食品中蠟樣芽孢桿菌的分離及攜帶毒力基因的檢測

白鳳嵐，陳松，羅夢幽，曾寶鋒，唐俊妮

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種革蘭氏陽性菌，能形成芽孢的條件致病菌，廣泛存在于土壤、空氣、水及植物源、動物源加工的食品中，導(dǎo)致腹瀉型或嘔吐型食物中毒，是一種常見食源性條件致病菌[1,2]。蠟狀芽孢桿菌腹瀉型毒素是一種多元化毒素，目前鑒定出的主要包括溶血素HBL（Hemolysin BL）、非溶血性腸毒素Nhe（Nonhemolytic enterotoxin）、細(xì)胞毒素CytK（Cytotoxin K）、腸毒素T（BceT）和腸毒素FM (EntFM)等。溶血素Hbl基因組成一個操縱子，通常由hblA、hblB、hblC、hblD四個基因組成，也有的缺失hblB基因，只由hblA、hblC、hblD三個基因組成，分別編碼L2蛋白、L1蛋白、B蛋白。非溶血性腸毒素（NHE）由nheA、nheB、nheC三個基因組成一個操縱子，其分泌的蛋白能引起食物中毒。細(xì)胞毒素K是一類穿孔毒素，能在細(xì)胞磷脂雙分子上形成孔洞，破壞細(xì)胞的完整性以及離子平衡，對細(xì)胞產(chǎn)生致死作用[3～5]。蠟狀芽孢桿菌嘔吐毒素 Cereulide是一種環(huán)形的小分子肽，抗熱性強(qiáng)，對各種物理和化學(xué)因素不敏感，一般的食品加工過程無法將其破壞，引發(fā)食物中毒，并伴有嘔吐癥狀。嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的目標(biāo)基因為ces和cer。另外，蠟樣芽孢桿菌的看家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中可檢出，用于菌株的輔助鑒定[6]。目前在我國食品安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，對蠟樣芽孢桿菌的限量值并沒有明確規(guī)定，致使食品生產(chǎn)過程中對該菌的控制不明確，因此，有必要了解食品中蠟樣芽孢桿菌的潛在毒性及威脅。

本實驗通過對成都市售賣的食品進(jìn)行采樣并分離污染的蠟樣芽胞桿菌，檢測其毒力基因，以了解成都市食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況。獲得的數(shù)據(jù)對食品中蠟樣芽孢桿菌的防控措施具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑

氯化鈉、異戊醇、冰乙酸購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甘露醇卵黃多粘菌素培養(yǎng)基（MYP)、多粘菌素 B、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購于青島高科園海博生物科技有限公司；SDS購于成都市科龍化工試劑廠；Tris飽和酚購于北京博奧拓達(dá)科技有限公司；無水乙醇購于成都海興化學(xué)試劑廠；1×TE緩沖液；1×TAE緩沖液；甘油購于天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；REGULAR AGAROSE G-10型瓊脂糖購于BIOWEST公司；GELVIEW 核酸染料及 DL 2000 Marker購于寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物購于上海生物工程有限公司；Master Mix購于北京擎科新業(yè)科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺購于蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱購于上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱購于江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠；AKHL-III-24艾柯超純水機(jī)（臺灣艾柯）購于成都康寧實驗專用純水設(shè)備；MLS-3020電熱自動滅菌鍋購于日本SANYO公司；Eppendorf冷凍離心機(jī)5804 R型購于Eppendorf中國有限公司；Applied Biosystems 2720購于Thermal Cycler基因有限公司；凝膠成像儀、SC-15數(shù)控超級恒溫槽購于寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6C型電泳儀購于北京六一儀器廠；PL 303電子天平購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WD 800B型微波爐購于順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；恒宇202-3-5型電熱恒溫干燥箱購于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械。

1.3 方法

1.3.1 食品樣品的采集

樣品采集時間為2016年4月至2016年9月。在成都市附近的農(nóng)貿(mào)市場及路邊小攤共采集不同生鮮食品樣品130份，樣品包括：米面制品52份，熟肉制品33份，豆制品24份，涼拌食品15份，生肉3份，奶制品3份。采集的樣品當(dāng)天送入實驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的分離與培養(yǎng)純化

所有采集樣品均在無菌條件下進(jìn)行處理。按照GB 4789.14-2014《食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》進(jìn)行檢驗。

1.3.3 細(xì)菌的16S rRNA鑒定

無菌吸取100 μL保菌液接種到TSB培養(yǎng)基中，于（37±1）℃振蕩培養(yǎng)箱恒溫活化培養(yǎng)12 h～18 h，采用 Tris-飽和酚-氯仿法提取細(xì)菌的 DNA[7]。利用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列(5'→3')為：16S-27-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)體系為20 μL，其中MIX 10 μL，超純水8.2 μL，上游引物16S-27-F 0.4μL，下游引物16S-1492-R 0.4 μL，分離菌株DNA 1 μL，空白對照組不加模板DNA，用無菌超純水水補(bǔ)足至20 μL體積。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。以TAE為電泳緩沖液，在120 V電壓，90 mA電流下，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像系統(tǒng)檢測，將剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物送往成都擎科生物公司進(jìn)行測序比對，利用BLAST確定分離菌株菌屬。

1.3.4 蠟樣芽孢桿菌攜帶看家基因和毒力基因的檢測

利用蠟樣芽孢桿菌不同的毒力基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，其中MIX 10 μL，超純水8.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，分離菌株DNA模板1 μL，空白對照組用無菌超純水補(bǔ)足至20 μL。引物序列和退火溫度及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，不同退火溫度 50 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。以TAE為電泳緩沖液，在120 V電壓，90 mA電流下對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 本研究所用的引物Table 1 The primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 食品樣品中蠟樣芽孢桿菌的分離與初步鑒定

由于蠟樣芽孢桿菌不能利用D-甘露醇，因此不產(chǎn)酸，在MYP選擇培養(yǎng)基中酚紅指示劑作用下，菌落形態(tài)為典型的粉紅色。此外，由于蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生卵磷脂酶，在MYP培養(yǎng)基中卵黃乳液作用下，會在菌落周圍產(chǎn)生2～5 mm沉淀環(huán)，菌落較大，表面比較干燥。通過形態(tài)學(xué)分析，結(jié)合16S rDNA的測序結(jié)果。本研究從成都市市售食品 130份樣品中分離得到 23株蠟樣芽孢桿菌分離菌株，檢出率為17.7%。其中，分離菌株大多數(shù)來自于肉制品、米面制品及豆制品類。具體樣品來源和樣品名稱及采樣時間詳見表2。

表2 采樣來源及采樣時間Table 2 The Sampling sources and time

2.2 蠟樣芽孢桿菌毒力基因鑒定結(jié)果

對分離的23株蠟樣芽孢桿菌菌株進(jìn)行4個管家基因 gyrB、rpoB、VrrA、groEL的檢測，結(jié)果表明 23株蠟樣芽孢桿菌分離菌株的4個管家基因gyrB、rpoB、VrrA、groEL檢出率為100%。進(jìn)一步確認(rèn)23株分離菌株為蠟樣芽孢桿菌。隨后，對以上23株分離菌株進(jìn)行毒力基因檢測，結(jié)果詳見表3，由表3可以看出：23株分離菌株中，有19株至少檢測出一種及以上的毒力基因，有4株不攜帶任何待檢的毒力基因。在13種檢測的毒力基因中，nheB和entFM在16株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為69.6%；nheA和nheC在14株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為60.9%；hblD在11株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為47.8%；cytK在10株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為43.5%；bceT在9株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為39.1%；hblA和hblC在8株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為34.8%；cer和ces在2株分離菌株中出現(xiàn)，檢出率為8.7%；未發(fā)現(xiàn)分離菌株攜帶hblB和hly-II基因。

表3 蠟樣芽孢桿菌分離菌株中毒力基因的攜帶情況Table 3 The detection results of virulence genes in Bacillus cereus food isolates

BC-16-3 - - - + - - + + + + - + - 6 BC-16-4 - - + - - - + - - - - + - 3 BC-16-5 - - - - - - + - - - - - - 1 BC-16-6 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-7 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-8 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-9 - - - + - + + + + + + + - 8 BC-16-10 - - + - - - - - + + + + - 5 BC-16-11 - - + - - - - - + + + + - 5 BC-16-12 - - + + - + + + + + + + - 9 BC-16-13 - - - + - + + + + + + + - 8 BC-16-14 + + - - - - - + + + - + - 6 BC-16-15 - - + - - + + + + + + + - 8 BC-16-16 + + - - - - - + + + - - - 5 BC-16-17 - - - - - - - + + + - + - 4 BC-16-18 - - - - - - - + + + - + - 4 BC-16-19 - - + - - - - + + - - + - 4 BC-16-20 - - + + - + + + + + + + - 9 BC-16-21 - - - - - - - - - - + - - 1 BC-16-22 - - - - - - - - - - - - - 0 BC-16-23 - - + + - + + + + - + + - 8合計 2 2 10 8 0 8 11 14 16 14 9 16 0檢出率/% 8.70 8.70 43.48 34.78 0 34.78 47.82 60.87 69.57 60.87 39.13 69.57 0

3 結(jié)論

3.1 近年來，我國各省市都有報道由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件，對各省市各類食品進(jìn)行采樣都有檢出蠟樣芽孢桿菌污染。如劉桂丹和范正軒[8]對自貢市嬰幼兒食品、水及水產(chǎn)品、乳及乳制品等進(jìn)行食源性致病微生物檢測，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌檢出率為12.70%；宋曼丹等[9]對廣東省嬰幼兒食品進(jìn)行檢測，檢出率為28.67%。劉琪等[10]對采自市場上的13個發(fā)酵豆制品進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)幾類發(fā)酵豆制品中均檢出了蠟樣芽孢桿菌，總檢出率高達(dá)84.6%。趙薇等[11]對 2011～2015年吉林省不同地區(qū)各流通環(huán)節(jié)的樣品進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌檢測，總檢出率為32.9%。本研究的采樣時間是2016年4～9月期間，共采集了成都市農(nóng)貿(mào)市場及路邊小攤的各類食品樣品130份，包括米面制品、肉制品、豆制品和奶制品等，采集的樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為17.7%。我們的結(jié)果與王君[12]對成都市食品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率20%以及田萬帆等[6]2014年從成都市農(nóng)貿(mào)市場和路邊小攤采集的食品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為24%比較接近。說明成都市售賣的各種食品中存在一定的蠟樣芽孢桿菌污染。通過進(jìn)一步對本研究檢出的蠟樣芽孢桿菌樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)米面制品及豆制品的污染情況比較嚴(yán)重，我們的結(jié)果與上述其他研究結(jié)果較為一致。蠟樣芽孢桿菌主要以孢子狀態(tài)廣泛存在于自然界和食品中，尤其是谷物等淀粉含量高的食品[13]。其他文獻(xiàn)也報道，米粉、米線、涼皮和盒飯等含有米飯或米制品的食品為蠟樣芽孢桿菌污染的主要食品種類[6,11]。在多起蠟樣芽孢桿菌食物中毒事件中，被污染的食品主要為剩米飯（44.6%）和開水泡飯（17.0%）[14]。在夏季，米飯和涼拌食品如涼面、涼皮等原料本身容易被蠟樣芽孢桿菌污染，加上長時間暴露于高溫環(huán)境中，引起食物中毒的風(fēng)險大大增加，應(yīng)當(dāng)給予重視。中國疾病預(yù)防控制中心的《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》也將米飯和米粉中的蠟樣芽孢桿菌作為重點監(jiān)測項目。

3.2 蠟樣芽孢桿菌是內(nèi)生孢子型細(xì)菌種類，可產(chǎn)生許多種毒素，最容易引起食物中毒的兩種毒素是不耐熱腸毒素（容易被熱破壞）和致吐毒素（食品被熱處理也不能滅活此毒素）[15]。本研究中，對于分離的 23株蠟樣芽孢桿菌所攜帶的毒力基因進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，嘔吐型蠟樣芽孢桿菌檢測的目的基因ces和cer檢出率較低（8.7%），僅在BC-16-14和BC-16-16中出現(xiàn)，其產(chǎn)生的致吐毒素 Cereulide在一般的食品加工過程中不能滅活，因此，還是應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。王利國[16]等研究認(rèn)為只有當(dāng)菌株含有hblA，hblC，hblD全部三個毒力基因時，該菌株才會產(chǎn)生溶血毒素 Hbl。我們的檢測結(jié)果可以看到，23株分離菌株中有7株菌株（BC-16-1、BC-16-2、BC-16-9、BC-16-12、BC-16-13、BC-16-20、BC-16-23）含有全部三個基因，說明這 7株分離菌株是可以產(chǎn)生溶血毒素 Hbl，對消費者會產(chǎn)生危害。此外，非溶血腸毒素nhe基因的檢出率較高，nheA和nheC為60.9%，nheB為69.6%，同樣能引起消費者腹瀉等不良反應(yīng)，不可忽視。李毅等[17]針對溫州地區(qū)食品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況進(jìn)行研究，檢出蠟樣芽孢桿菌39株，發(fā)現(xiàn)所有的菌株攜帶至少一個毒素基因，其中，12.8%的菌株攜帶嘔吐毒素基因并同時攜帶復(fù)合型非溶血性腸毒素nhe基因，他們的研究認(rèn)為非溶血性腸毒素nhe基因、entFM基因、bceT基因是分離菌株主要毒素基因。我們的研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)nhe，cytK，entFM和bceT基因的檢出率偏高。這些毒力基因編碼的毒素也被認(rèn)為是我國食源性蠟樣芽孢桿菌的主要毒力因子[5]。如果消費者不小心攝入了被上述蠟樣芽孢桿菌污染的食品，引起食物中毒的風(fēng)險較大，且產(chǎn)生腹瀉等不良反應(yīng)的可能性高于嘔吐等不良反應(yīng)。綜上，本實驗通過對成都市售賣食品進(jìn)行采樣，進(jìn)行了蠟樣芽胞桿菌的分離鑒定，并對其攜帶的毒力基因進(jìn)行調(diào)查，了解了成都市食品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況，獲得的數(shù)據(jù)對蠟樣芽孢桿菌引起的食品安全問題具有指導(dǎo)意義。