骨碎補(bǔ)醇提物對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松模型的影響

趙興亞+錢海兵

摘要：目的 研究骨碎補(bǔ)醇提物對(duì)用維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松模型的影響。方法 采用維甲酸灌胃造成小鼠實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松癥模型，同時(shí)灌胃低、中、高3種計(jì)量的骨碎補(bǔ)醇提物，14 d后測(cè)定血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶的活性（TRAP）的活性，以及血清中骨鈣素（BGP）和雌二醇（E2）的含量。結(jié)果 維甲酸可引起小鼠骨質(zhì)疏松，骨碎補(bǔ)醇提物可升高E2的數(shù)值，同時(shí)降低堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨鈣素的水平。結(jié)論 骨碎補(bǔ)醇提物對(duì)于維甲酸造成的骨質(zhì)疏松癥模型有一定的預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞：骨碎補(bǔ)醇提物；維甲酸；骨質(zhì)疏松；小鼠

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)異常為特征，致使骨骼脆性增加、極易發(fā)生骨折的一種全身性代謝性骨骼系統(tǒng)疾病[1]，隨著人口老齡化的持續(xù)發(fā)展，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率目前在常見(jiàn)疾病和多發(fā)病中居于第七位，已經(jīng)嚴(yán)重影響中老年人群的健康生活，臨床上西藥治療骨質(zhì)疏松的藥物并不多，且大多治療靶點(diǎn)過(guò)于單一，毒副作用較強(qiáng)[2]。我國(guó)是中藥大國(guó)，擁有豐富的中草藥資源，且中藥治療骨質(zhì)疏松也已有上千年歷史，中藥具有療效明顯、價(jià)格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，必定會(huì)成為研究防治骨質(zhì)疏松癥的新渠道和新方向。

骨碎補(bǔ)為水龍骨科多年生蕨類植物槲蕨 Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根莖，其性溫、味苦具有補(bǔ)腎活血、止血續(xù)傷等功效，為骨科常用藥[3]。近代的藥理學(xué)研究也表明骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用[4]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)醇提物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化以及礦化[5-6]，從而起到防治骨質(zhì)疏松的作用。目前，單純研究骨碎補(bǔ)醇提物對(duì)骨質(zhì)疏松癥影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量骨碎補(bǔ)醇提物對(duì)維甲酸致骨質(zhì)疏松小鼠的影響，從而探尋其可能產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 昆明種小鼠6～8 周齡，體重（25±5） g，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0001。

1.2藥物及試劑 骨碎補(bǔ)藥材及其提取液制備：骨碎補(bǔ)購(gòu)自北京同仁堂（貴陽(yáng)藥店），經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院王祥培副教授鑒定。取骨碎補(bǔ)藥材粉末3 kg，12倍量75%乙醇回流提取3次，濾過(guò)合并濾液，減壓回收至干，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)加 0.5% CMC-Na 配成所需濃度（30、60、120 mg/kg）的灌胃劑（HPLC測(cè)得柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74%），制備完畢后置4℃保存?zhèn)溆肹7]。全反式維甲酸（retinoicacid，RA，山東良福制藥有限公司，純度為101.4%）；維生素D3注射液（VD3，上海通用藥業(yè)股份有限公司）；鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；骨鈣素（BGP）、雌二醇（E2）放免試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3儀器 BT815A型半自動(dòng)生化分析儀（上海三科儀器有限公司）；SN 695型放射免疫計(jì)數(shù)器（上海日環(huán)儀器廠）。

1.4分組及造模 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半，分別為空白組、模型組、骨碎補(bǔ)醇提物低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥VD 3組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件一致，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，于每日上午空白組灌純凈水外，其余各組小鼠均灌胃給予RA 90 mg/kg，連續(xù)14 d。在造模的同時(shí)，VD 3組及骨碎補(bǔ)醇提物各劑量組每天下午給予不同濃度的受試藥。各組給藥容積均為0.02 ml/g，給藥期間隔天稱量體重以調(diào)整給藥量。停藥次日，小鼠摘眼球取血。

1.5檢測(cè)指標(biāo) 血清生化及相關(guān)激素指標(biāo)：血清鈣、磷、ALP、TRAP檢測(cè)步驟均按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清BGP、E2含量用放射免疫法測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各項(xiàng)參數(shù)均表示為（x±s），采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1對(duì)血液生化指標(biāo)的影響 同空白組比較，模型組血鈣水平下降，用藥后血鈣水平可見(jiàn)升高，但與模型組比較無(wú)顯著性差異；模型組s-P，s-ALP，s-TRAP顯著升高（P<0.05），骨碎補(bǔ)醇提物的中劑量和高劑量組與模型組相比顯著降低（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)表1。

2.2對(duì)骨代謝相關(guān)激素水平的影響 模型組小鼠s-BGP水平明顯高于空白組（P<0.05），而VD3組及骨碎補(bǔ)醇提物各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白組比較，模型組s-E2水平下降，骨碎補(bǔ)醇提物各劑量組使體內(nèi)s-E2水平上升，特別是骨碎補(bǔ)醇提物的高劑量組升高明顯（P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

骨代謝和骨轉(zhuǎn)換的過(guò)程是成骨細(xì)胞形成新骨和破骨細(xì)胞吸收舊骨的過(guò)程。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥正是由于骨重建單位中骨形成與骨吸收這一平衡被破壞而產(chǎn)生的[8]。用維甲酸誘導(dǎo)所致的小鼠骨質(zhì)疏松模型在發(fā)病的癥狀以及對(duì)雌激素的骨反應(yīng)上都與人類有較好的相似性，是研究骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)較好的造模方法[9]。VD3被公認(rèn)為目前預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的一線藥物。在本次實(shí)驗(yàn)中可以看到VD3并不能顯著提高小鼠體內(nèi)雌激素水平，說(shuō)明其防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制可能與激素?zé)o關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠s-ALP及s-TRAP水平均明顯升高，這表明維甲酸既可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，又可以增加破骨細(xì)胞的骨吸收，造成高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥。應(yīng)用骨碎補(bǔ)醇提物，特別是骨碎補(bǔ)醇提物高劑量組可顯著降低小鼠血清ALP及TRAP含量，提示該藥可在一定范圍內(nèi)可抑制骨吸收，減少骨丟失。另外，與空白組比較，模型組血鈣降低而血磷升高，則進(jìn)一步說(shuō)明維甲酸誘導(dǎo)骨代謝活躍、骨轉(zhuǎn)換率升高。而各給藥組血鈣、血磷逐步趨于正常，這可能與藥物促進(jìn)胃腸道對(duì)鈣磷的吸收有關(guān)。骨鈣素（BGP）水平增高，多見(jiàn)于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥[10]。本實(shí)驗(yàn)造模后小鼠呈高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，給小鼠灌服骨碎補(bǔ)醇提物后骨轉(zhuǎn)換水平下降。雌激素對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，多途徑的，既有促進(jìn)作用，又有抑制作用[11]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組雌二醇水平明顯降低，這也與維甲酸導(dǎo)致性腺損傷的報(bào)道一致。骨碎補(bǔ)醇提物用藥組體內(nèi)雌二醇水平有不同程度的升高，特別是高劑量組較明顯，從而證實(shí)骨碎補(bǔ)醇提物具有類雌激素樣作用。

綜上所述，骨碎補(bǔ)醇提物能夠提高血清雌激素水平、抑制骨高轉(zhuǎn)換率，使骨代謝趨于平衡，對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防作用。

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編輯/成森