維甲酸對高氧環(huán)境下原代培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制

潘琦琦 馬金帥 劉秀香 呂朦

[摘要] 目的 探討維甲酸（RA）對高氧環(huán)境下原代培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）損傷的保護(hù)機(jī)制。 方法 分離、純化孕19 d的胎鼠肺組織，得到肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至亞匯合（約占瓶底80%以上時(shí)）將細(xì)胞分為空氣組、高氧組、高氧+RA組，其中高氧+RA組加入含有10-6 mol/L的RA?？諝饨M置于空氣中培養(yǎng);高氧組與高氧+RA組置于37℃、95% O2 - 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，用測氧儀檢測培養(yǎng)皿中的氧濃度。采用流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinV-PI雙標(biāo)記）檢測AECⅡ凋亡，Western blot檢測Wnt通路中β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)，PCR檢測β-catenin基因的表達(dá)。 結(jié)果 高氧組暴露24 h，AnnexinV （+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標(biāo)記的AECⅡ數(shù)較空氣組及高氧+RA組均顯著升高（P < 0.01）;與空氣組比較，高氧組β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與高氧組比較，高氧+RA組則上調(diào)高氧暴露β-catenin蛋白的表達(dá)（P < 0.01）。 結(jié)論 高氧環(huán)境下可導(dǎo)致AECⅡ大量凋亡、壞死;RA通過上調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)，降低AECⅡ壞死、凋亡，從而對高氧肺損傷起到保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 維甲酸;高氧;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞;β-catenin蛋白

[中圖分類號] R563 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate protective mechanism of retinoic acid on primary cultured alveolar type Ⅱ epithelial cells under hyperoxia. Methods Alveolar type Ⅱ epithelial cells were isolated and purified from fetal rat lung tissue at 19 days of gestation. When the cells grew to the fused state （80% bottle bottom）， the cells were divided into air group， hyperoxia group and hyperoxygenation + RA group. The apoptosis of AECⅡ was detected by flow cytometry， the β-catenin protein expression of Wnt signal pathway was detected by Western blot， and the β-catenin gene expression was detected by PCR. Results Compared with the air group and the hyperoxygenation + RA group， the AECⅡ number of AnnexinV （+） PI （-） and AnnexinV （+） PI （+） markers in the hyperoxia group was significantly higher at 24 h of exposure （P < 0.01）， and the cell number was significantly reduced after RA addition. Compared with the air group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxia group was significantly decreased， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while compared with the high oxygen group， the expression of β-catenin protein of the hyperoxygenation + RA group was upregulated significantly （P < 0.01）. Conclusion Hyperaerobic environment can lead to massive apoptosis and necrosis of AECⅡ， and RA can reduce apoptosis of this cell by up-regulating the expression of β-catenin protein， thus playing a protective role in hyperoxic lung injury.

[Key words] Retinoic Acid; High oxygen; Type Ⅱ alveolar epithelial cell; β-catenin protein

肺泡上皮細(xì)胞包括Ⅰ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial type Ⅰ cells，AECⅠ）及Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial type Ⅱ cells，AECⅡ）。AECⅠ主要進(jìn)行氣體交換，AECⅡ主要分泌肺表面活性物質(zhì)，且在高氧環(huán)境下AECⅡ具有分裂、增殖并分化為AECⅠ的潛能，故具有修復(fù)受損傷上皮的作用[1-3]。新生兒呼吸窘迫綜合征，又稱新生兒肺透明膜病，主要是由于缺乏肺泡表面活性物質(zhì)所引起的呼吸困難。氧療是目前治療新生兒呼吸窘迫綜合征的主要措施[4]。但長期的氧療，特別是高氧環(huán)境下會影響水通道蛋白[5-6]及視網(wǎng)膜受體表達(dá)[7]，從而引起肺水腫及視力障礙等。如果我們在氧療中加入某種藥物減輕高氧導(dǎo)致的損傷，將能有效地提高一些新生兒、早產(chǎn)兒的生存率。95%高濃度氧是研究高氧肺損傷中常用的濃度[8]。

Wnt經(jīng)典信號通路包括 Wnt 配體蛋白、細(xì)胞膜上的受體、細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子、細(xì)胞漿內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分等[9]。大量研究結(jié)果表明，此通路活化的關(guān)鍵是胞漿中是否存在穩(wěn)定的β-catenin[10]。早期的研究證實(shí)，β-catenin可以表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞[11]，敲出β-catenin可導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育停滯[12]，說明Wnt/β-catenin通路參與了胚胎發(fā)育及肺泡的形成。其中Wnt7b信號分子廣泛分布于AECⅡ表面，可與受體結(jié)合，抑制胞核內(nèi)“破壞復(fù)合體”的解體，使得β-catenin 在胞內(nèi)聚集引起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控組織的穩(wěn)定、細(xì)胞分化、能量代謝、干細(xì)胞維持以及損傷修復(fù)等生物學(xué)效應(yīng)[13-14]。維甲酸是維生素A在生物體內(nèi)的重要活性形式，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡，是肺發(fā)育、修復(fù)的重要物質(zhì)，可以預(yù)防早產(chǎn)兒的各種并發(fā)癥[15]。胎兒時(shí)期，氣管-支氣管細(xì)胞中的維生素A酶可以促進(jìn)維生素A轉(zhuǎn)化成維甲酸（RA），存儲于ACEⅠ及AECⅡ中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、轉(zhuǎn)化、凋亡[16]。可調(diào)控IGF受體的表達(dá)，進(jìn)而修復(fù)損傷的肺組織。然而，RA是否能對高氧引起的肺損傷起保護(hù)作用及是否與Wnt信號通路相關(guān)尚不清楚，本研究以孕19 d的胎鼠為研究對象，探討了Wnt通路中的關(guān)鍵因子β-catenin的表達(dá)情況，并為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級成熟健康SD大鼠[山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（魯）2013-0019]，雌鼠（230～260 g）12只，雄鼠（280～330 g）6只。于晚上19：00～20：00，以雌雄比例1∶1合籠，次日7：30～8：00查見陰栓或者行陰道涂片檢查，若在顯微鏡下看到精子，記為孕0 d，飼養(yǎng)至孕19 d進(jìn)行AECⅡ的提取。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司，生產(chǎn)批號：AD16191267）;Ⅳ型膠原酶（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）、Hank′s平衡鹽溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20170107）、Ig G包被干粉（Sigma公司）;RNA提取、反轉(zhuǎn)定量試劑盒（TaKaRa公司，生產(chǎn)批號：20180112）;兔抗大鼠β-actin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔（北京中杉金橋技術(shù)有限公司）;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物;生產(chǎn)批號：20170410）。

1.2 方法

1.2.1 AECⅡ原代培養(yǎng) ?用4%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉孕19 d的SD孕鼠。將孕鼠置于鼠臺，75%酒精消毒，剖開腹腔，取出含有孕鼠的子宮，盡量去除肺組織的氣管、支氣管及血管，剪碎肺組織至1 mm3，于預(yù)冷的Hank′s平衡鹽溶液中反復(fù)清洗，至液體清亮。用0.1%胰酶、0.1% Ⅳ型膠原酶消化肺組織至膠凍狀，F(xiàn)BS終止消化后，100目篩網(wǎng)過濾，經(jīng)差速離心、差速貼壁和免疫黏附純化方法獲得AECⅡ。將提取的細(xì)胞置于37℃ 5% CO2-95% O2培養(yǎng)中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 ?將細(xì)胞接種在96孔板上，24 h待細(xì)胞生長至80%亞融合狀態(tài)時(shí)，將細(xì)胞分成對照組和不同濃度RA組（10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12、24、48 h后，加入含0.5/L MTT的培養(yǎng)基，每孔于酶標(biāo)儀570 m波長處檢測每孔吸光度。分別計(jì)算出不同濃度RA作用下細(xì)胞的增值及活力情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 ?原代AECⅡ生長至80%融合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞換液，并分為三組：空氣組、高氧組、高氧+RA組。其中高氧+RA組加入有終濃度為10- 6 mol/L的RA，余兩組不予特殊處理。高氧組與高氧+RA組置于37℃ 95%O2-5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。其中高氧組在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)均用CYS-1數(shù)字式測氧儀檢測培養(yǎng)皿中的氧濃度，氧濃度低于90%的樣品棄去。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測AECⅡ細(xì)胞凋亡 ?培養(yǎng)細(xì)胞至24 h后分別取空氣組、高氧組、高氧+RA組各1瓶，用配制的0.1%的胰酶消化細(xì)胞，經(jīng)離心、PBS洗細(xì)胞、AnnexinV-PI雙染色后進(jìn)行進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果分析：左下象限代表正常細(xì)胞[AnnexinV（-）PI（-）]，左上象限代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞[（AnnexinV（-）PI（+）]，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞[（AnnexinV（+）PI（-）]，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞[（AnnexinV（+）PI（+）]。

1.2.5 Western blot檢測AECⅡ中β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá) ?首先按照蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白;其次測定蛋白濃度，根據(jù)所測定的蛋白濃度，取各組變性后的蛋白 60 μg上樣，經(jīng)過跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入兔抗鼠β-catenin多克隆抗體，4℃孵育過夜。37℃復(fù)溫30 min、TBST洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，最后發(fā)光底液曝光。用Image J軟件分析，計(jì)算β-catenin/β-actin比值，以分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AECⅡ中β-catenin的mRNA含量 ?提取RNA，用酶標(biāo)儀用酶標(biāo)儀檢測波長為280 nm處和260 nm處的吸光值。OD260值為RNA濃度，OD260/OD280值為RNA的純度。引物的設(shè)計(jì)合成由生物工程（上海）股份有限公司提供，見表1。經(jīng)提取RNA→溶解RNA→純度分析→反轉(zhuǎn)為cDNA→反轉(zhuǎn)錄→PCR反應(yīng)：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次。以β-actin為內(nèi)參基因，比較Ct法檢測各樣本的mRNA 表達(dá)情況，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt =ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察AECⅡ形態(tài)變化

AECⅡ培養(yǎng)24 h，貼壁良好，細(xì)胞團(tuán)呈島狀分布，可見明顯細(xì)胞核及核仁，折光性好。高氧組及高氧+RA組出現(xiàn)貼壁不牢，懸浮細(xì)胞增多，折光性下降，胞內(nèi)可見明顯空泡。尤以高氧組明顯。見圖1

2.2 不同濃度RA對原代AECⅡ細(xì)胞的作用

MTT法確定RA濃度。經(jīng)單因素方差分析示10-5～10-8 mol/LRA對細(xì)胞各點(diǎn)無明顯的抑制作用，在48 h，RA對細(xì)胞的增值作用顯著（P < 0.01）。其中，在24 h時(shí)，10-6 mol/L RA具有明顯的促增值作用;在48 h，促增值作用最大在10-7 mol/L。因此選擇10-6 mmol/L作為干預(yù)條件。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測AECⅡ的凋亡

采用AnnexinV-PI雙染進(jìn)行流式結(jié)果分析表明，高氧組暴露24 h，AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標(biāo)記的AECⅡ數(shù)高于空氣組及高氧+RA組（P < 0.05）。表明RA可明顯抑制高氧環(huán)境下AECⅡ凋亡。見圖3。

2.4 Western blot檢測各組AECⅡ中β-catenin蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示空氣組細(xì)胞內(nèi)可檢測到β-catenin蛋白表達(dá)，三組AECⅡ中β-catenin蛋白的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 115.44，P < 0.01），且與空氣組比較，高氧暴露組β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P < 0.01），高氧+RA組與高氧組比較，β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。證明RA可促進(jìn)高氧組ACEⅡ中β-catenin蛋白的表達(dá)。見圖4

2.5 PCR檢測AECⅡ中β-catenin mRNA的含量

結(jié)果顯示空氣組細(xì)胞內(nèi)可檢測到β-catenin的mRNA表達(dá)，三組AECⅡ中β-catenin mRNA的含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 325，P < 0.01）;與空氣組比較，高氧組β-catenin mRNA水平明顯降低（P < 0.01），高氧+RA組與高氧組比較，β-catenin mRNA水平較高氧組有所升高（P < 0.05）。證明RA可促進(jìn)高氧組 ACEⅡ中β-catenin mRNA的表達(dá)。見圖5。

與空氣組比較，*P < 0.01;與高氧組比較，#P < 0.05

3 討論

經(jīng)典Wnt信號通路與肺發(fā)育關(guān)系最為密切，其對β-catenin濃度的調(diào)控處于中心位置[10]。而β-catenin的濃度受Axin/GSK-3/APC復(fù)合體的調(diào)控，當(dāng)無Wnt配體存在時(shí)，胞質(zhì)中的Axin復(fù)合體處于穩(wěn)定狀態(tài)，復(fù)合體泛素化后被蛋白酶體降解，導(dǎo)致胞質(zhì)中的β-catenin維持在較低濃度。相反，當(dāng)Wnt配體激活后，Axin復(fù)合體解聚，胞漿內(nèi)β-catenin不斷積累從而處于高濃度[17]。Wnt信號通路的激活在調(diào)控肺損傷修復(fù)中起關(guān)鍵性的作用[11-12]。

高氧可產(chǎn)生較多氧自由基，產(chǎn)生肺部炎癥，從而造成細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空氣組比較，高氧暴露下AnnexinV（+）PI（-）和AnnexinV（+）PI（+）標(biāo)記的AECⅡ數(shù)明顯升高，而加入合適濃度的RA組，細(xì)胞凋亡數(shù)量少于高氧組，說明高氧可加快細(xì)胞凋亡，RA可對AECⅡ可起到保護(hù)作用。而RA對細(xì)胞起保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確，本研究對細(xì)胞中的β-catenin的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以在正常組表達(dá)，其適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)會促進(jìn)肺細(xì)胞發(fā)育[18-20];在高氧組中蛋白表達(dá)明顯降低，而RA+高氧組的蛋白表達(dá)量介于其余兩組之間，表明RA可以通過調(diào)控該蛋白對高氧環(huán)境下AECⅡ起到抗氧化作用，而β-catenin信號分子是Wnt通路中的核心因子[10]，表明RA可能通過激活Wnt通路，引起β-catenin在細(xì)胞中積累升高，從而減少肺組織的損傷。同樣條件下，采用PCR技術(shù)檢測β-catenin的基因水平，高氧組β-catenin mRNA水平明顯降低，而RA+高氧組的基因表達(dá)高于高氧之間，進(jìn)一步表明了RA可能通過Wnt通路拮抗高氧所致的肺損傷。

綜上所述，RA可對高氧引起的肺損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活Wnt配體，上調(diào)β-catenin濃度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了RA的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用RA預(yù)防高氧肺損傷奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?馬金帥，劉秀香，楊建英，等.Wnt7b/β-catenin信號通路分子在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的變化[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（10）：1332-1335，1341.

[2] ?Rozak AS，Lam AP，Russell S，et al. Beta-catenin/T-cell factor signaling is activated during lung injury and promotes the survival and migration of alveolar epithelial cells [J]. J Biol Chem，2010，285（5）：3157-3167.

[3] ?Fiaturi N，Russo JW，Nielsen HC. CCN5 in alveolar epithelial proliferation and differentiation during neonatal lung oxygen injury [J]. Cell Commun Signal，2018，12（1）：217-229.DOI：10.1007/s12079-017-0443-1

[4] ?董欣鑫.神經(jīng)肽P物質(zhì)對95%氧致AECⅡ細(xì)胞損傷的氧化抗氧化作用及Wnt信號通路的相關(guān)研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2013.

[5] ?Xu S，Xue X，You K. Caveolin-1 regulates the expression of tight junction proteins during hyperoxia-induced pulmonary epithelial barrier breakdown [J]. Respir Res，2016， 17（1）：50.

[6] ?Zhang QY，F(xiàn)u JH. Expression and function of aquaporin-1 in hyperoxia-exposed alveolar epithelial type Ⅱ cells [J]. Exp Ther Med，2014，8（2）：493-498.

[7] ?Chen HJ. Effect of Hyperoxia on Retinoid Metabolism and Retinoid Receptor Expression in the Lungs of Newborn Mice [J]. PLoS One，2015，10（10）：e0140343.

[8] ?Stenger MR， Rose MJ， Joshi MS，et al. Inhaled nitric oxide prevents 3-nitrotyrosine formation in the lungs of neonatal mice exposed to>95% oxygen [J]. Lung，2010，188（3）：217-227.

[9] ?Paul S，Dey A. Wnt signaling and cancer development：therapeutic im ?plication [J]. Neo Plasma，2008，55（3）：165-176.

[10] ?Wang S，Dang H，Xu F，et al. The Wnt7b/β-catenin signaling pathway is involved in the protective action of calcitonin gene-related peptide on hyperoxia-induced lung injury in premature rats [J]. Cell Mol Biol Lett，2018， 23：4.

[11] ?Tebar M，Destrée O，de Vree WJ. Expression of Tcf/Lef and sFrp and localization of beta-catenin in the developing mouse lung [J]. Mech Dev，2001，109（2）：437-440.

[12] ?Huelsken J，Vogel R，Brinkmann V，et al. Requirement for beta-catenin in anterior-posterior axis formation in mice [J]. Cell Biol，2000，148（3）：567-578.

[13] ?Rajagopal J，Carroll TJ，Guseh JS，et al. Wnt7b stimulates embryonic lung growth by coordinately increasing the replication of epithelium and mesenchyme [J]. Development（Cambridge，England），2008，135（9）：1625-1634.

[14] ?Pongracz JE，Stoekley RA. Wnt signaling in lung development and diseases [J]. Respir Res，2006，7：15.

[15] ?李文斌，常立文，容志惠，等.維甲酸通過MAPKs信號通路減輕早產(chǎn)大鼠AECⅡ高氧性損傷[J].中國病理生理雜志，2008，24（1）：1-6.

[16] ?高瑞偉.RA及IL-24對胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的影響[D].濱州：醫(yī)學(xué)院濱州醫(yī)學(xué)院，2015.

[17] ?趙鵬.高氧暴露對新生大鼠肺組織中VEGF、β-catenin、DKK-1蛋白表達(dá)的影響[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2016.

[18] ?潘麗.β-catenin在高氧致新生鼠BPD中的作用及其機(jī)制的研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2009.

[19] ?De Langhe SP.Wnt signaling in lung organogenesis [J]. Organogenesis，2008，4（2）：100-108.

[20] ?Cohen JC，Larson JE，Killeen E，et al. CFTR and Wnt/beta-catenin signaling in lung development [J]. BMC Dev Biol，2008，8：70.DOI：10.1186/1471-213X-8-70

（收稿日期：2018-07-16 ?本文編輯：任 ? 念）