OPA-FMOC柱前衍生化HPLC法測定兩種常用食用菌中蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸的含量

謝志茹，程敏，譚麗容，肖雪，李莎莎

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州 510006）（2.弘正道（中國）中藥研究有限公司，廣東廣州 510623）

（3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510006）

食用菌具有極好的營養(yǎng)價值和保健功效，如抗菌、抗腫瘤、降血壓、降血脂、護肝和健胃助消化等，這可能與其中的氨基酸（AA）和蛋白質(zhì)成分有關(guān)[1,2]。基于此，已有關(guān)于其蛋白質(zhì)及氨基酸的研究報道[3,4]。AA作為具有生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，其活性與AA的種類及含量有關(guān)，如螺旋藻水解肽的抗氧化性與其氨基酸含量有關(guān)[5]。另一項研究也證明食物蛋白水解物具有潛在的抗氧化活性且該活性與適當量的特定氨基酸相關(guān)[6]。

游離氨基酸（FAAs）是人體維生素E及葉酸的來源[7]，也是提高或改善天然食品鮮味和風味的重要成分[8,9]，如天冬氨酸及谷氨酸對紫果西番蓮的鮮味起重要作用[10]。蛋白氨基酸（PAA）為常見的組成人體蛋白質(zhì)的 20種氨基酸[11]，是蛋白質(zhì)執(zhí)行生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)。非蛋白氨基酸（NPAA）如 γ-氨基丁酸、鳥氨酸作為功能性氨基酸，具有充當神經(jīng)遞質(zhì)、抗癌、抗菌等生物活性[12]，目前對游離氨基酸的研究多是對PAA的測定，如王富花利用HPLC法測定茶葉中17種蛋白氨基酸[13]，唐翎利用柱前衍生HPLC法測定猴頭菌絲體中 15種游離蛋白氨基酸[14]。香菇、金針菇作為常用食用菌，于海龍等利用氨基酸測定儀測定香菇子實體中常見 18種 PAA[15]，陳惜燕等利用HPLC-ELSD對包含金針菇在內(nèi)的8種食用菌的15種PAA進行測定[16]，均缺少對NPAA的測定。故本文以香菇及金針菇為例，測定常用食用菌中的 PAA及NPAA，并通過對比氨基酸組成及含量，對其營養(yǎng)價值及風味進行評價。

目前對氨基酸的測定有陽離子交換色譜法及高效液相色譜法，前者準確性高，但是靈敏度較低，且價格相對昂貴。后者因氨基酸屬于極性大且無紫外吸收的一類化合物，故需進行衍生化，該方法方便快捷，故本文采用OPA-FMOC柱前衍生化HPLC法對香菇及金針菇中PAA及NPAA進行測定，以期為食用菌的進一步開發(fā)及利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原材料

香菇（批號：YY02AB2016、YY05AB2016、XG16B03-170705、KDX16D04-170726、XG16E06-170830、YG03AC2016、YG02AC2016）、金針菇（批號：WLJZG170901、WLJZG170902、WLJZG170703、WLJZG170801）干品均由弘正道（中國）中藥研究有限公司提供。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇（HPLC級）購于德國默克公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、四氫呋喃、硼酸購于天津市致遠化學試劑有限公司；3-巰基丙酸購于上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）購于美國Sigma公司；天冬氨酸（Asp，批號 wkq16082503）、谷氨酸（Glu，批號wkq17010904）、天冬酰胺（Asn，批號wkq17010305）、絲氨酸（Ser，批號wkq16090603）、甘氨酸（Gly，批號wkq16110106）、蘇氨酸（Thr，批號wkq16090801）、精氨酸（Arg，批號wkq16090702）、丙氨酸（Ala，批號 wkq17011305）、 γ-氨 基 丁 酸 （GABA，wkq17011602）、酪氨酸（Tyr，批號 wkq16090304）、α-氨基丁酸（AABA，wkq17021001）、纈氨酸（Val，批號 wkq16082004）、甲硫氨酸（Met，批號wkq16090704）、苯丙氨酸（Phe，批號wkq16090605）、異亮氨酸（Ile，wkq16092108）、鳥氨酸（Orn，批號wkq17020103）、亮氨酸（Leu，批號 wkq16090402）、賴氨酸（Lys，批號wkq16090804）、脯氨酸（Pro，批號wkq16101204）購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%；純化水自制。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀（配有G1322A在線脫氣機、G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器、G1329B自動進樣器）、Agilent ChemStation色譜工作站（版本 04.03.054.），美國Agilent公司；pH計、十萬分之一天平、萬分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超純水儀系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品的制備

香菇子實體、金針菇全株干品粉碎，過60目篩，分別取2.0 g粉末加18倍水，浸泡1 h，回流提取4 h，補足失重，提取液過0.22 μm微孔濾過，得供試品。

1.2.2 氨基酸測定方法的建立

依據(jù)Xiao X所做研究并進行改進[17]。1.2.2.1 溶液配制

OPA溶液：取OPA 80 mg，加0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 10.4）7 mL，乙腈1 mL，3-巰基丙酸125 μL，溶解；FMOC溶液：取FMOC 40 mg，加乙腈8 mL溶解。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：Alltima C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動相A：25 mmol/L磷酸二氫鈉-四氫呋喃（體積比為 995：5，pH=7.2）；流動相 B：50 mmol/L 磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈（體積比為 50：35：15，pH=7.2）。梯度洗脫程序為：0～8 min，5%～19% B；8～20 min，19%～35% B；20～34 min，35%～60% B；34～40 min，60%～70% B；40～50 min，70%～100% B；50～80 min，100%～100% B。流速：0.8 mL/min。檢測波長：0～60 min，338 nm；60～80 min，262 nm。使用程序進樣，將5 μL 樣品、5 μL 硼酸鹽緩沖液、1 μL OPA溶液、1 μL FMOC溶液、28 μL蒸餾水置于定量環(huán)中混合，進樣20 μL。

1.2.2.3 標準曲線繪制及方法檢出限測定

準確稱取AA標準品適量，用1% HCl溶液制備成1 mg/mL溶液。再將其混合，制備混標，并進行梯度稀釋。進樣分析，繪制峰面積-質(zhì)量濃度標準曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。并將信噪比為3時AA濃度作為檢出限。

1.2.2.4 儀器精密度考察

取香菇樣品，按 1.2.1項制備供試品，按1.2.2.2項下色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6針，記錄保留時間及峰面積，并計算保留時間及峰面積的RSD。

1.2.2.5 方法重復性考察

取香菇樣品，按1.2.1項平行制備供試品6份，按

1.2.2.2項下色譜條件進行檢測，記錄保留時間及峰面積，并計算保留時間及峰面積的RSD。

1.2.2.6 方法穩(wěn)定性考察

取香菇樣品，按1.2.1項制備供試品，于0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按1.2.2.2項下色譜條件進行檢測，記錄保留時間及峰面積，并計算保留時間及峰面積的RSD。

1.2.2.7 加樣回收率

取香菇樣品，按100%含量加入AA標準品，按

1.2.1項平行制備供試品6份，按1.2.2.2項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，并計算加樣回收率。

1.2.3 樣品測定

取香菇、金針菇供試品，按照1.2.2.2項下色譜條件進行氨基酸的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Agilent ChemStation工作站，根據(jù)色譜圖，對比色譜峰保留時間進行定性分析，根據(jù)峰面積和標準曲線對樣品中AA進行定量分析。

味道強度值（taste active value，TAV）是某AA組分濃度與其味覺閾值的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇及金針菇中AA的組成

19種AA混標、香菇及金針菇中AA HPLC測定結(jié)果如圖1所示，在該色譜條件下可以實現(xiàn)19種AA的分離，在金針菇和香菇中AA的種類僅相差1種，金針菇中無Met。在香菇中含有15種PAA，分別為Asp、Glu、Asn、Ser、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys，2種NPAA，分別為GABA、Orn。本研究改進Xiao X研究中的色譜條件流動相B組成，達到AABA同Tyr，GABA同Ala的分離度大于1.5，從而實現(xiàn)同時測定17種PAA和2種NPAA；一級氨基酸最大吸收波長為338 nm，二級氨基酸最大吸收波長為262 nm，故本研究中增添262 nm檢測波長以檢測Pro。

圖1 19種AA混合標準品溶液（a）、金針菇（b）、香菇（c）HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed AA standards sample(a),Flammulina velutipes(b) and Letinous edodes(c)

2.2 標準曲線繪制及方法檢出限

以各AA質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到各AA的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，AA混標進行梯度稀釋后測定檢出限。結(jié)果見表1。由表 1可知在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r2）分布在0.9990～1.0000，說明AA峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，此條件可用來測定AA含量。

表1 19種AA標準曲線Table 1 Regression equations and correlation coefficients for AA

2.3 儀器精密度

17種AA保留時間RSD分布在0.01%～0.26%之間，峰面積RSD分布在1.56%～4.77%間，表明儀器精密度良好。

2.4 方法重復性

17種AA保留時間RSD位于0.02%～0.34%之間，峰面積RSD位于1.72%～4.78%之間，表明該方法重復性較好。

2.5 方法穩(wěn)定性

在 24 h內(nèi)，17種 AA保留時間 RSD為0.02%～0.24%，峰面積RSD為1.41%～4.42%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 加樣回收率

本試驗的加樣回收率為101.24%～105.59%之間，說明該方法準確度較高。

2.7 香菇及金針菇質(zhì)量評價

2.7.1 香菇及金針菇PAA中EAA及FAA評價

香菇及金針菇中PAA含量測定結(jié)果如表3所示，兩種菌類中PAA含量存在較大的差異。金針菇中PAA含量為16.79 mg/g，其中有6種EAA，分別為Thr、Val、Phe、Ile、Leu、Lys，含量為 5.98 mg/g，結(jié)果與已有研究略有差異[18]，可能與金針菇的來源、品種不同有關(guān)。香菇中PAA含量為10.99 mg/g，其中EAA為7種，含量為4.39 mg/g，同金針菇中EAA相比多了Met。兩種常用食用菌中，金針菇的PAA、EAA含量較高，營養(yǎng)價值高；香菇的 EAA種類多，營養(yǎng)價值均衡。

TAV為呈味物質(zhì)測定值與呈味物質(zhì)味覺閾值的比值[19]。本研究參考的味道閾值為氨基酸的水溶液測定值[20]。由表 3可知，在香菇中大于味覺閾值的 FAA有Glu、Arg、Ala、Val、Met和Lys，其TAV值分別為8.4，1.5，2.8，1.4，4.3，1.3。在金針菇中FAA的TAV大于閾值的有Glu、Arg、Ala、Val、Phe和Lys，其TAV值分別為9.1，2.1，4.4，1.5，1.6，3.1。在香菇中，F(xiàn)AA總量為5.40 mg/g，Glu和Met為主要的FAA，其含量為3.83 mg/g，在金針菇中，F(xiàn)AA總量為9.96 mg/g，其主要FAA為Glu和Ala，含量為5.38 mg/g。Glu是鮮味氨基酸中的特征氨基酸，Ala為呈甘味的特征氨基酸[21]，Met可發(fā)生美拉德反應而形成肉香[22]。在兩種常用食用菌中，金針菇的 FAA含量高于香菇，金針菇比香菇味道更鮮美。

2.7.2 香菇及金針菇中NPAA

NPAA是除組成人體蛋白質(zhì)的常見 20種氨基酸之外的氨基酸，且其參與神經(jīng)傳遞，具有抗癌、抗菌等生物活性[12]。兩種菌類中NPAA有GABA和Orn，香菇中NPAA含量為2.37 mg/g。金針菇中NPAA含量為3.99 mg/g。

氨基丁酸分為 α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基丁酸三種類型，均具有抑菌作用[23]，其中GABA屬于強神經(jīng)抑制氨基酸，具有多種生物活性，如鎮(zhèn)靜、降血壓、抗焦慮、抗抑郁、增強記憶力等[24～27]。在兩種食用菌中均檢測到GABA，且金針菇中GABA含量為2.38 mg/g，香菇中為 1.59 mg/g。作為新資源食品，SFDA允許GABA可作為食品添加劑，我國規(guī)定其攝入量不得超過500 mg/d。

鳥氨酸作為NPAA，同樣具有廣泛的生物活性，因其參與尿素循環(huán)，故對機體有一定的解毒作用，可刺激腦垂體分泌生長激素，促進糖、脂肪的代謝而促進蛋白質(zhì)的合成[28]，同樣也具有增強免疫力、抗癌的活性[29]。在金針菇中含量為1.61 mg/g，香菇中為0.78 mg/g。金針菇中NPAA含量高于香菇，結(jié)合其增強免疫力，提高記憶力等保健功能，金針菇營養(yǎng)價值高于香菇。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率（%）Table 2 Precision, stability, repeatability and recovery tests of AA (%)

表3 香菇、金針菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

表3 香菇、金針菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

AA 味道特征 味覺閾值/(mg/g) AA含量/(mg/g) TAV香菇 金針菇 香菇 金針菇Asp^ 鮮（+） 1.0 0.26±0.09 0.24±0.09 0.3 0.2 Glu^ 鮮（+） 0.3 2.53±0.75 2.73±0.39 8.4 9.1 Asn - - 0.41±0.11 0.34±0.07 - -Ser 甜（+） 1.5 0.44±0.07 0.86±0.18 0.3 0.6 Gly^ 甜（+） 1.3 0.30±0.10 0.79±0.17 0.2 0.6 Arg 甜/苦（+） 0.5 0.73±0.23 1.04±0.23 1.5 2.1

注：*為必需氨基酸；^為呈味氨基酸；Δ為非蛋白氨基酸；（+）為令人愉快的味道；（-）為令人不愉快的味道；-為未報道；ND為未檢出。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用OPA-FMOC柱前自動衍生化法對氨基酸樣品進行測定，在該色譜條件下可實現(xiàn)19種氨基酸的分離，采用儀器自動衍生，操作方便，結(jié)果可信，可用于金針菇、香菇中PAA及NPAA測定。

3.2 香菇中EAA種類多于金針菇，金針菇中EAA、FAA、NPAA含量均高于香菇，基于游離氨基酸，金針菇營養(yǎng)價值高，味道鮮美，香菇營養(yǎng)價值更均衡。