飼料中獸藥含量的檢測技術(shù)進展

陳沁，房克艷,，趙超敏，鄧曉軍

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

（2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

飼料（Feed）是經(jīng)工業(yè)化加工、制作的供動物食用的產(chǎn)品，包括單一飼料、添加劑預(yù)混合飼料、濃縮飼料、配合飼料和精料補充料[1]。其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響動物的生長速度和健康水平，進而影響動物性產(chǎn)品的質(zhì)量。不同類型的飼料所含有的營養(yǎng)成分的種類和含量不同，可以滿足不同種類、不同性別、不同年齡、不同生理狀態(tài)和生產(chǎn)目的的動物的生長需要；同時，為預(yù)防、治療、診斷動物疾病或有目的地調(diào)節(jié)動物生理機能，可在飼料中添加一定含量的獸藥，以促進動物的生長繁殖，降低動物的發(fā)病率和死亡率。但是，獸藥濫用現(xiàn)象也極易造成獸藥及其代謝產(chǎn)物在動物體內(nèi)蓄積，這不僅威脅人的生命健康，還會對畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境造成極大的危害。因此，嚴格控制飼料中獸藥的使用具有重要的意義。

歐盟委員會條例（EU）第37/2010號[2]，規(guī)定了641種藥理學(xué)活性認可物質(zhì)的使用規(guī)范和9種禁用獸藥。我國也在《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中列出了允許在飼料中添加的55種獸藥，并明確指出其適用對象、用法用量和休藥期[3]。允許在飼料中添加的獸藥，按照功能可分為抗球蟲藥類、驅(qū)蟲劑類、抑菌促生長類等。它們都具有代謝周期短，對動物造成的副作用小，不易在動物體內(nèi)蓄積等特點。但是動物養(yǎng)殖過程中，不合理使用飼料且不遵守食品衛(wèi)生法規(guī)和休藥期規(guī)定，而任意宰殺銷售會造成獸藥在動物性產(chǎn)品中殘留。人體攝入后，易造成代謝紊亂、功能障礙、甚至危及生命。因此，飼料中獸藥的合理和安全使用，對于動物性產(chǎn)品的安全至關(guān)重要。本文就飼料中獸藥的使用、獸藥的檢測技術(shù)及其進展進行了討論。

1 飼料中獸藥的應(yīng)用

1.1 獸藥的分類

對于體型較大的動物和大型養(yǎng)殖場來說，注射藥物具有一定難度，而且注射的位置不易把握，稍有不慎會導(dǎo)致動物癱瘓或死亡，而將獸藥添加到飼料中使用不僅會避免這些問題的發(fā)生，還可以靈活的控制獸藥的使用劑量和停藥期。目前，畜禽養(yǎng)殖和生產(chǎn)中使用的獸藥種類很多，按照來源可分為化學(xué)合成藥物、抗生素及其半合成品，按照用途可分為抗菌藥物、抗病毒藥物、抗寄生蟲藥物、動物生長促進劑以及其它用途藥物。而按照《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中允許添加的獸藥，主要分為兩類，一類是可以預(yù)防動物疾病、促進動物生長、在飼料中長期使用的飼料藥物添加劑；而另一類是以治療動物疾病為目的并按照療程服用，通過混飼給藥的藥物飼料添加劑[3]。

1.2 獸藥濫用的危害

獸藥殘留（Residues of Veterinary Drugs）：指食品動物用藥后，動物產(chǎn)品的任何食用部分中與所用獸藥有關(guān)的物質(zhì)的殘留，包括原型藥物及其代謝產(chǎn)物[4]。過量的使用獸藥或者不遵守休藥期的情況下，獸藥在體內(nèi)的蓄積量會大大增加。殘留在動物體內(nèi)的獸藥被人體攝入后，極可能導(dǎo)致急性中毒或慢性中毒，如喹噁啉類、苯丙咪唑類等獸藥有“致癌、致畸、致突變”的危險；抗生素類獸藥不僅會使敏感的人群發(fā)生過敏反應(yīng)，還會生成耐藥性強的細菌和病毒，從而使機體產(chǎn)生抗藥性，對后期疾病的治療造成困難；激素類獸藥殘留不僅會擾亂人體內(nèi)分泌、生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面的功能，還會直接危害人們的健康甚至生命[5]。另一方面，代謝不完全的獸藥，經(jīng)動物糞便進入到環(huán)境中，會對環(huán)境產(chǎn)生污染。如Wei等[6]，在華東地區(qū)采集的土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了13種獸藥，其中家禽飼養(yǎng)場的糞便是獸藥在土壤中重要的污染源之一，且指出獸藥在土壤中更容易積累，持續(xù)存在。而Bártíková等[7]的研究顯示，獸藥不僅會影響植物的生長發(fā)育，而且會和環(huán)境中的其它污染物相互作用，進而對環(huán)境產(chǎn)生更加復(fù)雜的影響。

1.3 獸藥的使用規(guī)范

我國對于飼料中獸藥使用的規(guī)定在不斷完善，從2001年農(nóng)業(yè)部頒布《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部公告第168號）以來，獸藥的使用也逐步規(guī)范化，新規(guī)定不僅在用量上要求更加嚴格，在種類上也增加了限制。農(nóng)業(yè)部第235號公告（附錄1-4）中，規(guī)定了動物性食品允許使用，且不需要制定殘留限量的獸藥；動物性食品允許使用，但需要制定殘留限量的獸藥；允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出的獸藥；以及禁止用于所有食品動物的獸藥[4]。2002年農(nóng)業(yè)部第176號和第193號公告中明確禁止了腎上腺受體激動劑、性激素、β-興奮劑類、蛋白同化激素、精神藥品和各種抗生素濾渣的使用[8,9]。2018年1月農(nóng)業(yè)部第2638號公告中提出喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等獸藥禁止在食品動物中使用[10]?？梢钥闯?，我國對于飼料中獸藥的使用要求越來越嚴格。

2 飼料中獸藥檢測的前處理技術(shù)

飼料樣品前處理過程可分為：提取、凈化、純化和濃縮四個步驟。飼料中含有大量的有助于動物生長的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等，這些物質(zhì)如果不去除不僅會損害儀器，還會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果。表1中列出了不同前處理技術(shù)在飼料樣品檢測中的應(yīng)用，樣品的前處理技術(shù)是分析檢測的重要環(huán)節(jié)，其分離純化的水平直接影響分析的準確度、靈敏度以及分析方法的重現(xiàn)性。因此，選擇合適有效的前處理技術(shù)，對飼料中獸藥含量的檢測分析是至關(guān)重要的。

2.1 提取

通常根據(jù)獸藥極性的大小，選擇合適的提取溶劑是檢測獸藥含量的重要前提，常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、丙酮、叔丁基甲醚、乙醚和乙酸乙酯等。乙腈、甲醇和丙酮容易與樣品結(jié)合，溶劑化作用和滲透能力強，粘度小，提取速度快；叔丁基甲醚、乙醚和乙酸乙酯是非水溶性極性溶劑，常用于提取脂溶性化合物。

2.2 凈化

凈化過程主要是除去蛋白質(zhì)、脂肪和其它一些小分子物質(zhì)。除蛋白質(zhì)的主要方法是加入變性劑、有機溶劑和中性鹽等，其原理是使蛋白質(zhì)變性或脫水沉淀，三氯乙酸是常用的蛋白質(zhì)沉淀劑；常用的有機溶劑包括甲醇、乙腈、丙酮和乙醇等；常用的中性鹽有飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽和磷酸鹽等。除脂的主要方法有冷凍法、化學(xué)反應(yīng)法或者有機溶劑去除法。冷凍法是根據(jù)脂肪和待測物的冷凍點不同，脂肪冷凍點低（5 ℃），而待測物冷凍點高的特性，凝固后，通過離心分離；也可以通過磺化反應(yīng)或皂化反應(yīng)的方法除脂；或者利用有機溶劑將脂肪溶解除去，常用有機溶劑為正己烷、乙醚等。

表1 飼料樣品前處理方法的應(yīng)用T a b l e 1 A p p l i c a t i o n o f p r e t r e a t m e n t m e t h o d f o r F e e d S a m p l e

2.3 純化和濃縮

2.3.1 液-液萃取技術(shù)

液-液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）又稱溶劑萃取或抽提。是利用物質(zhì)在兩種互不相溶（或微溶）的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使溶質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中的方法。該方法成本低，操作比較簡單，是提取和分離的常用方法?？股豙11]、類固醇類[12]、磺酰胺類[22]等獸藥提取和分離均可采用該方法。Valese等[23]采用該方法同時對飼料中磺酰胺類、四環(huán)素類和硝基呋喃類等62種獸藥進行提取分離。通過兩次液液萃取，首先用乙酸酸化的乙腈/水（9：1，V/V）萃取，取水相于50 ℃濃縮干燥，再用乙腈/水（7：3，V/V）和己烷進行萃取，取水相過膜即可進行檢測，最終62種獸藥中有20種可實現(xiàn)定量檢測，極大的提高了檢測效率。液-液萃取法的局限性在于選擇性較差，操作時間比較長，需要消耗大量的有機溶劑，會造成環(huán)境污染和溶劑的浪費。

2.3.2 固相萃取技術(shù)

固相萃?。⊿oild Phase Extraction，SPE）是根據(jù)填料與目標物和雜質(zhì)選擇性吸附與選擇性洗脫的原理，進行分離和濃縮的方法。主要包括活化、上樣、淋洗和洗脫四個步驟，在進行固相萃取前，樣品要進行均質(zhì)、離心等處理。常用的反相萃取柱有 C18（十八烷基硅烷鍵合硅膠柱）、C8（辛烷基硅烷鍵合硅膠柱）、HLB（Hydrophile-Lipophile-Balance，親水親油平衡柱）和CN(氰丙基柱)等；正相萃取柱主要有Silica（二氧化硅柱）和Florisil（弗羅里硅土柱）等；吸附型萃取柱包括陽離子型和陰離子型，陽離子型主要有SCX（strong cation Exchange，強陽離子交換柱）和COOH（羧基弱陽離子交換柱）等，陰離子型主要有SAX（Strong Anion Exchange，強陰離子交換）、PSA（N-丙基乙二胺）和NH2（氨基柱）等。可以根據(jù)飼料中目標化合物的性質(zhì)選擇合適的萃取小柱，將雜質(zhì)和目標化合物分開。如Patyra[24]等在檢測飼料中4種四環(huán)素類獸藥時，采用了SPE小柱凈化的方法，并比較了反相萃取柱（Stata-X、C18和HLB），吸附型弱陽離子交換柱（Strata-X-CW）和正相萃取柱（二氧化硅）的純化效果，發(fā)現(xiàn)C18的平均回收率低于75%；Stata-X和Oasis HLB的平均回收率在80%～85%之間，但基質(zhì)干擾大；Strata-X-CW 小柱的平均回收率為79.7%～98.8%，回收率高且基質(zhì)效應(yīng)低。因此，選擇了Strata-X-CW小柱作為SPE凈化小柱。陳卿卿等[25]采用堿性氧化鋁萃取柱進行純化，測定飼料中四種磺胺類獸藥，該萃取柱在酸性條件下比較穩(wěn)定，其表面的電子可與芳香環(huán)相互作用，具有很強的吸附能力。凈化后，能夠滿足高效液相色譜的檢測要求，加標回收率達到了93.6%～106.7%。

SPE的凈化效果好，萃取時間短，溶劑用量少，回收率高，可有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測的靈敏度。對于飼料中某些含量甚微的獸藥，如類固醇激素[13,26,27]、腎上腺素受體激動劑[15]等，該方法仍然適用，其回收率和精確度均能達到檢測的要求。不足之處在于，萃取步驟比較繁瑣，需要選擇合適的洗脫劑，活化時間、洗脫體積和流速要嚴格的控制，飼料基質(zhì)復(fù)雜，有時過濾比較困難，從而影響萃取效果。

2.3.3 基體分散固相萃取技術(shù)

基體分散固相萃?。╩atrix solid-phase dispersion，MSPD）是 1989年由美國路易斯安那州立大學(xué)的Barker教授提出來一種快速樣品前處理技術(shù)。該方法的原理是將涂有 C18等多種聚合物的材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物，并將其作為填料裝柱，然后用不同溶劑淋洗柱子，將各種待測物分別洗脫下來。MSPD在飼料樣品前處理中應(yīng)用比較廣泛[16～17,28]。如應(yīng)永飛[29]運用碳納米管分散固相萃取結(jié)合的方式測定飼料中β-受體激動劑和抗菌類獸藥，該方法平均回收率為80.5%，標準偏差(RSD)小于7.47%。表明該前處理方法的操作簡便、重復(fù)性和回收率均較好。Zhu等[30]建立了針對豬和雞飼料中 30種被禁用的獸藥，包括β-受體激動劑、激素和精神病藥物等的檢測方法。其中前處理采用了快速、簡單和有效的MSPD方法，30種藥物的回收率均在70.1%以上，RSD小于15.8%?；厥章屎茫异`敏度高，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)多種獸藥的檢測。該方法的優(yōu)點在于簡化了萃取的過程，將勻漿、破碎、萃取和純化這幾個步驟合并為一個過程，不僅操作簡單，溶劑用量少，還避免了樣品的損失；缺點是與待測物相似的物質(zhì)不易分離，以及取樣量小，造成檢測限相對較高。

2.3.4 QuEChERS技術(shù)

QuEChERS方法（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）是2003年由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授等開發(fā)，其原理與SPE相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中雜質(zhì)的相互作用，將雜質(zhì)吸附從而達到除雜純化的目的。具體而言，樣品經(jīng)提取劑提取后，用萃取鹽鹽析分層，根據(jù)基質(zhì)分散萃取的原理，利用吸附劑如 PSA、C18等，與雜質(zhì)結(jié)合，將雜質(zhì)吸附住，然后通過離心的方式去除雜質(zhì)。因其具有快速、簡單、環(huán)保、經(jīng)濟的優(yōu)點，因此常用于飼料中獸藥的檢測[18,19,31]。Martínez-Villalba等[32]在對飼料中抗寄生蟲類獸藥的檢測中，采用了QuEChERS的方法，最終發(fā)現(xiàn)PSA/C18（1：1）的吸附凈化效果好，回收率高（＞72%），對分析物的損失小，基質(zhì)效應(yīng)低，在0.5～10 mg/kg的濃度范圍內(nèi)線性良好，且具有處理時間短，高效、便捷等優(yōu)點。

QuEChERS方法簡單、有效，可以根據(jù)基質(zhì)及目標物的需要，改進方法，以提高檢測的提取和純化效果。Hou等[33]采用了QuEChERS方法檢測飼料中巴氯芬和加巴噴丁的含量，結(jié)果顯示：用酸化的乙腈（5%乙酸）提取，提取液濃縮干燥，再用純乙腈溶解，然后采用QuEChERS方法進行純化，比提取后直接采用QuEChERS方法純化的回收率高，且基質(zhì)效應(yīng)低，因為PSA能夠吸附樣品中的有機酸雜質(zhì)，而乙酸的存在會影響雜質(zhì)的去除，將提取液氮吹至干后，乙酸被去除，消除乙酸的干擾，提高純化效率，降低基質(zhì)效應(yīng)。但是，對于脂肪含量高的物質(zhì)，不僅會對檢測分析儀器造成很大的損失，同時也會影響QuEChERS方法的分離純化效果，且PSA價格較高，不適合大批量飼料樣品的檢測。

2.3.5 磁性固相萃取技術(shù)

磁性固相萃取（magnetic-solid phase extraction，M-SPE）技術(shù)，是21世紀建立起來的分離富集領(lǐng)域的“革命性”技術(shù)。M-SPE是以磁性或可磁化的材料作為吸附基質(zhì)的一種分散固相萃取技術(shù)。與普通的固相萃取（SPE）相比，吸附劑比較小，具有比表面積大，擴散距離短的優(yōu)點。如 Feng等[20]采用磁性有機分子印跡聚合物(MIP)復(fù)合材料作為萃取材料，萃取飼料中磺胺二甲氧辛(SDM)，平均回收率在89.3%～107.0%之間，LOD和LOQ分別為0.016 mg/kg和0.052 mg/kg。無機磁性納米顆粒通過不可逆轉(zhuǎn)共價鍵與 MIP相聯(lián)系，磁性MIP復(fù)合材料具有良好的選擇性、高粘結(jié)能力和良好的動力學(xué)性能。該方法只需要使用少量的吸附劑和較短的平衡時間就能實現(xiàn)低濃度的微量萃取，磁性材料經(jīng)處理后還能重復(fù)使用，避免了材料的浪費，利用吸附劑自身的磁性，吸附目標物質(zhì)，節(jié)省了離心和過濾的時間[34]，具有高萃取能力和萃取效率。由于飼料基質(zhì)成分復(fù)雜，加上磁性納米材料比較昂貴，因此，在這方面的應(yīng)用較少。

2.3.6 在線固相萃取

近年來，為滿足快速、高精確度和高靈敏度的檢測要求，在固相萃取的基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了在線固相萃取技術(shù)（Online-solid phase extraction，Online-SPE）。Online-SPE是離線SPE的全自動在線實現(xiàn)方式，不僅大大節(jié)省了時間和操作的步驟，而且還減少了人為操作的誤差，實現(xiàn)分離、純化和進樣全自動。在線固相萃取與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，能夠提高分析的通量，分析的靈敏度、精確度和速度。如吳劍平等[35]采用反相在線固相萃取柱在線富集純化，以0.2%甲酸水與乙腈梯度洗脫，同時轉(zhuǎn)移至C18色譜柱上進行分離，測定了飼料中 5種喹噁啉獸藥殘留量，該方法的檢出限（LOD）為25 μg/kg，定量限(LOQ)為50 μg/kg；回收率為72.6%～84.6%，批內(nèi)和批間RSD值均小于10%，精確度高，重復(fù)性好。Kantiani等[21]等采用在線固相萃取實現(xiàn)了飼料中青霉素類、頭孢菌素類和磺胺類三類共18種抗菌類獸藥的純化和分離。并比較了在線固相萃取和離線固相萃取兩種前處理方法，前者的LOD在0.09～2.12 μg/kg范圍內(nèi)，后者的LOD在0.12～3.94μg/kg范圍內(nèi)，前者檢測的靈敏度略有提高。該方法的優(yōu)點是實現(xiàn)樣品的快速和自動化分離純化，減少操作，實現(xiàn)高通量分析和高準確度的檢測；缺點是需要高比例的有機相的洗脫液引入分析柱，會造成有機溶劑的浪費，加上其設(shè)備比較昂貴，目前在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用還不是特別廣泛。

3 飼料中獸藥檢測技術(shù)

良好的前處理技術(shù)結(jié)合高靈敏度的檢測方法，才能獲得良好的檢測結(jié)果。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展和對飼料中獸藥研究的進一步深入，檢測方法也在不斷的進步，從薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜法、高效毛細管電泳、電化學(xué)分析法等一些最先出現(xiàn)的檢測方法，到后期不斷涌現(xiàn)的一些高通量、高靈敏度、高精確度的檢測技術(shù)，如高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和其它的高新檢測方法等。飼料中獸藥檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，能夠更好的控制飼料質(zhì)量，促進畜禽健康成長，從而讓人們吃到放心的動物性產(chǎn)品。

3.1 薄層色譜法

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。該方法在對于飼料中獸藥的檢測由來已久，雖然只能粗略的定量，但是其設(shè)備簡單，檢測成本低。如王小鶯等[36]運用于該方法對飼料中恩拉霉素進行定性檢測，方法可靠，可快速得出結(jié)果。Weng等[37]對飼料中四環(huán)素、金霉素和土霉素等進行檢測，定量限分別為40 mg/g、200 mg/g、100 mg/g。其優(yōu)點是可在短時間內(nèi)檢測大量樣品，且溶劑的使用量小。但是這種方法操作比較繁瑣，不能準確進行定量，檢測靈敏度低，僅可作為定性篩選方法。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進行定量檢測。其可實現(xiàn)大量樣品的集中檢測，在飼料獸藥檢測中應(yīng)用比較廣泛，鹽酸克倫特羅、磺胺類、四環(huán)素類和氯霉素類等的檢測均有ELISA試劑盒，操作簡單，使用方便。王仁華等[38]運用ELISA法測定飼料中沙丁胺醇，其線性相關(guān)系數(shù)為0.993，平均回收率達90%以上。Wang等[39]等用ELISA分析方法檢測飼料中的苯二氮卓類藥物，檢測范圍在25.2～55.4 μg/kg，加標回收率為70.9～111.3%，RSD小于15.0%。ELISA法具有選擇性好、特異性強、檢測時間短、測定方便等優(yōu)點；缺點是影響因素多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3.3 氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜方法(Gas Chromatography，GC)是利用氣體作流動相的色層分離分析方法。該方法分離效率高，能分離、分析很復(fù)雜的混合物或性質(zhì)極近似的物質(zhì)(如同系物、異構(gòu)體等)。雖然相同物質(zhì)具有相同保留值的色譜峰，但是不一定相同保留時間的色譜峰都是一種物質(zhì)。所以，為了更好地對色譜峰進行定性分析，常采用其它手段來定性。如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)，其主要用于復(fù)雜化合物的分離與鑒定，氣相色譜和質(zhì)譜的結(jié)合，不僅彌補了氣相色譜法只憑保留時間難以對復(fù)雜化合物中未知組分做出可靠定性鑒定的缺點，而且具有高分辨能力、高靈敏度和分析過程簡便快速的特點。陳培榮等[40]在檢測飼料中硝基咪唑類獸藥時就是采用了 GC-MS的方法，通過色譜分離，LOD在0.20～0.63 ng/kg之間，且批內(nèi)與批間的 RSD均小于15%，靈敏度和穩(wěn)定性良好。適用于揮發(fā)性較好的物質(zhì)的檢測，能降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，重復(fù)性好，準確度高，且GC-MS方法有相應(yīng)的質(zhì)譜庫，可根據(jù)待測物與質(zhì)譜庫物質(zhì)的匹配程度對未知化合物進行定性。但是，由于GC-MS分析樣品時必須經(jīng)過氣化，檢測難揮發(fā)的物質(zhì)時需要衍生化，操作繁瑣、耗時。因此，該方法不適用于沸點高于 450℃的難揮發(fā)物質(zhì)和熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。

3.4 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)分離分析的液相分離方法。如Jing等[41]成功的分離了飼料中五種抗生素（四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素、替米考星和泰樂菌素），遷移時間和峰面積的日內(nèi)RSD分別小于0.2%和1.4%，而日間的 RSD則分別低于 0.4%和 3.5%；LOD分別為 0.5 mg/kg、1 mg/kg、1 mg/kg、1 mg/kg和1mg/kg，具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和可靠性。而Wang等[42]用該方法測定豬飼料中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的含量，檢測限分別達到了1.1 μg/kg和1.5 μg/kg，且平均富集系數(shù)達到124倍以上。Nguyen等[43]則開發(fā)了一種廉價，堅固且易于使用的便攜式毛細管電泳儀，用它來檢測飼料中β-激動劑，基于其方便，易于操作，易于清洗的特點，所以在應(yīng)用現(xiàn)場和實驗室中均適用。但是，它在實現(xiàn)微量樣品測定的同時，也對前處理提出了高要求，微量的樣品使檢測產(chǎn)生誤差的幾率增高。

3.5 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析方法是建立在物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上的一類儀器分析方法，主要有電位分析法、電質(zhì)量分析法、庫侖分析法、伏安分析法等。它是飼料中獸藥含量測定的一種重要的檢測方法，其操作簡單，重復(fù)性好，檢測成本低，所需時間短。如 Waris等[44]采用選擇性電化學(xué)方法測定飼料中的洛克沙胂。結(jié)果顯示，RSD＜2.0%，重復(fù)性良好；LOD和 LOQ分別為0.53 μmol/L和1.76 μmol/L。對洛克沙胂檢測不存在明顯的表面鈍化，表明修飾電極適用于洛克沙胂的檢測。電化學(xué)方法的優(yōu)點在于、穩(wěn)定性好、經(jīng)濟有效；缺點是它的選擇性比較差，其檢測限相對較高，因此，對于飼料這一基質(zhì)的檢測應(yīng)用相對較少。

3.6 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）是以液體作為流動相的檢測方法，因其高效、高速、高靈敏度的特點，得到了廣泛的應(yīng)用[45,46]。如Yang等[47]采用高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）測定豬，雞和魚飼料中的氟苯尼考（FF），并建立了一種有效的純化方法，該方法在0.05～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性相關(guān)性（R＞0.9999），日間和日內(nèi)RSD均小于9.3%，重復(fù)性良好。LOD和LOQ分別為：豬飼料0.02 mg/kg和0.06 mg/kg，雞飼料0.02 mg/kg和0.07 mg/kg，魚飼料0.02 mg/kg和0.05 mg/kg。而Kim等[48]則利用該方法測定飼料中16種磺胺類獸藥，發(fā)現(xiàn)16種化合物能夠在46 min內(nèi)實現(xiàn)分離，并且具有良好的分辨率和對稱的峰值；線性相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.999；LOD值范圍為 14.1～45.0 μg/L，而 LOQ 值在 46.9～150 μg/L之間；日內(nèi)RSD＜5.5%，日間的RSD＜4.0%。以上結(jié)果表明該方法具有良好的選擇性、線性、靈敏度和可靠性，適用于動物飼料中獸藥的分析與檢測，且該方法簡單、經(jīng)濟、可靠，有可接受的特異性和精確度。HPLC方法的優(yōu)點是選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單，而且可與不同靈敏度、選擇性和線性范圍的檢測器連接，靈活度高，應(yīng)用性強，分離和凈化效果好；缺點是受基質(zhì)影響大，對前處理要求比較嚴格。

3.7 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

隨著質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS)成為飼料中獸藥含量檢測以及獸藥殘留分析的重要手段。由于其既具備了液相色譜的分離功能，又包含了質(zhì)譜的準確定性定量功能，提高了檢測的選擇性和靈敏度，同時也避免了假陽性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。如李延山[49]和張麗等[50]，分別利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)建立了飼料中硫酸黏桿菌素和異噻唑啉酮的測定方法，能夠準確進行定量，檢測結(jié)果良好。而Valese等[51]開發(fā)并驗證了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中 62種獸藥的方法。結(jié)果表明，該方法變異系數(shù)CV（coefficient of variation，CV）均小于16%，低于最大可接受值（20%），LOQ小于50 μg/kg，LOD小于40 μg/kg，表明該方法的重復(fù)性良好，檢測限低，適用于多種獸藥同時檢測。該方法前處理相對簡單，不需要進行衍生化，具有靈敏度高，檢出限低的優(yōu)點。

高效液相色譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS/MS）的分辨率更高，能夠?qū)旌衔镞M行選擇性分析，適合化學(xué)穩(wěn)定性差且含量較低的獸藥的檢測，是目前最常用的檢測方法。如魏云計等[52]采用 HPLC-MS/MS方法測定了飼料中的硝基咪唑類獸藥及其代謝物殘留，針對每種分析物優(yōu)化了儀器的MS/MS參數(shù)，色譜分離只需要12 min，大大的提高了檢測效率。而Gavilán等[53]采用 HPLC-MS/MS的方法測定飼料中四種四環(huán)素類獸藥，發(fā)現(xiàn)HPLC-MS/MS在50～500 mg/kg的濃度范圍內(nèi)的可準確定量，回收率在84%～109%之間，RSD在12%～16%之間。該方法的準確度高，重復(fù)性好，具有良好的回收率和線性范圍，可進行大批量樣品的檢測分析。

相比液相色譜的方法，超高液相色譜的靈敏度更高，可以滿足更低含量的物質(zhì)的檢測和鑒定。如李洪波等[54]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的恩諾沙星和喹乙醇的含量，該方法靈敏度高，選擇性好，恩諾沙星和喹乙醇的線性關(guān)系在5～100 μg/L范圍內(nèi)良好，R值均大于0.998，批內(nèi)、批間的RSD均小于20%，是一種行之有效的檢測方法；而張偉等[55]則建立一種畜禽飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法的LOD為0.1 μg/kg，LOQ為0.3 μg/kg，三個加標水平的平均回收率在81.41%～112.88%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度分別在1.24%～12.92%和0.64%～13.09%范圍內(nèi)，適用于飼料中氯霉素類獸藥的定性和定量。該方法高效、快速、節(jié)省時間，節(jié)省流動相，大大地提高了效率，可實現(xiàn)樣品的快速分離。

此外，隨著高分辨率質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜（high-resolution quadrupole time-of-flight mass，HPLC-QTOF-MS）方法以及超高效液相色譜串聯(lián)組合型四級桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-Q-Exactive mass，UPLC-Q-Exactive-MS）方法也逐漸被應(yīng)用于飼料中獸藥的檢測之中。如Amelin等[56]采用HPLC-QTOF-MS的方法測定飼料中的四環(huán)素、磺胺類、喹諾酮類、驅(qū)腸蟲劑、硝基呋喃類獸藥，結(jié)果顯示，RSD值≤15%；LOD和LOQ分別在0.0005～100 ng/mL和0.003～250 ng/mL范圍內(nèi)。該方法重復(fù)性好，檢出限低，靈敏度高。由于儀器檢出限低，提取物的稀釋度高，所以基質(zhì)效應(yīng)也相應(yīng)的降低了，進而提高了檢測的靈敏度。LC-TOF/MS技術(shù)通過高分辨來去除基質(zhì)干擾，能有效鑒別質(zhì)量數(shù)非常接近的化合物，可以快速、高通量篩查目標物或未知化合物超標的樣品，但由于線性范圍的局限性，TOF/MS技術(shù)的定量效果不如HPLC-MS/MS。 而 Solliec等[57]運 用UPLC-Q-Exactive-MS的方法檢測飼料中四環(huán)素類獸藥，結(jié)果表明，其線性范圍（R2＞0.991）和重復(fù)性（RSD＜15%）均良好，LOD在1.5～3.6 ng/g范圍內(nèi)。具有良好的準確度和靈敏度，其能夠同時定性和量高分辨下所有碎片離子的精確質(zhì)量信息，但是儀器設(shè)備比較昂貴，檢測成本高。

液質(zhì)聯(lián)用的方法靈敏度高，檢出限低，在定性方面表現(xiàn)良好，不僅適合大分子物質(zhì)的檢測，也適合痕量和超痕量物質(zhì)的檢測，且對測試組分的熱穩(wěn)定性沒有特殊要求，能夠滿足快速、高效的需求；缺點是易受到樣品基質(zhì)的干擾，對前處理要求高，而且此類設(shè)備一般比較昂貴，檢測成本相對較高，目前國內(nèi)正在逐步普及，相應(yīng)的標準方法也在進一步制定完善。

4 總結(jié)

我國是飼料產(chǎn)業(yè)大國，飼料的種類多，產(chǎn)量大，對于飼料品質(zhì)的把握存在一定的挑戰(zhàn)性，迫切需要完善現(xiàn)有技術(shù)，探究前沿技術(shù)，為畜禽產(chǎn)品的安全把好關(guān)。目前存在獸藥品種多樣，應(yīng)用廣泛，在不同獸藥的檢測方法上存在差異；精確、快速、高通量的檢測方法相對較少；飼料中雜質(zhì)含量較多，前處理過程復(fù)雜，操作繁瑣；以及對檢測方法的靈敏度和準確度要求不斷提高等一系列問題。因此，優(yōu)化飼料中獸藥檢測的前處理方法，簡化前處理的操作過程，縮短前處理的時間，提高純化效果；利用新技術(shù)、新手段研究出高通量的快速檢測方法，提高檢測效率；同時加大力度研究具有潛力的檢測技術(shù)是飼料中獸藥檢測需要克服的難題。