牛初乳凍干粉和復合制劑對維甲酸所致小鼠骨質(zhì)疏松癥的預防和抗氧化作用

王榮昌 甘露 王玉瑩 郭艷霞 劉潔 徐慧 蘇愛艷 望文閣 朱澤宇 王小軍

摘要 [目的]研究牛初乳凍干粉（LBC）和復合制劑對維甲酸所致骨質(zhì)疏松癥的預防和抗氧化作用。[方法]以維甲酸灌胃14 d建立小鼠骨質(zhì)疏松動物模型，在造模的同時給予LBC和復合制劑。動物處死后，測定股骨礦物元素含量和血清生化指標，分析血液和臟器SOD活性和MDA含量。[結(jié)果]LBC和復合制劑能明顯抑制骨質(zhì)疏松癥小鼠骨Ca、P和Zn的丟失。LBC和復合制劑能顯著提高血液SOD活性，降低血液、肝臟、腎臟和睪丸MDA含量。LBC能提高肝臟、脾臟SOD活性;復合制劑能顯著提高脾臟、睪丸SOD活性。LBC和復合制劑能降低血清膽固醇含量。[結(jié)論]LBC及復合制劑能抑制骨礦物元素的丟失，提高血液和主要組織的抗自由基損傷的能力，對骨質(zhì)疏松癥有較好的改善和抗氧化作用。

關鍵詞 牛初乳凍干粉;復合制劑;維甲酸;骨質(zhì)疏松癥;抗氧化作用

中圖分類號 TS252.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）10-0157-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.042

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Lyophilized Bovine Colostrums and Compound Preparation on Prevention and Antioxidation of Retinoic Acid Induced Osteoporosis in Mice

WANG Rong-chang，GAN Lu，WANG Yu-ying et al

（Jiangsu TMG Nature Biological Engineering Co.， Ltd.，Nanjing， Jiangsu 210046）

Abstract [Objective] To investigate the preventive and antioxidative effects of lyophilized bovine colostrums （LBC） and compound preparation （CP） on osteoporosis induced by retinoic acid in mice. [Method] The mice osteoporosis was induced by given retinoic acid intragastrically for two weeks， at the same time of modeling， mice were given LBC and CP. The content of femoral Ca， P and Zn and biochemical indexes in serum were assayed. The SOD activities and MDA concentrations of blood and main tissues were determined. [Result] Compared with model group， LBC and CP group can obviously inhibit the loss of bone Ca， P， Zn. The SOD activity of blood in LBC and CP group were higher than the model group and the levels of MDA in blood， liver， kidney and testes were lower than the model group. Compared with model group， the SOD activity in liver and spleen of LBC group and in spleen and testes of CP group increased significantly. The SOD activity of blood in LBC and CP group were higher than the model group. The levels of TC in LBC and CP groups were lower than the model group. [Conclusion] LBC and CP can prevent the loss bone and enhance the antioxidant capacity of blood and main tissues， and have prevention and antioxidant effects on osteoporosis induced by retinoic acid in mice.

Key words Lyophilized bovine colostrums;Compound preparation;Retinoic acid;Osteoporosis;Antioxidation

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，導致骨脆性增加，骨折危險性增高的全身性疾病，是中老年人特別是絕經(jīng)后婦女易患的疾病之一。隨著我國進入老齡社會，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率持續(xù)增高，我國骨質(zhì)疏松癥患者約有0.9億人[1]，其中婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松約占80%[2]。目前，針對骨質(zhì)疏松的治療缺乏特效的方法，藥物治療有副作用。我國動植物資源豐富，因此從中開發(fā)安全、高效具有增加骨密度功能的保健食品有廣闊的市場應用前景。

牛初乳是指奶牛分娩后7 d 內(nèi)所分泌的乳汁，它不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量的免疫因子[3]和90余種活性物質(zhì)[4]，是除人初乳外唯一富含生長因子和免疫因子的天然食物[5]。2000 年牛初乳被美國食品科技協(xié)會列為21 世紀最佳發(fā)展前景的非草藥類天然健康食品，已成為新一代功能性食品資源庫[6]。研究表明，牛初乳能緩解輪狀病毒引起的小鼠腹瀉癥狀[7]，在腸道炎癥和感染的體外模型中具有消炎和抗菌活性[8]，牛初乳制備物能誘導胰島β細胞增殖，阻礙嚙齒動物Ⅰ型糖尿病的發(fā)展[9]，最近發(fā)現(xiàn)牛奶中的一種抗氧化肽能預防氧化應激所致的成骨細胞功能紊亂[10]。

牛初乳凍干粉是以牛初乳為原料，經(jīng)冷凍干燥工藝加工而成的一種天然牛初乳制品，保留了除脂肪外的幾乎所有營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，已報道它具有抗衰老和活性氧清除作用[11-12]，能促進胎鼠骨骼發(fā)育和成骨細胞增殖[13]，具有降血糖和抗氧化作用[14]，但在預防骨質(zhì)疏松癥方面報道不多。筆者在建立小鼠維甲酸骨質(zhì)疏松癥動物模型的基礎上，對牛初乳凍干粉和復合制劑預防骨質(zhì)疏松及其抗氧化作用進行研究，旨在為骨質(zhì)疏松癥的預防和治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛初乳凍干粉（LBC），由牛初乳離心脫脂后經(jīng)冷凍干燥工藝加工而成，免疫球蛋白G含量為20.0%，蛋白質(zhì)為45.0%。復合制劑由江蘇天美健大自然生物工程有限公司提供，組成成分為LBC、大豆異黃酮和超細鮮骨粉按一定比例加工而成，其中大豆異黃酮含量為4.5%，免疫球蛋白G含量為14.2%，蛋白質(zhì)含量為31.0%，鈣含量為9.2%。維甲酸膠囊（商品名迪維膠囊），重慶華邦制藥股份有限公司產(chǎn)品。

ME155DU型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;HG9620A型原子吸收分光光度計，沈陽華光精密儀器有限公司;Z36HK 型高速冷凍離心機，德國Hermle 公司;EV300型紫外可見分光光度計，美國Thermo fisher公司。

氯化硝基四氮唑藍（NBT）、硫代巴比妥酸（TBA）（國藥集團化學試劑有限公司）;四甲氧基丙烷、考馬斯亮藍G250、BSA（Sigma公司）;硝酸、高氯酸為優(yōu)級純，其他試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 試驗分組及動物模型制備

昆明種雄性小鼠40只，清潔級，體重（25±2） g，由江蘇省醫(yī)科大學實驗動物中心提供。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后隨機分為4組，每組10只，即對照組（A組）、模型組（B組）、LBC組（C組）和復合制劑組（D組）。每天上午C、D組分別灌胃給予LBC（劑量為350 mg/kg）和復合制劑（劑量為350 mg/kg），A、B組灌胃給予等量蒸餾水，下午除A組給予蒸餾水外，其余各組均灌胃給予維甲酸（150 mg/kg），連續(xù)飼養(yǎng)14 d[15]。試驗期間動物自由攝食，飲水，每2 d稱重以調(diào)整給藥量。第15天禁食12 h，摘眼球取血分離血清，動物處死后解剖，分離股骨測定Ca、P、Zn等含量，取各臟器制備組織勻漿，進行各項生化指標測定。

1.3 方法

1.3.1 臟器指數(shù)的測定。

取臟器用定性濾紙吸除表面污血后，在分度值為萬分之一電子分析天平上稱重，臟器指數(shù)以mg組織/g體重表示。

1.3.2 骨和血清中礦物元素含量的測定。

取小鼠雙側(cè)股骨，剔去肌肉等軟組織后于105 ℃干燥至恒重，用分析天平稱量骨干重，用游標卡尺測量骨長度。股骨中Ca、P、Zn和血清中Ca、P含量測定采用混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）消化法，分別按GB/T 5009.92—2003、GB/T 5009.87—2003和GB/T 5009.14—2003測定。

1.3.3 血液和組織樣品的制備。

小鼠剪尾取20 uL血液，加入到1 mL蒸餾水中，充分溶血，制備2%溶血液用于血液MDA含量測定。另取20 uL血液于1.5 mL生理鹽水中立即混勻，4 000 r/min 離心5 min，收集紅細胞，加入0.2 mL蒸餾水溶血，向溶血液中加入0.1 mL 95%乙醇混勻后，再加入0.1 mL氯仿，振蕩后于4 000 r/min 離心5 min，取上清液用于SOD活性測定。

組織樣品用生理鹽水沖洗，拭干，剪碎，加入預冷的50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.8），于冰浴中進行超聲波破碎（400 W，20 s×2）制備10% 組織勻漿（W/V），再經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液用于SOD活性或MDA含量測定。

1.3.4 SOD活性的測定。

按Stewart等[16]的NBT光化還原法測定SOD活性，血液SOD活性以U/mL血液表示，組織SOD活性以U/mg蛋白表示。

1.3.5 MDA含量的測定。

MDA含量測定采用TBA比色法[17]，結(jié)果以nmol/mL血液或nmol/mg組織表示。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測定。

蛋白質(zhì)含量測定采用Breadford法[18 ]，以BSA為標準蛋白。

1.3.7 血糖、血清膽固醇的測定。

血糖測定采用鄰甲苯胺微量法[19]，血清膽固醇測定采用鄰苯-甲醛法[20]。

1.3.8 統(tǒng)計分析。

采用SPSS 10.0軟件處理數(shù)據(jù)，進行方差分析和顯著性檢驗，試驗數(shù)據(jù)用M±S表示，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗觀察及臟器指數(shù)測定

小鼠連續(xù)灌胃給予維甲酸后，模型組小鼠活動緩慢，倦縮，弓背，毛發(fā)易脫落，體重減輕，在給予LBC和復合制劑后，病癥明顯有所緩解。各組間臟器指數(shù)測定無明顯差異，均在正常波動范圍內(nèi)（表1）。

2.2 對血液生化指標的影響

由表2可知，C、D組的血糖、Ca、P含量指標雖較B組有所增加，但無統(tǒng)計學差異。血清膽固醇測定結(jié)果表明，B組血清膽固醇明顯升高（P<0.05），在給予LBC和復合制劑后，C、D組分別比B組降低37.6%和53.8%，且有顯著差異（P<0.05）。這說明LBC和復合制劑均能降低血清膽固醇水平，有利于緩解骨質(zhì)疏松所致脂代謝水平異常。

2.3 對股骨長度、質(zhì)量和Ca、P、Zn含量的影響

由表3可知，B組的股骨質(zhì)量和長度低于CK，但差異不顯著;在給予LBC和復合制劑后，C、D組股骨質(zhì)量和長度比B組有所增加，也無顯著差異。B組的股骨中Ca、P、Zn含量均顯著或極顯著低于CK（P<0.05或P<0.01），提示骨質(zhì)疏松模型成立。在給予LBC和復合制劑后，與B組相比，C、D組的Ca、P、Zn含量分別增加了21.0%、34.7%、98.5%和34.7%、30.5%、78.2%。可見，LBC和復合制劑在增加骨質(zhì)疏松動物的骨礦質(zhì)元素含量方面都有明顯作用。

2.4 對SOD活性的影響

由表4可知，造模后B組的血液、肝臟和脾臟SOD活性與CK相比顯著或極顯著下降（P<0.05或P<0.01），在給予LBC和復合制劑后，C、D組血液SOD活性分別比B組提高38.1%、49.1%，脾臟SOD活性比B組增加了106.5%和117.5%，且差異顯著（P<0.05）;同時，與B組相比，LBC能顯著提高肝臟SOD活性（P<0.01），復合制劑（D組）能顯著提高睪丸SOD活性（P<0.05）?？梢?，LBC和復合制劑均能提高血液和主要組織的SOD活性，對骨質(zhì)疏松所致的自由基平衡失調(diào)有較好的緩解作用。

2.5 對MDA含量的影響

由表5可知，血液和脾臟MDA含量在造模后升高。與CK相比，B組的肝臟、腎臟和睪丸的MDA含量顯著或極顯著提高（P<0.05或P<0.01），在給予LBC 和復合制劑后，與B組相比，C、D組血液、肝臟、腎臟和睪丸的MDA含量降低，有顯著或極顯著差異（P<0.05或P<0.01）。這說明LBC和復合制劑能通過抑制血液和組織脂質(zhì)過氧化反應，降低對機體和骨組織過氧化損傷的風險。

3 討論

（1）Ca、P是骨的主要組成成分，人體中約有99%的Ca和85%的P存在于骨中，骨礦物質(zhì)主要作用是促進骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積[21]，骨中礦質(zhì)元素的丟失是造成骨質(zhì)疏松的主要原因。該研究顯示，造模后小鼠股骨Ca、P等元素顯著低于CK，提示骨礦質(zhì)元素丟失嚴重，維甲酸所致骨質(zhì)疏松模型成立。在給予LBC和復合制劑后，骨Ca、P含量分別比模型組顯著提高，且達到了CK水平。說明LBC和復合制劑能抑制維甲酸所致小鼠骨礦質(zhì)的丟失，維持骨的正常代謝水平，有助于骨質(zhì)疏松的預防。

（2）Zn參與骨骼的代謝，影響成骨形成[22]。在骨重塑方面，Zn是骨礦化過程重要的AKP 酶的輔基，AKP被認為是反映成骨細胞活性及骨形成的指標之一[23]，缺Zn會影響AKP 酶活性，間接地干擾骨的礦化。同時，Zn也是CuZn-SOD的催化輔基，缺Zn會導致抗氧化酶合成障礙，加劇機體的氧化應激損傷水平。造模后小鼠骨Zn含量下降，可能間接導致血液和主要組織Zn代謝水平失調(diào)，從而影響SOD活性和骨代謝水平。LBC和復合制劑能提高骨Zn含量，有助于維持正常骨代謝和抗氧化酶水平。

（3）LBC不僅含有人體必需營養(yǎng)物質(zhì)，還含有多種調(diào)節(jié)骨代謝的生長因子，其中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是牛初乳中含量最高的生長因子，在LBC中含量達 μg/g 水平，其中80%以上是以高生理活性的游離態(tài)存在[14]。IGF-1 被認為是多種激素和因子調(diào)節(jié)骨代謝復雜網(wǎng)絡的核心因素，是骨源性生長因子成分之一，能夠促進細胞的增殖分化，增強成骨細胞活性及其對Ca、P的吸收[1]。補充外源性骨生長因子可促進成骨代謝，改善骨結(jié)構(gòu)，提高骨密度[24]。牛初乳提取物能促進胎鼠骨骼發(fā)育和成骨細胞增殖，在促進骨骼發(fā)育方面的效果優(yōu)于活性鈣，與其IGF-1密切相關[13]?？梢?，LBC中的這些生長因子對骨質(zhì)疏松的預防和改善起到了積極的作用。

（4）復合制劑中不僅含有LBC，還含有大豆異黃酮和生物性鈣源，對骨質(zhì)疏松表現(xiàn)出與LBC相似的改善效果。大豆異黃酮具有雌激素樣作用，在預防骨質(zhì)疏松癥方面的報道較多，84～126 mg/d劑量能減緩絕經(jīng)后婦女骨丟失，維持骨密度的相對穩(wěn)定，其顯效劑量為126 mg/d[25]，每日攝入90 mg/d異黃酮人群的脊椎骨密度明顯上升[26]，與復合制劑中大豆異黃酮供給量101 mg/d的水平接近。已報道大豆異黃酮能改善去勢雄性大鼠血和尿的骨代謝生化指標[27]，能有效預防絕經(jīng)后婦女骨丟失[28]。超細鮮骨粉為生物性鈣源，它的鈣磷比合理，比其他無機鈣源更有利于生物體的吸收和利用。骨粉經(jīng)超微粉碎后，粉體變細，表面積增大，其吸收率、鈣存留率、股骨礦鹽含量、礦鹽密度和鈣含量均顯著高于普通骨粉[29]。該研究表明，復合制劑能改善骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨丟失，大豆異黃酮和超細鮮骨粉在其中起著重要作用。

（5）氧化應激是骨質(zhì)疏松癥的重要發(fā)病機制，氧化應激活性率（ROS）能促進破骨細胞分化和骨細胞凋亡，同時抑制成骨細胞活性誘導骨吸收[30]，其在骨質(zhì)疏松中扮演著重要角色。SOD是體內(nèi)主要抗氧化酶，能清除ROS保護機體免受氧化損傷，在抗氧化平衡系統(tǒng)中起著重要作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，已被廣泛作為ROS損傷脂質(zhì)分子的一個標記物，間接地反映細胞損傷情況。該研究中造模后小鼠血液和主要組織SOD活性下降，MDA含量水平上升，說明造模后導致機體氧化應激反應發(fā)生。相關研究表明，去卵巢鼠導致肝臟和腎臟中SOD活性下降，MDA含量上升[31-32]，骨質(zhì)疏松患者紅細胞MDA含量顯著高于正常組[33]，血清MDA含量升高，而SOD等抗氧化劑的活性降低，提示骨質(zhì)疏松發(fā)生時存在氧化損傷，體內(nèi)抗氧化平衡被打破[34]。LBC和復合制劑能提高血液和主要組織SOD活性、降低MDA含量，提示LBC和復合制劑能通過清除體內(nèi)自由基，來維持抗氧化系統(tǒng)平衡，減輕氧化應激所致的血液和組織的氧化損傷，有利于降低骨質(zhì)疏松發(fā)生的風險。

（6）骨質(zhì)疏松癥是中老年人常見的退行性疾病，與機體衰老密切相關。LBC和復合制劑含有豐富的蛋白質(zhì)和高含量的免疫球蛋白，有助于增強老年人的體質(zhì)和機體免疫功能，預防骨質(zhì)疏松的發(fā)生。已報道牛初乳提取物能提高老年人血清總SOD和Mn-SOD活性，降低脂質(zhì)過氧化物水平[35]，提高衰老小鼠血液SOD活性，降低血清MDA和心肌脂褐質(zhì)含量[11]，對吸收O3的小鼠具有抗自由基損傷作用[12]。有研究顯示，LBC 具有清除自由基作用[14]，牛奶抗氧化肽能通過增加成骨細胞基因表達和抗氧化酶活性來促進成骨細胞分化[10]。說明牛初乳成分能增強機體ROS清除能力，對中老年人的自由基平衡失調(diào)和骨細胞的氧化損傷有積極的改善作用，這可能是LBC和復合制劑對小鼠骨質(zhì)疏松癥有改善的另一原因。

（7）綜上所述，LBC和復合制劑能提高維甲酸所致骨質(zhì)疏松小鼠的骨Ca、P、Zn的含量，抑制骨礦質(zhì)元素的丟失，同時能提高血液及主要組織SOD活性，降低MDA含量，預防氧化應激對機體和組織的損傷作用，說明LBC和復合制劑對小鼠骨質(zhì)疏松癥有較好的改善和抗氧化作用。

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