維甲酸對(duì)皮膚角阮細(xì)胞水孔蛋白通道3表達(dá)的影響

維甲酸對(duì)皮膚角阮細(xì)胞水孔蛋白通道3表達(dá)的影響

陳建華

(江西中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室，江西撫州344000)

摘要〔〕目的探討維甲酸類(lèi)藥物對(duì)表皮角阮細(xì)胞中水孔蛋白通道(AQP)3表達(dá)的影響。方法異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林處理角朊細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型(HaCaT)，采用免疫組化、RT-PCR、Western印跡分子生物學(xué)方法檢測(cè)不同濃度(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)、不同作用時(shí)間(0、6、12、24、48 h)及不同干預(yù)因素下對(duì)HaCaT中AQP3含量的變化。結(jié)果①濃度為0.010 mg/ml時(shí)，三組HaCaT中AQP3的表達(dá)均高于其他濃度(P<0.05)；②0.010 mg/ml濃度的異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林作用12 h，三組HaCaT中AQP3的表達(dá)異維A酸組>阿維A組>阿達(dá)帕林組，組間比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論維甲酸可調(diào)節(jié)HaCaT中AQP3的表達(dá)，0.010 mg/ml濃度的異維A酸組12 h的時(shí)候?qū)aCaT中AQP3表達(dá)的上調(diào)作用最明顯。

關(guān)鍵詞〔〕水孔蛋白通道3；維甲酸；角阮細(xì)胞；表皮細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R39〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：陳建華(1972-)，男，主治醫(yī)師，講師，主要從事解剖組織學(xué)研究。

維甲酸類(lèi)藥物屬維生素A的衍生物，現(xiàn)已廣泛用于多種異常角化、增殖性皮膚病及抗衰老、抗氧化等美容方面的治療，臨床療效確切〔1〕。但其一個(gè)非常明顯且不可避免的副作用就是皮膚黏膜干燥、脫屑、皸裂，以補(bǔ)充水分、保濕劑等一般處理不能緩解，眾多患者因不能耐受中斷治療，失去治愈疾病的機(jī)會(huì)〔2〕。水孔蛋白(AQPs)是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜上組成孔道，可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出。在人體內(nèi)目前發(fā)現(xiàn)已有AQPs11種，不僅存在于腦室膜、心臟、肺泡、膽道系統(tǒng)、腎臟、晶狀體內(nèi)囊、外分泌腺上皮細(xì)胞等和水、金屬鹽代謝有關(guān)的器官、組織，也存在于表皮的角阮細(xì)胞胞膜〔3，4〕。已有文獻(xiàn)證實(shí)AQP3對(duì)于皮膚屏障功能的恢復(fù)起著重要的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)AQP3的表達(dá)及功能變化，可以從一定程度上改善皮膚水分含量減少以及改善干燥性的皮膚病〔5~7〕。維甲酸引起皮膚黏膜干燥的副作用是否與AQP3的表達(dá)有關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)研究。本文研究維甲酸對(duì)人源角朊細(xì)胞(HaCaT)AQP3表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑、細(xì)胞與儀器HaCaT(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，含血清的完全培養(yǎng)基及不含血清培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，免疫組化試劑盒(武漢博士德)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)，含EDTA的胰酶(美國(guó)GIBCO公司)，一抗：AQP3兔單克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)。異維A酸(商品名為泰爾絲，上海信誼延安藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、阿維A(商品名為方希，重慶華邦制藥有限公司)、阿達(dá)帕林藥品(商品名為達(dá)芙文，法國(guó)高德美國(guó)際公司生產(chǎn))，以上3種藥物10 ml內(nèi)含所含成分為40 mg、20 mg、400 mg。細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)，培養(yǎng)箱(美國(guó)Queue systems)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)(德國(guó)BiofugeStratos)，轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106以上的時(shí)候進(jìn)行傳代，清洗培養(yǎng)基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞回縮即終止消化，加入同體積的有血清培養(yǎng)基，吹打，10 000 r/min離心5 min，棄上清，取細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.3分組及加藥待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至4×106，分別予以不同濃度異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)，不同作用時(shí)間(0、6、12、24、48 h)給藥刺激。

1.4免疫組化方法采用SP檢測(cè)法，切片脫蠟，加入3%過(guò)氧化氫封閉阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，50 μl非免疫動(dòng)物血清封閉，加50 μlAQP3一抗過(guò)夜，50 μl生物素標(biāo)記第二抗體，辣根過(guò)氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠固封。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞胞質(zhì)胞膜在倒置顯微鏡下出現(xiàn)深棕黃色的染色。

1.5半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法取HaCaT細(xì)胞定量100 mg，提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取20 μl作為反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl以及18 S RNA和AQP3的引物共同組成。反應(yīng)過(guò)程按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR步驟進(jìn)行：首先預(yù)變性的反應(yīng)條件為95℃、5 min，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減，共進(jìn)行30次的循環(huán)。接著對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)拍攝電泳圖像對(duì)所得到的電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選擇18 SRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對(duì)得到的半定量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)量化的吸光度積分值進(jìn)行分析(A值)。

1.6Western印跡方法取HaCaT細(xì)胞提取100 mg總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加AQP3一抗(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h。ECL光化學(xué)法顯色，用彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-wallisH檢驗(yàn)及Mann-whitneyU檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1免疫組化法檢測(cè)AQP3表達(dá)未加藥刺激的HaCaT細(xì)胞AQP3主要在表皮基底層表達(dá)，且染色強(qiáng)度較弱。異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林刺激HaCaT細(xì)胞后AQP3幾乎在基底層到棘層的全部區(qū)域都有分布，且染色強(qiáng)度較強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1　免疫組化法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞AQP3表達(dá)(DAB，×200)

2.2異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林對(duì)HaCaT細(xì)胞中AQP3 mRNA表達(dá)的影響不同濃度異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林作用24 h時(shí)，0.010 mg/ml濃度時(shí)，HaCaT細(xì)胞中AQP3 mRNA的表達(dá)值高于其他濃度表達(dá)值，組間比較差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。HaCaT細(xì)胞在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林培養(yǎng)液中分別孵育6、12、24、48 h，結(jié)果顯示HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA 表達(dá)在6 h開(kāi)始增加，在12 h達(dá)到峰值，AQP3 mRNA的表達(dá)異維A酸組>阿維A組>阿達(dá)帕林組，組間差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。HaCaT細(xì)胞在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林培養(yǎng)液中分別孵育6、12、24、48 h，結(jié)果顯示HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA 表達(dá)在6 h開(kāi)始增加，在12 h達(dá)到峰值，AQP3 mRNA的表達(dá)異維A酸組>阿維A組>阿達(dá)帕林組，組間差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林作用24 h對(duì)AQP3蛋白表達(dá)的影響不同濃度的異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林作用HaCaT細(xì)胞后的AQP3蛋白表達(dá)情況比較，濃度為0.010 mg/ml時(shí)，三組HaCaT中AQP3的表達(dá)均高于其他濃度，(P<0.05)，見(jiàn)表3。比較HaCaT在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達(dá)帕林培養(yǎng)液中分別孵育6、12、24、48 h，結(jié)果顯示HaCaT中AQP3蛋白表達(dá)在6 h開(kāi)始增加，在12 h達(dá)到峰值(P<0.05)，三組HaCaT中AQP3的表達(dá)異維A酸組>阿維A組>阿達(dá)帕林組，組間比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表4。

給藥濃度(mg/ml)異維A酸組阿維A組阿達(dá)帕林組0.0000.82±0.311)0.72±0.261)0.72±0.291)0.0011.12±0.561)1.10±0.291)1.03±0.331)0.0101.70±0.561.56±0.451.45±0.440.0601.16±0.691)1.22±0.361)1.05±0.421)0.1000.68±0.231)0.87±0.311)0.98±0.261)

與0.010 mg/ml濃度比較：1)P<0.05

給藥時(shí)間(h)異維A酸組阿維A組阿達(dá)帕林組00.79±0.281)0.70±0.241)0.66±0.251)61.10±0.541)1.08±0.271)1.01±0.311)121.45±0.561.31±0.431.31±0.42241.14±0.471)1.20±0.311)1.03±0.391)480.66±0.221)0.85±0.291)0.96±0.241)

與12 h組比較：1)P<0.05

給藥濃度(mg/ml)AQP3蛋白表達(dá)水平異維A酸組阿維A組阿達(dá)帕林組0.0001.39±0.561)1.72±0.861)1.76±0.861)0.0011.52±0.721)1.98±0.761)1.99±1.231)0.0103.23±1.992.56±1.862.45±1.220.0601.96±0.861)1.99±0.861)1.76±0.961)0.1001.23±0.731)1.59±0.851)1.69±0.951)

與0.010 mg/ml濃度比較：1)P<0.05

給藥時(shí)間(h)異維A酸組阿維A組阿達(dá)帕林組01.92±0.861)1.70±0.981)1.65±0.871)62.03±1.061)1.88±0.271)1.85±0.851)122.65±1.232.21±0.982.04±1.21241.96±1.021)1.86±0.851)1.86±0.891)481.66±0.961)1.84±0.811)1.65±0.731)

與12 h組比較：1)P<0.05

3討論

維甲酸是目前在皮膚科廣泛應(yīng)用的一類(lèi)藥物，具有多種的藥理活性，其可以通過(guò)抑制角質(zhì)細(xì)胞的異常增殖和分化，同時(shí)促進(jìn)正常的角質(zhì)化進(jìn)程〔8，9〕。另外該藥物還可以通過(guò)中性粒細(xì)胞的趨化作用記憶溶酶體的釋放作用，抑制皮脂腺的分化，具有抗炎作用，臨床上多用外用維甲酸類(lèi)藥物治療痤瘡、抗角質(zhì)化皮膚等，臨床上使用該藥物已取得了確切的療效〔10，11〕。但有一個(gè)不可回避的問(wèn)題就是該類(lèi)藥物的主要副作用可以導(dǎo)致皮膚黏膜的干燥，通常一般的補(bǔ)水方法很難緩解，很多患者都因?yàn)闊o(wú)法耐受藥物的副作用自行的停藥，終止治療。

水通道蛋白是幾年來(lái)不斷被人們認(rèn)識(shí)的一類(lèi)水特異性的膜蛋白，自從1988年發(fā)現(xiàn)AQP1以來(lái)，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種該類(lèi)型的水通道蛋白，1994年發(fā)現(xiàn)了AQP3可對(duì)甘油等物質(zhì)具有通透性，對(duì)水通道蛋白認(rèn)識(shí)又更進(jìn)了一步〔12，13〕。AQP3的高通透性，不僅僅可以運(yùn)送水分還可以將內(nèi)源性的甘油和皮脂腺中的甘油三酯帶到表皮中，從而參與表皮細(xì)胞的甘油代謝工作〔14〕。

研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)維甲酸刺激后，AQP3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，這與皮膚的透皮失水的原理相同，AQP3表達(dá)上調(diào)，使皮膚屏障被破壞，細(xì)胞處于高滲的狀態(tài)，導(dǎo)致皮膚干燥等副作用的發(fā)生。同時(shí)我們還觀察到，隨著濃度的增加，達(dá)到一個(gè)峰值后AQP3表達(dá)又會(huì)隨之下調(diào)，可能的原因考慮與藥物的濃度過(guò)高以及作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，濃度的升高以及作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)外藥物不能充分代謝，導(dǎo)致滲透壓的改變，當(dāng)滲透壓過(guò)大的時(shí)候細(xì)胞的結(jié)構(gòu)就會(huì)受到破壞，甚至?xí)霈F(xiàn)細(xì)胞膜的溶解，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡〔15〕。從維甲酸的藥理作用及本研究結(jié)果上看，該藥不僅具有抗炎作用，同時(shí)還可以促進(jìn)表皮細(xì)胞HaCaT中AQP3的表達(dá)，以發(fā)揮其修復(fù)皮膚黏膜屏障的功能〔16〕。因此在臨床的使用中應(yīng)該把握好藥物的劑量及藥物的使用時(shí)間，不能一味追求高劑量和長(zhǎng)期使用，以減少藥物的副作用，達(dá)到維持維甲酸的最佳治療效果。我們要做的是確保體內(nèi)體外的調(diào)節(jié)一致性，由于我們所做的是體外實(shí)驗(yàn)，并沒(méi)有考慮到體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境對(duì)藥物的調(diào)節(jié)作用，藥物濃度的把握需要我們進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)對(duì)角朊細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型(HaCaT)AQP3 表達(dá)及甲酸類(lèi)藥物干預(yù)作用的研究，我們認(rèn)為AQP3的表達(dá)與藥物的干預(yù)的關(guān)系緊密，接下來(lái)需要進(jìn)一步深入探討AQP3在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)M疾病治療作用，可以進(jìn)一步闡明該類(lèi)藥物治療的作用機(jī)制與途徑，為臨床治療提供理論依據(jù)和治療方案。

4參考文獻(xiàn)

1Stiebel-Kalish H，Eyal S，Steiner I.The role of aquaporin-1 in idiopathic and drug-induced intracranial hypertension〔J〕.Med Hypotheses，2013；81(6)：1059-62.

2Matsunaga N，Itcho K，Hamamura K，etal.24-hour rhythm of aquaporin-3 function in the epidermis is regulated by molecular clocks〔J〕.J Investi Dermatol，2014;134(6)：1636-44.

3劉芳芬.水通道蛋白3與人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的機(jī)制研究〔D〕.長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2013.

4王滬凱.維甲酸藥物對(duì)皮膚病的治療探討〔J〕.中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2012；3(1)：24-5.

5Chaudhuri RK，Bojanowski K.Bakuchiol：a retinol-like functional compound revealed by gene expression profiling and clinically proven to have anti-aging effects〔J〕.Int J Cosmetic Sci,2014；36(3)：221-30.

6徐之涵.新型維甲酸類(lèi)化合物的合成和生物活性測(cè)試〔D〕.東華大學(xué)，2014.

7Choudhary V，Olala LO，Qin H，etal.Aquaporin-3 re-expression induces differentiation in a phospholipase d2-dependent manner in aquaporin-3-knockout mouse keratinocytes〔J〕.J Invest Dermatol，2015；135(2)：499-507.

8何傳果.硝酸銀對(duì)角朊細(xì)胞增殖的作用〔D〕.遵義：遵義醫(yī)學(xué)院，2013.

9Sakamoto Y，Hisatsune A，Katsuki H，etal.Aquaporin 5 increases keratinocyte-derived chemokine expression and NF-kappaB activity through ERK activation〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2014；448(4)：355-60.

10Wu Z，Uchi H，Morino-Koga S，etal.Resveratrol inhibition of human keratinocyte proliferation via SIRT1/ARNT/ERK dependent downregulation of aquaporin 3〔J〕.J Dermatol Sci,2014;75(1)：16-23.

11Poveda M，Hashimoto S，Enokiya Y，etal.Expression and localization of aqua-glyceroporins AQP3 and AQP9 in rat oral epithelia〔J〕.Bull Tokyo Dent Coll,2014;55(1)：1-10.

12Blaydon DC，Kelsell DP.Defective channels lead to an impaired skin barrier〔J〕.J Sci，2014；127(Pt 20)：4343-50.

13Melnik BC.The potential role of impaired notch signalling in atopic dermatitis〔J〕.Acta dermato-venereologica，2015；95(1)：5-11.

14徐之涵，潘燊，黃焰根.新型維甲酸類(lèi)化合物的合成及生物活性研究〔J〕.有機(jī)化學(xué)，2014；7(12)：1391-8.

15楊娟，張錫寶.維甲酸受體及其作用機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.皮膚性病診療學(xué)雜志，2014；5(3)：423-6.

16Sugiyama Y，Yamazaki K，Kusaka-Kikushima A，etal.Analysis of aquaporin 9 expression in human epidermis and cultured keratinocytes〔J〕.FEBS,2014；4(5)：611-6.

〔2013-12-09修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)