全反式維甲酸對5/6腎大部切除大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及其作用機(jī)制

劉　霞　馬紅萍

(1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室　南通　226001)

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全反式維甲酸對5/6腎大部切除大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及其作用機(jī)制

劉霞1馬紅萍2△

(1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,2機(jī)能實(shí)驗(yàn)室南通226001)

【摘要】目的探討全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA)對5/6腎大部切除 (5/6 nephrectomy,5/6Nx) 大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制。方法成年雄性SD 大鼠行5/6Nx后2周分為3組:5/6Nx組 (大豆油1 mL·kg-1·d-1,n=11)、 atRA1 組 (atRA 5 mg·kg-1·d-1,n=10)、atRA2組 (atRA 10 mg·kg-1·d-1,n=11),另設(shè)Sham組即假手術(shù)組 (大豆油1 mL·kg-1·d-1,n=7)。經(jīng)灌胃給藥,每日1次,連續(xù)給藥12 周。測定24 h尿蛋白量和血肌酐濃度;腎臟病理切片采用VG染色,對腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)行評分;用Western blot檢測腎皮質(zhì)中α平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)和纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果術(shù)后14 周,atRA顯著降低5/6Nx大鼠的24 h尿蛋白量和血肌酐濃度 (P均<0.05)。atRA顯著降低該模型的腎小管間質(zhì)纖維化 (P<0.01)。atRA顯著下調(diào)該模型的腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1表達(dá) (P均<0.05),腎小管間質(zhì)纖維化評分與α-SMA和PAI-1表達(dá)均呈顯著正相關(guān) (r分別為0.717 6和0.809 8,P均<0.01)。結(jié)論atRA可減少5/6Nx大鼠的尿蛋白水平,抑制腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1的蛋白表達(dá),從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

【關(guān)鍵詞】維甲酸;腎切除術(shù);腎小管間質(zhì)纖維化;α平滑肌肌動(dòng)蛋白;纖溶酶原激活物抑制劑1

*This work was supported by the General Program of College Natural Science Research Foundation of Jiangsu Province (11KJD310001) and the Application Research Project of Nantong City (BK2014035).

腎小管間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同通路[1],其病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)成分 (extracellular matrix,ECM)過多沉積于腎小管間質(zhì)。ECM積聚是由ECM合成增多和/或ECM降解減少引起。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA時(shí),肌成纖維細(xì)胞特征而大量合成分泌ECM[2]。 纖溶酶原激活物抑制劑 1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是纖溶酶原激活物 (plasminogen activator,PA)的抑制劑,通過抑制PA對纖溶酶原的激活,抑制ECM降解,促進(jìn)ECM積聚[3]。研究表明PAI-1參與了腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展[4]。維甲酸是維生素A的衍生物,包括全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA),9-順式維甲酸和13-順式維甲酸。維甲酸具有抗增生和抗炎癥作用,能抑制腎纖維化,保護(hù)腎結(jié)構(gòu)和功能[5-10],但其抗纖維化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究以大鼠5/6腎大部切除(5/6 nephrectomy,5/6Nx)為模型,觀察atRA對腎功能、腎小管間質(zhì)纖維化及腎臟α-SMA和PAI-1表達(dá)的影響,并進(jìn)一步探討atRA 的腎保護(hù)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

主要試劑atRA購自上海市第六制藥有限公司,抗α-SMA抗體購自美國Sigma公司,抗PAI-1抗體購自美國BD公司,抗β-actin 抗體購自美國Santa Cruz公司,化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

大鼠5/6Nx模型的建立雄性SD大鼠(250～330 g)購自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。術(shù)前腹腔注射30%水合氯醛 (300 mg/kg)麻醉,經(jīng)背部左側(cè)切口暴露左腎,分離腎動(dòng)脈左上支和中支并結(jié)扎,使左腎梗死約2/3,同時(shí)摘除右腎。假手術(shù)組(Sham組)大鼠僅分離左腎動(dòng)脈分支,不予結(jié)扎,摘除右腎。

動(dòng)物分組及給藥術(shù)后2周,根據(jù)血肌酐水平的升高確定造模成功后將大鼠分成3組:5/6Nx模型組(n=11)用大豆油1 mL·kg-1·d-1灌胃;低劑量 atRA 組 (atRA1,n=10)用atRA 5 mg·kg-1·d-1灌胃;高劑量atRA 組 (atRA2,n=11)用atRA 10 mg·kg-1·d-1灌胃。另設(shè)Sham組(n=7)用大豆油1 mL·kg-1·d-1灌胃。避光條件下每天新鮮配制atRA的豆油懸浮液。術(shù)后2周起開始喂藥,連續(xù)給藥12周。 Lv等[11]報(bào)道，5和10 mg·kg-1·d-1的atRA能顯著緩解自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化,幾乎無毒性作用;而30～60 mg·kg-1·d-1的atRA具有顯著降低大鼠體重等不良反應(yīng),故本研究選用5和10 mg·kg-1·d-1這兩個(gè)atRA劑量。

腎功能檢測將每只大鼠單獨(dú)地放在代謝籠中,留取24 h尿并量取總體積,在此期間大鼠自由飲水、進(jìn)食。24 h后取尾血,采用自動(dòng)生化測定儀測定血肌酐濃度和尿蛋白濃度,計(jì)算24 h尿蛋白總量。

腎小管間質(zhì)纖維化評分取腎臟組織矢狀切面約2 mm,常規(guī)石蠟包埋,切片厚度為4μm,VG染色。顯微鏡下高倍視野 (×400)拍照,每只大鼠選擇至少20個(gè)高倍視野,采用CellSens Dimension軟件 (日本Olympus公司)測定腎小管間質(zhì)纖維化面積占總面積的百分比,作為腎小管間質(zhì)纖維化評分。

Western blot檢測腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1的蛋白表達(dá)水平腎皮質(zhì)組織于液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱。取腎皮質(zhì)100 mg,加入1 mL組織裂解液,于冰水中勻漿。4 ℃下12 000×g離心10 min,取上清,用BCA法測定蛋白濃度。 取30μg總蛋白,加入相應(yīng)量的5×SDS凝膠加樣緩沖液,制備1×SDS緩沖液,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)印上蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。然后置于一抗工作液中,4 ℃過夜。洗膜,接著加入相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,室溫放置1 h。洗膜,加入化學(xué)發(fā)光試劑作用5 min,將PVDF膜置于暗盒中,X光片感光。用Smart viewer 軟件 (上海復(fù)日科技公司)對蛋白條帶進(jìn)行定量。

結(jié)果

atRA對5/6Nx大鼠24h尿蛋白量的作用4組術(shù)前24h尿蛋白量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。 術(shù)后14 周,5/6Nx組的24h尿蛋白量顯著高于Sham組 (P<0.01)。與 5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的24h尿蛋白量顯著下降 (P<0.05)。atRA1組的尿蛋白水平比較atRA2組更低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

atRA對5/6Nx大鼠血肌酐濃度的作用4組術(shù)前血肌酐濃度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。術(shù)后14周,5/6Nx組的血肌酐濃度顯著高于Sham組 (P<0.01)。與 5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的血肌酐濃度顯著下降 (P<0.05)。atRA1組的血肌酐濃度較atRA2組更低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

atRA對5/6Nx大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的作用腎組織切片VG染色(圖3)顯示:5/6Nx組腎小管間質(zhì)纖維化評分顯著高于Sham組(P<0.01)。與5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的腎小管間質(zhì)纖維化評分顯著下降 (P<0.01),但無劑量依賴性。

圖1atRA對5/6Nx大鼠尿蛋白的作用

Fig1EffectofatRAonurinaryalbuminexcretionintheratswith5/6Nx

圖2atRA對5/6腎大部切除大鼠血肌酐濃度的作用

Fig2EffectofatRAonserumcreatinineintheratswith5/6Nx

atRA對5/6Nx大鼠腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)的作用5/6Nx組腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)顯著高于Sham組 (P均<0.05,圖4)。 與5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)顯著下降 (P均<0.05),且呈現(xiàn)劑量依賴性,atRA2組腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)較atRA1組下降更明顯 (P均<0.05)。腎小管間質(zhì)纖維化評分與α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)均呈顯著正相關(guān) (r分別為0.717 6和0.809 8,P均<0.01,圖5)。

圖3atRA對5/6Nx大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的作用

Fig3EffectofatRAonrenaltubulointerstitialfibrosisintheratswith5/6Nx

討論

腎小管間質(zhì)纖維化是腎衰竭的主要病理基礎(chǔ),腎小管間質(zhì)損害比腎小球病變更能反映腎臟疾病的預(yù)后[12]。本研究以5/6Nx大鼠為模型,并用atRA處理,atRA能降低該模型的腎小管間質(zhì)纖維化程度,與其降低24 h尿蛋白量和下調(diào)腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1蛋白表達(dá)有關(guān)。

蛋白尿是腎臟濾過屏障功能障礙的重要特征。腎小球足細(xì)胞是腎臟濾過屏障的主要成分,其足突和裂孔膜是防止血漿白蛋白濾過的最后一道關(guān)鍵屏障。大多數(shù)的蛋白尿疾病與腎小球足細(xì)胞的足突消失和/或裂孔膜的破壞有關(guān)。原尿中大量蛋白逸出至腎小管管腔,引起腎小管間質(zhì)損傷和纖維化[13],所以蛋白尿不僅是反映腎功能損傷的指標(biāo),也是導(dǎo)致腎疾病進(jìn)展的直接病理因素。atRA能顯著降低5/6Nx大鼠的24 h尿蛋白水平。atRA在體內(nèi)和體外均能上調(diào)足細(xì)胞的裂孔膜相關(guān)蛋白podocin和nephrin的表達(dá),從而發(fā)揮抗蛋白尿作用[7-8]。因?yàn)榈鞍啄蚴悄I臟疾病進(jìn)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素,所以atRA的抗蛋白尿作用是其改善腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制之一。

圖4atRA對5/6Nx大鼠腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1表達(dá)的作用

Fig4EffectsofatRAonα-SMAandPAI-1expressionsintherenalcortexofratswith5/6Nx

纖維化是由ECM合成過多和/或降解減少從而ECM過多沉積造成的。正常腎臟中α-SMA的表達(dá)僅見于腎臟血管中層的平滑肌細(xì)胞。若腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)α-SMA,則標(biāo)志著它們被激活,獲得了肌成纖維細(xì)胞特征,增殖活躍且ECM合成分泌顯著增加[2]。我們觀察到5/6Nx組腎皮質(zhì)α-SMA蛋白水平顯著高于Sham組,atRA能顯著降低α-SMA蛋白表達(dá);腎小管間質(zhì)纖維化程度與α-SMA表達(dá)呈顯著正相關(guān)。 5/6Nx大鼠模型中除發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化外,腎小球硬化也存在,所以該模型腎臟中增加的α-SMA不僅來源于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞,也來源于腎小球系膜細(xì)胞。atRA對腎小管間質(zhì)和腎小球中α-SMA表達(dá)的影響可通過免疫組化來區(qū)分。atRA可通過直接抑制肌成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá)來改善腎小管間質(zhì)纖維化。肌成纖維細(xì)胞增殖活躍,atRA具有抗增殖特性,所以atRA可能通過抑制肌成纖維細(xì)胞的增殖來降低α-SMA表達(dá),從而降低ECM合成。atRA也可能通過抑制單個(gè)肌成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá),從而抑制單個(gè)細(xì)胞水平上的ECM合成。 因?yàn)閃en等[14]觀察到atRA的一種同型異構(gòu)體——9-順式維甲酸能抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá),而不影響細(xì)胞數(shù)目。

A:α-SMA (r=0.7176,P<0.01);B:PAI-1 (r=0.8098,P<0.01).

圖5腎小管間質(zhì)纖維化評分與α-SMA和PAI-1表達(dá)的相關(guān)性

Fig 5Correlation between renal tubulointerstitial fibrosis score and α-SMA and PAI-1 expressions

纖維化不僅可由ECM合成增加造成,也可由ECM降解減少引起。ECM主要由基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)和纖溶酶來降解[3]。纖溶酶可直接降解ECM,也可通過活化MMP來降解ECM。PAI-1作為組織型纖溶酶原激活物 (tissue-type plasminogen activator,tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活物 (urokinase-type plasminogen activator,uPA)的抑制劑,抑制PA對纖溶酶原的激活,從而抑制ECM降解,促進(jìn)ECM積聚。正常腎組織中PAI-1表達(dá)很低;腎損傷時(shí)其表達(dá)顯著增高[4]。過表達(dá)PAI-1的小鼠器官纖維化比野生型小鼠嚴(yán)重[15-16],而PAI-1基因敲除后器官纖維化減輕[15,17-18]。我們觀察到,與Sham組比較,5/6Nx組腎皮質(zhì)PAI-1表達(dá)增加,atRA顯著下調(diào)PAI-1表達(dá);腎小管間質(zhì)纖維化程度與PAI-1表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示atRA可通過減少PAI-1表達(dá)降解ECM,從而緩解腎小管間質(zhì)纖維化。 atRA可直接抑制肌成纖維細(xì)胞的PAI-1表達(dá),我們曾報(bào)道atRA能直接抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞PAI-1和ECM表達(dá)纖維連接蛋白[19]。

atRA對5/6Nx大鼠腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1表達(dá)的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性;而在降低尿蛋白和血肌酐的作用方面,5 mg·kg-1·d-1atRA比10 mg·kg-1·d-1atRA更具優(yōu)勢,這可能是由較高劑量atRA的毒性作用和不良反應(yīng)引起的,包括高脂血癥和肝功能損害等[20],具有劑量依賴性。本研究選用較低劑量的atRA(5和10 mg·kg-1·d-1),在保證有效的同時(shí)盡量減少毒性作用和不良反應(yīng),但10 mg·kg-1·d-1的atRA仍能輕微升高血中三酰甘油水平,而5 mg·kg-1·d-1的atRA則無此不良反應(yīng)[11]。本研究中2個(gè)劑量的atRA對腎間質(zhì)纖維化的抑制作用未表現(xiàn)出劑量依賴性,這可能是由于較高劑量atRA的非特異性不良反應(yīng)削弱了其特異性腎保護(hù)作用。

綜上所述,atRA能有效降低5/6Nx大鼠的尿蛋白水平,能有效抑制腎皮質(zhì)α-SMA和PAI-1表達(dá),減少ECM合成,同時(shí)促進(jìn)ECM降解,從而改善腎小管間質(zhì)纖維化和腎功能。

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Effect of all-trans retinoic acid on renal tubulointerstitial fibrosisin the rats with 5/6 nephrectomy and its mechanisms

LIU Xia1, MA Hong-ping2△

(1DepartmentofPathophysiology,2FunctionalLaboratory,MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,JiangsuProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of all-trans retinoic acid (atRA) on renal tubulointerstitial fibrosis in the rats with 5/6 nephrectomy and the involved mechanisms.MethodsAdult male SD rats underwent 5/6 nephrectomy (5/6Nx).Two weeks later,nephrectomized rats were divided into 3 groups:5/6Nx group (soybean oil of 1 mL·kg-1·d-1,n=11),atRA1 group (atRA of 5 mg·kg-1·d-1,n=10) and atRA2 group (atRA of 10 mg·kg-1·d-1,n=11).Sham group (soybean oil,1 mL·kg-1·d-1,n=7) served as a nomal control.Rats were treated by intragastric gavage once a day for 12 weeks. Serum creatinine concentration and 24 hours urinary albumin excretion were measured.The renal tubulointerstitial fibrosis was scored on renal sections with VG staining.The expression levels of α-smooth muscle actin (α-SMA) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in renal cortex were examined by Western blot.ResultsTreatment of atRA decreased the elevated levels of urinary albumin excretion and serum creatinine concentration in 5/6 nephrectomized rats at 14 weeks after operation (all P<0.05).Renal tubulointerstitial fibrosis score in rats with 5/6 nephrectomy was markedly decreased after atRA administration (P<0.01).The increases in expressions of α-SMA and PAI-1 in renal cortex in rats with 5/6 nephrectomy were significantly downregulated by atRA treatment (all P<0.05).Renal tubulointerstitial fibrosis score correlated well with the expression of α-SMA (r=0.7176,P<0.01) or with that of PAI-1 (r=0.8098,P<0.01).ConclusionsTreatment with atRA ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis in rats with 5/6 nephrectomy by decreasing both proteinuria and protein expressions of α-SMA and PAI-1 in renal cortex.【Key words】retinoic acid;nephrectomy;renal tubulointerstitial fibrosis;α-smooth muscle actin;plasminogen activator inhibitor-1

【中圖分類號】Q 491.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.005

(收稿日期:2015-04-20;編輯:段佳)

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目 (11KJD310001);南通市應(yīng)用研究計(jì)劃 (BK2014035)

△Corresponding authorE-mail:mahp@ntu.edu.cn