食品和飼料中鵝源性成分微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)與定量分析

王強(qiáng)，蔡一村，張揚(yáng)，潘良文

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

（2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

肉類產(chǎn)品的種類鑒定和定量在食品安全監(jiān)測(cè)當(dāng)中具有重要作用，在一些歐洲國(guó)家，所有肉類產(chǎn)品均需要明確標(biāo)注動(dòng)物源性成分和所占比例[1]，即便如此，肉類摻假事件仍然時(shí)有發(fā)生[2～5]，極大的增加了消費(fèi)者的不信任感，損害消費(fèi)者利益，對(duì)食品安全帶來挑戰(zhàn)[6～8]。不同的定性或相對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)尤其是實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品和飼料的動(dòng)物源性成分檢測(cè)中[9～15]。與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近幾年興起的依據(jù)DNA拷貝數(shù)直接對(duì)成分進(jìn)行精確定量的檢測(cè)技術(shù)[16～20]，可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線來實(shí)現(xiàn)精確定量分析[21,22]。因此，數(shù)字PCR相較于實(shí)時(shí)熒光PCR具有更準(zhǔn)確、更靈敏、抗干擾等多種優(yōu)勢(shì)[23～26]。

由于現(xiàn)實(shí)生活中肉類產(chǎn)品的定義相對(duì)廣泛，其組成成分也相對(duì)復(fù)雜，如皮膚、肌肉組織、脂肪和內(nèi)臟等均可用作食品和飼料的原料，且在同一物種中不同的成分所包含的DNA含量也不盡相同[7]，給定量檢測(cè)帶來較大困難。相較于其他形式的肉類成分，肌肉組織更常用作食品及飼料的原材料，用于直接烹飪和加工[27]。另外，線粒體基因作為靶基因在物種的定性檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于線粒體基因在同一物種的不同組織中的含量差異巨大，不利于定量檢測(cè)，而單拷貝核基因相較于線粒體基因具有拷貝數(shù)少且數(shù)量相對(duì)恒定等特點(diǎn)，具有準(zhǔn)確且穩(wěn)定的定量檢測(cè)優(yōu)勢(shì)[24,28,29]，有利于對(duì)肉類產(chǎn)品的定量檢測(cè)。因此本項(xiàng)目利用微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)對(duì)食品和飼料中鵝源性成分的精確定量方法進(jìn)行研究，通過建立單拷貝核基因的拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量之間的線性關(guān)系對(duì)鵝源性成分進(jìn)行精確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的中國(guó)家鵝（Anser cygnoides domesticus）和歐洲家鵝（Anser anser domesticus）均取自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牛、綿羊、山羊、豬、雞、鴨、兔子、鴿子、鮭魚、鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧和雞肉罐頭為市售商業(yè)化肉類產(chǎn)品；水牛、馬、驢、鹿、駱駝、貓、狗、狐貍、火雞、野雞、鵪鶉和小鼠樣品均為本實(shí)驗(yàn)室留存的樣品。選取動(dòng)物肌肉組織切碎，利用烘箱80 ℃干燥72 h，使用液氮粉碎儀粉碎成超細(xì)粉末。

苯酚/氯仿/異戊醇、引物和探針，上海 Sangon Biotech公司；DNA提取裂解液、蛋白酶K溶液，北京Tiangen公司；醋酸鈉上海Beyotime公司；超純水美國(guó)Invitrogen公司；無水乙醇上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；擴(kuò)增預(yù)混液（ddPCRTMSupermix for Probes）、微滴生成專用油美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UFE500AO烘箱，德國(guó)Memeert公司；BSA224s電子天平，北京Sartorius公司；SPEX 6870液氮研磨儀，美國(guó)SamplePrep公司；Vortex Genius 3震蕩儀，德國(guó)IKA公司；Thermomixer comfort恒溫震蕩孵育器、4515冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；NanoVue分光光度計(jì)，英國(guó)Biochrom公司；QX100數(shù)字PCR微滴生成儀、T100 PCR儀、QX200數(shù)字PCR微滴分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設(shè)計(jì)

選取中國(guó)家鵝單拷貝核基因序列（GenBank序列號(hào)：NW_013185870.1）[30]在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì)，使用Primer Express? Software version 3.0設(shè)計(jì)引物和探針，引物及探針序列見表 1。再通過提取中國(guó)家鵝和歐洲家鵝共9個(gè)品系及其他21種動(dòng)物物種的基因組DNA（表2），利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)所設(shè)計(jì)的引物和探針的種間特異性和種內(nèi)保守性進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 引物及探針序列Table 1 Primers and probe sequences

1.3.2 樣品DNA提取

使用苯酚/氯仿抽提法[31]對(duì) 10份質(zhì)量分別為10～100 mg的鵝肉粉，每份樣品3次重復(fù)，以及其他肉粉樣品（各100 mg）進(jìn)行DNA提?。杭?00 μL裂解液和10 μL蛋白酶K，65 ℃恒溫震蕩孵育60 min加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇混勻后12000 r/min離心10 min，取上清液再進(jìn)行一次酚/氯仿純化后加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 M醋酸鈉（pH 5.2）混勻，置于-20 ℃沉淀30 min后，12000 r/min離心30 min，使用75%乙醇漂洗兩次并置于室溫干燥后加100 μL超純水復(fù)溶備用。

1.3.3 數(shù)字PCR檢測(cè)

ddPCR反應(yīng)體系為：上、下游引物各1.8 μL（900 nmol/L），探針 0.5 μL（250 nmol/L），ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，DNA 模板 4 μL，加水至20 μL。利用Bio-Rad QX100數(shù)字PCR微滴生成儀將20 μL體系混合物生成微滴，再利用 Bio-Rad T100 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。ddPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，98 ℃微滴固化10 min后，4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后利用Bio-Rad QX200微滴分析儀讀取DNA拷貝數(shù)。

1.3.4 樣品DNA含量與靶基因拷貝數(shù)關(guān)系

將提取的鵝基因組DNA系列稀釋至50、40、30、20、10、5、1 ng/μL共計(jì)7個(gè)濃度，并對(duì)上述7個(gè)濃度樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。3次平行實(shí)驗(yàn)后，以平均值建立樣品核酸含量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式。

1.3.5 LOD和LOQ

將ddPCR定量后的DNA稀釋至100、50、10、5、1、0.1、0.01 copies/μL共計(jì)7個(gè)濃度，并對(duì)上述7個(gè)濃度樣品進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，每個(gè)濃度8個(gè)重復(fù)。通過3次平行實(shí)驗(yàn)，明確該方法的LOD和LOQ。

1.3.6 準(zhǔn)確性與適用性

提取10份質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 10%～100%的鵝肉粉混合樣本和鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧、雞肉罐頭共8種市售商品（各100 mg）的基因組DNA，稀釋后進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，利用建立的定量檢測(cè)方程，對(duì)鵝源性成分含量進(jìn)行檢測(cè)，通過3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和適用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性

所選取的目標(biāo)基因片段在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì)，沒有發(fā)現(xiàn)與其它物種存在任何交叉情況出現(xiàn)。利用實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)所設(shè)計(jì)的引物和探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示只有中國(guó)家鵝和歐洲家鵝有特異性擴(kuò)增，其他物種均無特異性擴(kuò)增（表2），表明所設(shè)計(jì)的引物和探針在理論和實(shí)踐中均具有良好的種間特異性和種內(nèi)保守性。

2.2 樣品質(zhì)量與DNA含量關(guān)系

圖1 鵝肉粉質(zhì)量（mg）和核酸含量（ng/μL）間的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between goose quantity (mg) and nucleic acid content (ng/μL)

使用NanoVue分光光度計(jì)將3次提取的各10份不同質(zhì)量的鵝肉粉樣品的基因組DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，每個(gè)樣品檢測(cè)3次。

結(jié)果表明鵝肉粉質(zhì)量（mg）和相應(yīng)的核酸含量（ng/μL）間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖1）。

表2 引物及探針種間特異性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Exclusive specificity test results of the primer and probe

2.3 樣品DNA含量與靶基因拷貝數(shù)關(guān)系

三次平行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在濃度梯度范圍內(nèi)，鵝的核酸含量與靶基因拷貝數(shù)間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖2）。

圖2 DNA含量（ng/μL）與靶基因拷貝數(shù)（copies/μL）間的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between target DNA content (ng/μL)and target DNA copy number (copies/μL)

2.4 建立定量檢測(cè)方程

根據(jù)樣品質(zhì)量與DNA含量之間的線性關(guān)系以及DNA含量與靶基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系兩個(gè)關(guān)系式，建立樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式如下：M goose=0.00136×C+0.856，其中C代表靶基因拷貝數(shù)（copies/μL），M代表樣品的質(zhì)量（mg）。在實(shí)際的檢測(cè)過程中，由于數(shù)字PCR的檢測(cè)范圍有限，需要對(duì)所提取的樣品基因組DNA進(jìn)行稀釋至圖2所示的范圍內(nèi)，N代表稀釋倍數(shù)，則樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式轉(zhuǎn)化為：M goose=N×0.00136×C+0.856。

2.5 LOD和LOQ

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，當(dāng)檢出率≧95%時(shí)為最低檢測(cè)下限，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≦25%時(shí)為定量檢測(cè)下限[32]。三次平行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，靶基因拷貝數(shù)在 1 copy/μL 時(shí)的檢出率≧95%，在 5 copy/μL 時(shí)的RSD≦25%，因此，該檢測(cè)方法的LOD95%和LOQ分別為1 copy/μL 和 5 copies/μL（表 3）。

表3 LOD和LOQ檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of the LOD and LOQ tests

2.6 準(zhǔn)確性和適用性

表4 鵝肉粉已知含量檢測(cè)結(jié)果Table 4 Quantification of samples with known concentrations of goose material

對(duì)10份已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鵝肉粉混合樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，鵝肉粉混合樣品定量檢測(cè)結(jié)果與肉粉實(shí)際質(zhì)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，相對(duì)誤差均低于±5%（表4），符合定量檢測(cè)要求，表明該ddPCR檢測(cè)方法具有較高準(zhǔn)確性。另外，對(duì)鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧和雞肉罐頭共8種市售商品的檢測(cè)結(jié)果顯示，鵝肉丸和燒鵝中鵝源性成分含量分別為43.44%和56.27%，其余6種商品未檢出鵝源性成分（表5），即未發(fā)現(xiàn)鵝肉摻假其他肉類產(chǎn)品，表明該方法具有良好的適用性。

表5 市售商品定量檢測(cè)結(jié)果Table 5 Quantification results of the commercial products

3 結(jié)論

本研究選擇單拷貝核基因作為靶基因利用微滴式數(shù)字 PCR技術(shù)對(duì)食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測(cè)與精確定量，通過構(gòu)建鵝源性成分靶基因拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量之間的線性關(guān)系對(duì)鵝源性成分進(jìn)行精確定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了從靶基因拷貝數(shù)到樣品實(shí)際質(zhì)量間的一步轉(zhuǎn)化，無需利用相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)來定義檢測(cè)下線和定量檢測(cè)下限，簡(jiǎn)化了定量過程。并對(duì)該方法的特異性、檢測(cè)下限（LOD）和定量檢測(cè)下限（LOQ）分別進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法具有良好的種間特異性和靈敏度，檢測(cè)下限和定量檢測(cè)下限分別為1 copy/μL和5 copies/μL；利用已知成分含量樣品和市售商品對(duì)該方法的準(zhǔn)確性和適用性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示鵝肉粉混合樣品定量檢測(cè)結(jié)果與肉粉實(shí)際質(zhì)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，相對(duì)誤差低于±5%，且實(shí)驗(yàn)中的市售商品除明確已知的鵝源性商品外其余商品未發(fā)現(xiàn)鵝肉摻假其他肉類產(chǎn)品，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和適用性，可用于對(duì)食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測(cè)和精確定量。該定量檢測(cè)方法的建立，也可以應(yīng)用于其他肉類食品和飼料的定量檢測(cè)，為我國(guó)食品和飼料安全的市場(chǎng)監(jiān)管和相關(guān)執(zhí)法提供技術(shù)保障。另外，該方法還存在一定的不足之處，本研究以動(dòng)物的肌肉組織為取樣材料，未能對(duì)其他動(dòng)物組織如皮膚、脂肪及內(nèi)臟等進(jìn)行全面的適用性驗(yàn)證，今后也將對(duì)上述問題進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探索。