違背[12]，因此人們開(kāi)始尋求廣譜、高效、低毒的天然食品抑菌劑[13]。在過(guò)去的二十年間，科研人員對(duì)來(lái)源于動(dòng)物、植物及微生物的天然抑菌物質(zhì)進(jìn)行了廣泛研究，以期它們能夠替代傳統(tǒng)化學(xué)抑菌劑有效抑制微生物對(duì)食品的污染[14～16]。天然抑菌劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好和作用范圍廣等合成抑菌劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[17]。按照其來(lái)源可分為微生物源抑菌劑、動(dòng)物源抑菌劑和植物源抑菌劑[18]。香草醛和羥基肉桂酸被報(bào)道能夠有效抑制包括真菌和細(xì)菌在內(nèi)的大部分微生物的生長(zhǎng)，在有效抑制高滲酵母污染領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值[19～22]。納他霉素是由納塔爾鏈霉菌產(chǎn)生的一種多烯大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素[23]，是一種常用的抗真菌劑，其抗真菌廣譜[24]，廣泛應(yīng)用于食用奶酪表面涂層防止霉菌的生長(zhǎng)和污染[25～27]，在食品工業(yè)用來(lái)防止霉菌和酵母菌的污染[28]。ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種由25-30的賴氨酸殘基與3-氨基和羧基功能之間的酰胺鍵的 HOMO陽(yáng)離子聚酰胺的多聚賴氨酸[29,30]。這種肽最初是從一個(gè)白色鏈霉菌株inopolymerus分離出來(lái)的[29]。ε-聚賴氨酸抗菌廣譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌和霉菌都有抗菌作用[31]。但天然抑菌劑活性成分復(fù)雜，抑菌機(jī)制尚不完全明確[32]，其對(duì)魯氏接合酵母的抑菌作用研究還處在雛形階段。

本研究從濃縮蘋(píng)果汁(糖度 70 °Brix，pH 值 3.5)中分離得到的魯氏接合酵母為研究對(duì)象，通過(guò)牛津杯抑菌圈法研究植物源、動(dòng)物源以及微生物源天然抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母的抑菌活性，通過(guò)二倍稀釋法測(cè)定天然抑菌劑的MIC，篩選出對(duì)魯氏接合酵母抑菌效果較好的兩種天然、無(wú)色無(wú)味的食品級(jí)抑菌劑，并通過(guò)比色法測(cè)定添加這兩種抑菌劑后魯氏接合酵母的生長(zhǎng)曲線，比較這兩種抑菌劑單一和復(fù)配協(xié)同抑菌效果，在不同處理?xiàng)l件下對(duì)抑菌劑進(jìn)行處理，觀察其抑菌效果的穩(wěn)定性，為天然抑菌劑延長(zhǎng)濃縮蘋(píng)果汁的貯藏期提供了一個(gè)合理的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌種：魯氏接合酵母 1130（Zygosaccharomyces rouxii），由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院健康食品制造與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室提供。

濃縮蘋(píng)果汁(糖度70 °Brix，pH值3.5)購(gòu)買(mǎi)于陜西果汁加工廠。12 °Brix蘋(píng)果汁：濃縮蘋(píng)果汁與去離子水按約1.0：7.2比例混合，攪拌均勻。

YPD半固體培養(yǎng)基：蛋白胨，酵母浸粉，葡萄糖，瓊脂，蒸餾水。

植物源抑菌劑：薰衣草油、甘松精油、桂油、迷迭香精油、黃荊精油、桉葉精油、阿魏酸、胡椒醇、丁香油、牛至油、香茅油、山蒼子油。

動(dòng)物源抑菌劑：殼聚糖、魚(yú)精蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、葡聚糖。

微生物源抑菌劑：ε-聚賴氨酸、納他霉素、苯乳酸。

以上天然抑菌劑均由上海源葉生物科技有限公司提供，其中精油純度均為99%，阿魏酸、胡椒醇、殼聚糖、魚(yú)精蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、葡聚糖、ε-聚賴氨酸、納他霉素、苯乳酸均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為98%。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-A1160型生化培養(yǎng)箱；YXQ-LS-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器；DK-98IIA型電熱恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌劑的篩查

1.3.1.1 抑菌劑前處理

將抑菌劑溶解配成溶液，用0.22 μm孔徑無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌待用[33]。

1.3.1.2 菌種的活化

將保存在甘油管中的魯氏接合酵母 1130(Zygosaccharomyces rouxii)自然條件下解凍后，置于滅菌后的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于28 ℃，120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。取第一代活化的種子液以2%的接種量接種于無(wú)菌YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液濃度達(dá)到108CFU/mL后，作為種子液待用[34]。

1.3.1.3 抑菌活性的測(cè)定（牛津杯抑菌圈法）

配制固體瓊脂和半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，高壓蒸汽121 ℃，15 min滅菌，在培養(yǎng)皿上倒入薄薄的一層固體瓊脂，待固體瓊脂凝固后，用無(wú)菌鑷子將外直徑為8 mm的牛津杯垂直放在瓊脂平面上[35]，待無(wú)菌半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溫度降為50 ℃左右，將二代活化好的菌液（菌濃度約108CFU/mL）用移液槍吸取2%至半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中緩慢搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）后倒入瓊脂平面上，待半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，此時(shí)半固體培養(yǎng)基中會(huì)形成和牛津杯直徑大小一樣的孔洞。用移液槍吸取100 μL抑菌劑至孔洞中，放入28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌圈直徑，通過(guò)比較抑菌圈直徑來(lái)比較抑菌效果。其中精油和吐溫80以1：1的比例混合，其余抑菌劑均配制成濃度為10 mg/mL的溶液。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.1.4 最小抑菌濃度的測(cè)定（二倍稀釋法）[36]

將抑菌劑用蒸餾水通過(guò)二倍稀釋法稀釋成5個(gè)梯度并進(jìn)行無(wú)菌濾膜除菌。配制半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基溫度降為50 ℃左右，用移液槍吸取2%的抑菌劑加入培養(yǎng)基中混勻并倒平板待凝固形成藥平板后，將活化好的二代種子液（菌液濃度約為108CFU/mL），無(wú)菌蒸餾水稀釋10倍，用移液槍吸取100 μL至藥平板并用刮鏟涂刮均勻，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察長(zhǎng)菌情況。凡是最高稀釋平板中無(wú)菌落形成者，即為該物質(zhì)的MIC。相同條件下，MIC越小，抑菌活性越大。其中精油和吐溫80以1：1的比例混合，其余抑菌劑均配制成濃度為10 mg/mL的溶液。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.2 不同基質(zhì)下魯氏接合酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

蘋(píng)果汁中的成分與 YPD培養(yǎng)基中的成分有所差別，其對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)影響也會(huì)有差別。將濃縮蘋(píng)果汁(糖度 70 °Brix，pH 值 3.5)稀釋成糖度為 12 °Brix，pH為3.8的普通蘋(píng)果汁，105 ℃，15 min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，YPD培養(yǎng)基121 ℃，15 min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，將二代活化好的魯氏接合酵母接入 YPD培養(yǎng)基中，渦旋振蕩器震蕩均勻，離心（10000 r/min，10 min）去上清液，并用已滅菌的果汁洗菌離心（10000 r/min，10 min）三次，接入果汁中使果汁中菌液濃度為 106CFU/mL，120 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)90 h，用分光光度計(jì)測(cè)量在600 nm波長(zhǎng)下菌懸液的吸光值[37]，每5 h取一次樣測(cè)定果汁的OD值，并繪制其生長(zhǎng)曲線，吸光值越大，說(shuō)明微生物的濃度越大，生長(zhǎng)越快[38]。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.3 協(xié)同抑菌效果的測(cè)定（紫外分光光度值法）[39]

因精油有刺激性氣味，有些精油還具有顏色，在果汁中不宜添加，因此從其余抑菌劑中通過(guò)比較MIC以及結(jié)合成本考慮，篩選出抑菌效果較好的兩種無(wú)色無(wú)味水溶性天然食品級(jí)抑菌劑納他霉素和 ε-聚賴氨酸，用超純水配制pH為3.8的檸檬酸溶液，將納他霉素和ε-聚賴氨酸分別溶解在檸檬酸溶液中配制成濃度均為10 mg/mL的溶液，通過(guò)文獻(xiàn)查閱將納他霉素與ε-聚賴氨酸的復(fù)配比設(shè)為7：3、5：5、3：7混合制成1 mg/mL的復(fù)合溶液[10]，并進(jìn)行無(wú)菌濾膜除菌。將濃縮蘋(píng)果汁(糖度 70 °Brix，pH 值 3.5)稀釋為糖度為 12 °Brix，pH為3.8的普通蘋(píng)果汁，105 ℃，15 min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，靜置待溫度降為室溫，將納他霉素、ε-聚賴氨酸以及復(fù)配抑菌劑以不同的量接入果汁中。將二代活化好的酵母菌離心（10000 r/min，10 min）[34]去上清液，并用已滅菌的果汁洗菌離心（10000 r/min，10 min）三次，接入果汁中使果汁中菌液濃度為106CFU/mL，120 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)5 d，每6 h取一次樣測(cè)果汁的OD值，并繪制其生長(zhǎng)曲線，OD值前后差距最小者抑菌效果最好。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.4 不同處理?xiàng)l件下復(fù)合抑菌劑的抑菌穩(wěn)定性比較

1.3.4.1 檸檬酸濃度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響

用去離子水配制不同濃度梯度的檸檬酸溶液作為溶劑，濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%，加入抑菌劑使其濃度為10 mg/mL并進(jìn)行無(wú)菌濾膜除菌。牛津杯抑菌圈法[35]測(cè)定不同檸檬酸濃度下抑菌劑的抑菌效果。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.4.2 溫度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響

用去離子水配制溶劑，用檸檬酸調(diào)節(jié)其pH為3.8，加入抑菌劑并進(jìn)行無(wú)菌濾膜除菌。將抑菌劑放置不同溫度的水浴鍋中加熱 10 min，溫度分別為：20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，處理完畢后牛津杯抑菌圈法[32]測(cè)定不同溫度處理?xiàng)l件下抑菌劑的抑菌效果。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.4.3 紫外照射時(shí)間對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響

用去離子水配制溶劑，用檸檬酸調(diào)節(jié)其pH為3.8，加入抑菌劑并進(jìn)行無(wú)菌濾膜除菌。將抑菌劑放置在離波長(zhǎng)為260 nm的紫外燈1 m的直線距離下照射，分別照射0 min、15 min、30 min、45 min、60 min取出抑菌劑，牛津杯抑菌圈法測(cè)定不同紫外照射時(shí)間處理?xiàng)l件下抑菌劑的抑菌效果。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 天然抑菌劑的抑菌活性測(cè)定

20種天然抑菌劑用牛津杯抑菌圈法，比較其抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3、圖1、圖2和圖3。由表1可知，單寧、茶多酚和竹葉精油對(duì)魯氏接合酵母沒(méi)有抑菌作用，其余均對(duì)魯氏接合酵母有抑菌作用，抑菌效果最好的是黃荊精油，抑菌效果最差的是胡椒醇，精油對(duì)魯氏接合酵母的抑菌效果要比多酚和醇類(lèi)的抑菌效果稍好一些。由表2可知，動(dòng)物源抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母有抑菌作用的種類(lèi)比較少，筆者選取 5種動(dòng)物源抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其中乳鐵蛋白、溶菌酶和葡聚糖酶對(duì)魯氏接合酵母沒(méi)有抑菌作用，殼聚糖和魚(yú)精蛋白對(duì)魯氏接合酵母有抑菌作用，殼聚糖的抑菌效果較差，魚(yú)精蛋白的抑菌效果較好。由表3可知，微生物源抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母的抑菌效果比植物源和動(dòng)物源抑菌劑效果好。由圖 1、圖2和圖3可知，添加相同濃度相同量的抑菌劑至孔中，納他霉素的抑菌圈要大于ε-聚賴氨酸，向孔洞中添加對(duì)照組檸檬酸并未有抑菌圈形成，表明納他霉素對(duì)魯氏接合酵母的抑菌效果要好于ε-聚賴氨酸，溶劑檸檬酸對(duì)魯氏接合酵母沒(méi)有抑菌作用。

圖1 添加納他霉素后抑菌圈大小Fig.1 The size of bacteriostasis after adding namamycin

圖2 添加ε-聚賴氨酸后抑菌圈大小Fig.2 The size of bacteriostasis after adding ε-polylysine

圖3 添加檸檬酸后抑菌圈大小Fig.3 The size of bacteriostasis after adding citric acid

表1 不同植物源抑菌劑的抑菌活性Table 1 The antibacterial activity of different botanical antibacterial agents

表2 不同動(dòng)物源抑菌劑的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of different animal antibacterial agents

表3 不同微生物源抑菌劑的抑菌活性Table 3 The antibacterial activity of different microbial antibacterial agents

2.2 天然抑菌劑最小抑菌濃度的測(cè)定

由表4可知，在植物源抑菌劑中，阿魏酸比胡椒醇的抑菌效果好。精油對(duì)魯氏接合酵母的抑菌效果都比較好，效果最好的是香茅油，效果最差的是丁香油。由表5可知，在動(dòng)物源抑菌劑中魚(yú)精蛋白的抑菌效果比殼聚糖好。由表6可知，在微生物源抑菌劑中，納他霉素的抑菌效果最好，ε-聚賴氨酸次之，苯乳酸的抑菌效果最差。

表4 不同植物源抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母的最小抑菌濃度Table 4 The minimum inhibitory concentration of different botanical antibacterial agents on Zygosaccharomyces rouxii.

表6 不同微生物源抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母的最小抑菌濃度Table 6 The minimum inhibitory concentration of different microbial source antibacterial agent of Zygosaccharomyces rouxii.

2.3 不同基質(zhì)下酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖4 魯氏接合酵母在不同基質(zhì)生長(zhǎng)期間OD值的變化Fig.4 Changes of OD during Zygosaccharomycesrouxii growth in different matrix

蘋(píng)果汁中的成分與 YPD培養(yǎng)基中的成分有所不同，其對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)影響也會(huì)有差別。

圖4是初始菌液濃度為106CFU/mL的YPD培養(yǎng)基和將濃縮蘋(píng)果汁稀釋為糖度為 12°Brix，pH 為 3.8的普通蘋(píng)果汁在120 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)條件下培養(yǎng)90 h的過(guò)程中魯氏接合酵母的生長(zhǎng)曲線。由圖4可知，魯氏接合酵母在YPD培養(yǎng)基中55 h達(dá)到穩(wěn)定期，90 h達(dá)到穩(wěn)定期末期，在蘋(píng)果汁中70 h達(dá)到穩(wěn)定期，90 h達(dá)到穩(wěn)定期末期，且在穩(wěn)定期期間，魯氏接合酵母在YPD中的OD值要高于在果汁中的OD值，可能是蘋(píng)果汁中含有多酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制魯氏接合酵母的生長(zhǎng)。因此，抑菌劑在YPD中的MIC與在蘋(píng)果汁中的MIC略微有所差異。

2.4 協(xié)同抑菌效果的測(cè)定

圖5 果汁中不同納他霉素添加量下魯氏接合酵母生長(zhǎng)期間OD值變化Fig.5 Changes of OD value during Zygosaccharomycesrouxii growth in different amount of natamycin of fruit juice

由前面數(shù)據(jù)可知，對(duì)魯氏接合酵母抑菌效果較好且無(wú)色無(wú)味水溶性天然抑菌劑有納他霉素和ε-聚賴氨酸兩種抑菌劑，都屬于微生物源抑菌劑。但納他霉素在水中的溶解度很小，將其配制成溶液需要添加大量的納他霉素溶液，ε-聚賴氨酸在水中的溶解度較大，但其抑菌效果較納他霉素差，因此需要較高濃度的ε-聚賴氨酸溶液才能徹底抑制魯氏接合酵母。因此可將納他霉素和ε-聚賴氨酸兩種抑菌劑進(jìn)行復(fù)配制成復(fù)合抑菌劑，以提高其抑菌效果。

圖6 果汁中不同ε-聚賴氨酸添加量下魯氏接合酵母生長(zhǎng)期間OD值變化Fig.6 Changes of OD value during Zygosaccharomycesrouxii growth in different amount of ε-polylysine of fruit juice

圖7 果汁中不同復(fù)合抑菌劑配比下魯氏接合酵母生長(zhǎng)期間OD值變化Fig.7 Changes of OD value during Zygosaccharomycesrouxii growth in different ratio of composite antibacterial agent of ε-polylysine of fruit juice

將納他霉素和ε-聚賴氨酸以不同的配比混合后加入接有魯氏接合酵母的果汁中，在600 nm的波長(zhǎng)條件下測(cè)定其菌懸液的吸光度來(lái)判斷其最小抑菌濃度。圖5、圖6和圖7分別為納他霉素、ε-聚賴氨酸以及復(fù)合抑菌劑在果汁中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定，初始OD值和最終OD值前后差值≤ 0.05即可認(rèn)為抑菌劑抑制住了魯氏接合酵母的生長(zhǎng)，其中T1～T5表示納他霉素的濃度分別為 1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5μg/mL，J1～J5 表示 ε-聚賴氨酸的濃度分別為 1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL，T：J=3：7、T：J=5：5、T：J=7：3 表示當(dāng)納他霉素和 ε-聚賴氨酸的復(fù)合濃度為1 μg/mL時(shí)兩者的復(fù)配比分別為：納他霉素：ε-聚賴氨酸=3：7、納他霉素：ε-聚賴氨酸=5：5、納他霉素：ε-聚賴氨酸=7：3。由以上數(shù)據(jù)和魯氏接合酵母在果汁中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定可知，納他霉素在果汁中的MIC是5μg/mL，ε-聚賴氨酸在果汁中的MIC是16 μg/mL，當(dāng)納他霉素：ε-聚賴氨酸為7：3時(shí)，抑菌效果最好，復(fù)合抑菌劑的MIC是1 μg/mL。

以前的研究表明，當(dāng)ΣFIC小于1.00時(shí)，ΣFIC被認(rèn)為是有協(xié)同作用，如果ΣFIC大于1.00，ΣFIC被認(rèn)為是有拮抗作用。最近新的研究表明，如果 ΣFIC小于或等于0.5，則具有協(xié)同作用[22]；如果ΣFIC大于0.5但小于1.00則具有附加作用，ΣFIC大于1.00小于4.00時(shí)表示無(wú)作用，ΣFIC大于4.00時(shí)表現(xiàn)出拮抗作用[43]。

ΣFIC由以下公式計(jì)算[41]：

式中：A為納他霉素的MIC，B為ε-聚賴氨酸的MIC，C為復(fù)合抑菌劑的MIC。

由此計(jì)算得知，當(dāng)納他霉素：ε-聚賴氨酸=3：7時(shí)，ΣFIC 為 0.42；當(dāng)納他霉素：ε-聚賴氨酸=5：5 時(shí)，ΣFIC為 0.36；當(dāng)納他霉素：ε-聚賴氨酸=7：3 時(shí)，ΣFIC 為 0.28。因此，納他霉素與ε-聚賴氨酸具有協(xié)同抑菌效果，協(xié)同抑菌效果最好的復(fù)配比為：納他霉素：ε-聚賴氨酸=7：3。

2.5 不同處理?xiàng)l件下復(fù)合抑菌劑的抑菌穩(wěn)定性比較

2.5.1 檸檬酸濃度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響

檸檬酸的濃度主要影響溶劑的pH，隨著pH的降低其復(fù)合抑菌劑的溶解度會(huì)相應(yīng)增大，但根據(jù)國(guó)外有關(guān)報(bào)道，它們也指出酸度是影響魯氏接合酵母生長(zhǎng)的主要限制因素[43]，與此同時(shí)pH也有可能影響抑菌劑的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)以普通蘋(píng)果汁（糖度為12 °Brix，pH為3.8）為培養(yǎng)基質(zhì)，比較不同檸檬酸濃度溶解相同量的復(fù)合抑菌劑對(duì)魯氏接合酵母抑菌活性的影響。由表7可知，檸檬酸濃度在0.1% ～1.6%范圍內(nèi)，隨著檸檬酸濃度的增加，復(fù)合抑菌劑的抑菌活性呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。可能是隨著檸檬酸濃度的增大，溶液 pH逐漸下降，復(fù)合抑菌劑的穩(wěn)定性受到了影響，從而降低了其抑菌活性。

2.5.2 溫度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響[39]

溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合抑菌劑變性從而影響抑菌劑的抑菌穩(wěn)定性。以普通蘋(píng)果汁（糖度為12 °Brix，pH為3.8）為培養(yǎng)基質(zhì)，比較復(fù)合抑菌劑在不同溫度處理?xiàng)l件下其抑菌活性的大小。由表8可知，在熱處理低于60 ℃時(shí)，溫度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌活性影響隨著溫度的升高抑菌活性逐漸降低，但降低趨勢(shì)不明顯。當(dāng)熱處理高于60 ℃時(shí)，隨著溫度的上升其抑菌活性降低明顯，當(dāng)熱處理達(dá)到100 ℃時(shí)，復(fù)合抑菌劑由原來(lái)的無(wú)色澄清透明溶液變?yōu)闇\綠色澄清透明溶液，其抑菌活性也明顯下降。可能是因?yàn)楦邷貤l件下破壞了復(fù)合抑菌劑內(nèi)部的分子結(jié)構(gòu)，使復(fù)合抑菌劑的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變，影響了其抑菌效果。

2.5.3 紫外照射時(shí)間對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響[39]

抑菌劑在紫外照射下其內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能會(huì)有所變化，進(jìn)而影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抑菌活性。以普通蘋(píng)果汁（糖度為12 °Brix，pH為3.8）為培養(yǎng)基質(zhì)，比較復(fù)合抑菌劑經(jīng)不同紫外照射時(shí)間后其抑菌活性的大小。由表9可知，復(fù)合抑菌劑隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌活性略微有所降低但不明顯，說(shuō)明紫外照射會(huì)對(duì)復(fù)合抑菌劑的抑菌活性有輕微影響，會(huì)使其抑菌活性略微有所降低。

表7 檸檬酸濃度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌活性的影響Table 7 Effect of citric acid concentration on the antibacterial activity of composite antibacterial agent

表8 溫度對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌活性的影響Table 8 Effect of temperature on the antibacterial activity of composite antibacterial agent

表9 紫外線對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌活性的影響Table 9 Effect of ultraviolet rays on the antibacterial activity of composite antibacterial agent

3 結(jié)論

對(duì)魯氏接合酵母有抑菌活性的天然抑菌劑有很多，其中植物源抑菌劑的種類(lèi)最多，抑菌效果較好的是阿魏酸和山蒼子油，動(dòng)物源抑菌劑種類(lèi)最少，吳剛[44]研究了殼聚糖對(duì)啤酒酵母表現(xiàn)出抑制作用，本研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)魯氏接合酵母也有一定的抑菌效果，王南舟等人[45]研究了魚(yú)精蛋白對(duì)啤酒酵母和異常漢遜酵母均有抑制作用，本研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)精蛋白對(duì)魯氏接合酵母也有較好的抑菌效果，但其提取成本較高，考慮到經(jīng)濟(jì)實(shí)惠因素，目前還不能大規(guī)模生產(chǎn)作為食品中的抑菌劑。對(duì)魯氏接合酵母抑菌效果最好的是微生物源抑菌劑，且微生物源抑菌劑以其無(wú)色、無(wú)味、安全無(wú)毒、高效和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)在食品中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[46]。本文通過(guò)對(duì)天然抑菌劑MIC的測(cè)定，篩選出納他霉素和ε-聚賴氨酸兩種微生物源抑菌劑，并將兩種抑菌劑以不同添加配比通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)納他霉素：ε-聚賴氨酸=7：3時(shí)基本能完全抑制住果汁中魯氏接合酵母菌的生長(zhǎng)，且兩種抑菌劑具有協(xié)同抑菌效果。由于不同培養(yǎng)基基質(zhì)的成分不同，對(duì)微生物的生長(zhǎng)也有不同的影響，魯氏接合酵母在YPD中的OD值要高于在果汁中的OD值，可能是蘋(píng)果汁中含有多酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制魯氏接合酵母的生長(zhǎng)。因此，抑菌劑在YPD中的MIC與在蘋(píng)果汁中的MIC也會(huì)略微有所差異。通過(guò)將抑菌劑在不同檸檬酸濃度、不同溫度以及不同紫外照射時(shí)間下測(cè)定其抑菌活性的穩(wěn)定性可知，三種因素都會(huì)影響復(fù)合抑菌劑的抑菌活性。隨著檸檬酸濃度的增加，其抑菌活性逐漸降低；隨著溫度的升高，其抑菌活性逐漸降低；隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌活性逐漸降低。