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    NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化狀態(tài)對(duì)其分子內(nèi)相互作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物化學(xué)研究

    2015-11-19 05:16:32徐海鳴徐彥輝
    關(guān)鍵詞:絲氨酸構(gòu)象緩沖液

    鞏 微 徐海鳴 孫 昶 徐彥輝 李 澤 王 平

    (復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

    NF2是由位于22號(hào)染色體上的抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì),NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐停╪eurofibromatosis type 2,NF2)的發(fā)生[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),NF2蛋白的異??赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生[3-9]。目前的研究表明,NF2可以在細(xì)胞質(zhì)中以及細(xì)胞核中發(fā)揮不同功能。在成角質(zhì)細(xì)胞和皮膚上皮中,NF2可以被招募到α-catenin處并促進(jìn)α-catenin與Par3(pulmonary adenoma resistance 3)的相互結(jié)合,起到幫助黏附連接成熟的作用[10]。在緊密連接處,NF2通過(guò)與血管動(dòng)蛋白結(jié)合釋放Rich(GTPaseRac激活蛋白)來(lái)使Rac失活,調(diào)節(jié)細(xì)胞的接觸抑制進(jìn)而減弱有絲分裂信號(hào),甚至可能有抑制腫瘤的作用[11-12]。在細(xì)胞核內(nèi),NF2可以與CRL4DCAF1結(jié)合并抑制其E3泛素連接酶活性,因?yàn)镃RL4DCAF1可以調(diào)節(jié)許多與轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳有關(guān)的蛋白質(zhì),NF2被認(rèn)為在進(jìn)入細(xì)胞核后可以對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[13-21]。另外,最新研究發(fā)現(xiàn),NF2還可以通過(guò) CRL4DCAF1調(diào)控 Lats1/2[22](large tumor suppressor kinase 1)或直接調(diào)控 Lats1/2[23],達(dá)到調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路活性的目的。

    NF2與 ERM(Ezrin,Radixin,Moesin)蛋白為同源蛋白,均屬于Band 4.1超級(jí)家族[24]。這4種蛋白質(zhì)的 N-端均有一個(gè) FERM(Four-point one,Ezrin,Radixin,Moesin)結(jié)構(gòu)域,C-端為一段親水的尾巴,其間為coiled coil結(jié)構(gòu)。這類蛋白質(zhì)生物活性的調(diào)控可通過(guò)其分子內(nèi)相互作用的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。與ERM蛋白相似,NF2特定位點(diǎn)的氨基酸被磷酸化后,其活性狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變,如NF2 C-端第518位絲氨酸可以被激活后的 PAK(P21-activated kinase)磷酸化,導(dǎo)致其分子內(nèi)相互作用改變從而使蛋白失活[25]。雖然NF2活性的調(diào)節(jié)方式已經(jīng)被研究得十分清楚,但是由于缺少全長(zhǎng)結(jié)構(gòu),目前仍無(wú)法從原子水平證實(shí)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制。

    在NF2的十余種亞型中,關(guān)于NF2-1和NF2-2兩種亞型的研究最多,其中NF2-1為主要表達(dá)的亞型(以下均稱 NF2)[26]。自1997年起,多項(xiàng)研究認(rèn)為,NF2-2不具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性,且其N端的FERM結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)相互作用很弱,即其構(gòu)象一直處于“開(kāi)放”狀態(tài);有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性的 NF2與之相反,為“閉合”構(gòu)象,即 N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合,而失活的NF2為“開(kāi)放”構(gòu)象[25,27]。而較新的研究結(jié)果恰與此相反,研究認(rèn)為,518位絲氨酸未被磷酸化的NF2與NF2-2均處于“開(kāi)放”的構(gòu)象,且具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性,而518位絲氨酸被磷酸化從而失活的NF2則處于“閉合”構(gòu)象[28]。

    有研究表明,NF2的518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼岷罂梢阅M該位點(diǎn)的組成型磷酸化,且NF2不再具有正常的抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能[29]?;谝陨媳尘?,本研究對(duì)野生型NF2WT和突變型NF2S518D(518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔┻M(jìn)行了表達(dá)與純化,希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段,直接觀察兩種NF2的構(gòu)象,進(jìn)一步通過(guò)體外Pull-down實(shí)驗(yàn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)NF2的分子內(nèi)相互作用,對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出解釋。

    材料和方法

    材料來(lái)源 NF2全長(zhǎng)cDNA由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院MCB實(shí)驗(yàn)室管坤良教授饋贈(zèng);CFP和YFP熒光蛋白基因由華東理工大學(xué)楊弋教授提供;大腸埃希菌Top10和BL21(DE3)感受態(tài)菌株、原核表達(dá)載體pGEX6p-1-His、用于FRET實(shí)驗(yàn)的載體pET28-FRET、3C蛋白酶等均由本實(shí)驗(yàn)室制備;PCR引物購(gòu)自Invitrogen公司;Phanta DNA聚合酶購(gòu)自諾唯贊生物公司;KOD plus DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Solarbio公司;膠回收、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;蛋白純化使用層析柱及柱材均購(gòu)自GE Healthcare公司;結(jié)晶初篩商業(yè)試劑盒分別購(gòu)自Hampton Research公司和Emerald BioStructures公司;各類試劑分別購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、AMRESCO公司、Sigma公司。

    野生型NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 全長(zhǎng)NF2共有595個(gè)氨基酸。通過(guò)Gene Runner軟件分析cDNA序列并設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。以人源NF2 cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收DNA片段,使用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)DNA片段及載體進(jìn)行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物。片段和載體用T4酶連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中,在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng),挑取單克隆以PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)DNA測(cè)序的方法(上海鉑尚生物技術(shù)有限公司)鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

    表1 針對(duì)野生型NF2不同蛋白表達(dá)片段的引物序列Tab 1 Primers used for different protein expression in wild type NF2constructs

    突變體NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 將NF2的518位絲氨酸(Serine,S)突變?yōu)樘於彼幔ˋsp,D)以模擬518位絲氨酸的磷酸化狀態(tài),重組蛋白稱為NF2S518D。以測(cè)序正確的野生型NF2重組質(zhì)粒為模板,用含有突變序列的PCR引物(表2)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。用限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化模板質(zhì)粒,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中,在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng),挑取單克隆通過(guò)DNA測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

    表2 用于突變體NF2結(jié)構(gòu)的引物序列Tab 2 Primers used in mutate NF2constructs

    NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá),經(jīng)反復(fù)測(cè)試,使用2×YT培養(yǎng)基、低溫(15℃)誘導(dǎo)表達(dá)的條件下,蛋白產(chǎn)量較高、性質(zhì)較好。37℃培養(yǎng)至菌液的D值為0.6~0.8,降溫至15℃,加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),低溫培養(yǎng)16 h后收集菌體。菌體用裂解緩沖液充分重懸后高壓破碎,細(xì)菌裂解液使用高速離心機(jī)30 996×g低溫(4℃)離心40 min,收集上清液。接下來(lái)的步驟均在4℃冷庫(kù)中進(jìn)行。

    將上清液緩緩?fù)ㄟ^(guò)Ni2+親和層析柱,上樣完畢后,使用洗滌緩沖液沖走非特異性吸附的雜蛋白。向吸附了目的蛋白的柱內(nèi)加入1 mL濃度為0.5 mg/mL的3C蛋白酶,與柱材充分混勻,酶切過(guò)夜。不同的是,NF2 513-595和 NF2 513-595 S518D 為GST Pull-down的餌蛋白,親和層析后直接用洗脫緩沖液洗脫,進(jìn)行純化及緩沖條件的更換。

    用洗脫緩沖液洗脫充分酶切后的蛋白,稀釋后使用AKTA Purifier蛋白純化儀進(jìn)行陰離子交換柱層析,用SDS-PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處的蛋白樣品,收集濃度較高且雜帶較少的蛋白樣品,濃縮至1 mL以內(nèi)。

    利用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,同時(shí)更換緩沖液。用SDS-PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處蛋白樣品,收集純度高的目的蛋白樣品濃縮至適合的濃度,分裝于1.5 mL離心管中,液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。

    NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 本研究采用氣相懸滴法篩選和優(yōu)化蛋白晶體,初篩使用商業(yè)化緩沖液(WizardⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,Crystal screenⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,Index 96個(gè)結(jié)晶條件,Salt 96個(gè)結(jié)晶條件,PEG/IonⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,PEG/RxⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件),將NF2 18~595蛋白、NF2 18~595 S518D蛋白(均為10 mg/mL)與池液1:1混合。晶體在4℃或者18℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)。3天后在倒置顯微鏡下觀察液滴內(nèi)是否有晶體長(zhǎng)出,篩選到質(zhì)量較好的晶體的初始生長(zhǎng)條件后,根據(jù)初始生長(zhǎng)條件分別對(duì)沉淀劑濃度、緩沖液pH進(jìn)行變動(dòng),以上述相同方法篩選晶體。

    對(duì)晶體進(jìn)行防凍處理時(shí),防凍液成分為晶體生長(zhǎng)緩沖液加20%的甘油,采用慢平衡的方法處理,平衡好的晶體迅速轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

    晶體數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析 在上海同步輻射光源SSRF-BL17U線站內(nèi)CentOS操作系統(tǒng)中運(yùn)行的Bluice控制系統(tǒng)控制收集晶體衍射數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)收集采用回?cái)[法。

    衍射數(shù)據(jù)收集完成后,使用HKL2000軟件包[30]處理。采用分子置換法解析相位,依次用CCP4軟件包[31]中scalepack2mtz、matthews_coef、phaser_M(jìn)R用搜索模型進(jìn)行分子置換,找到對(duì)應(yīng)的解。隨后在PHENIX軟件包[32]中使用phenix.refine中剛體修正、擬退火修的測(cè)率進(jìn)行修正。在COOT[33]中根據(jù)對(duì)應(yīng)的電子密度圖進(jìn)行手動(dòng)的搭建與修正,并用phenix.refine進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過(guò)多輪的手動(dòng)搭建和軟件優(yōu)化確定最終的結(jié)構(gòu)模型。最終根據(jù)R-work值和R-free值來(lái)評(píng)價(jià)模型搭建的質(zhì)量并使用PROCHECK[34]來(lái)確定二面角等立體化學(xué)參數(shù)是否合理。

    GST Pull-down實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)于NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響,將有GST融合標(biāo)簽的 NF2蛋白 GST-NF2 513-595、GST-NF2 513-595 S518D作為餌蛋白,與不含GST標(biāo)簽的靶蛋白(NF2 18~344)按照1∶10的摩爾比混合。結(jié)合緩沖液成分為20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),110 mmol/L NaCl,體積分?jǐn)?shù)分別為0.3%的Triton X-100和5%的甘油。4℃孵育2 h,12 000×g離心2 min后將上清與10μL用結(jié)合緩沖液平衡過(guò)的GST柱材混合孵育1 h。用緩沖液清洗GST柱材4~5次,用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)合情況。

    體外熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響,將供體CFP熒光蛋白融合于NF2蛋白的N端,受體YFP熒光蛋白融合于蛋白的C端,檢測(cè)NF2蛋白的熒光強(qiáng)度。CFP、YFP熒光蛋白距離在10 nm以內(nèi)時(shí),CFP被激發(fā)后的發(fā)射光與YFP吸收光光譜重疊,因而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,供體CFP的熒光強(qiáng)度會(huì)大大降低,僅可檢測(cè)到Y(jié)FP發(fā)射光;若YFP與CFP相距較遠(yuǎn),則YFP無(wú)法吸收CFP的發(fā)射光,因而只能檢測(cè)到CFP的發(fā)射光。

    實(shí)驗(yàn)組為融合有CFP和YFP的NF2蛋白,陰性對(duì)照組使用終濃度0.1%的SDS處理(使蛋白變性而構(gòu)象開(kāi)放),以430 nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)CFP并測(cè)量455~600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的數(shù)值,每個(gè)孔的數(shù)值由Synergy4酶標(biāo)儀讀取,數(shù)據(jù)使用軟件Microsoft Office Excel處理。

    結(jié) 果

    NF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以往研究結(jié)果表明,NF2蛋白第518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2的構(gòu)象及生物功能均有重要影響。本研究采用518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼嵋阅MS518磷酸化狀態(tài)的策略,設(shè)計(jì)了用于晶體篩選、GST Pull-down實(shí)驗(yàn)和FRET實(shí)驗(yàn)的不同重組質(zhì)粒(表3)。

    表3 用于不同實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒Tab 3 Recombinant plasmids designed for different experimental purposes

    NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 經(jīng)過(guò)對(duì)緩沖液pH、鹽濃度、添加劑以及純化方式的反復(fù)優(yōu)化,本研究最終選取Ni2+親和層析-陰離子交換柱層析-凝膠過(guò)濾層析的純化策略,各種緩沖液成分如下:

    裂解緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl (pH =8.0),300 mmol/L NaCl;洗滌緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl (pH =8.0),300 mmol/L NaCl,25 mmol/L 咪唑;洗脫緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),300 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑;離子交換層析緩沖液 A:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),2 mmol/L DTT;離子交換層析緩沖液B:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),1 mol/L NaCl,2 mmol/L DTT;凝膠過(guò)濾層析緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),150 mmol/L NaCl,及 2 mmol/L的DTT。

    Ni2+-NTA對(duì)NF2-N蛋白有較強(qiáng)的吸附性,3C酶切除 His-GST標(biāo)簽。蛋白樣品上樣電導(dǎo)4.5 ms/cm,鹽濃度線性梯度洗脫時(shí),該蛋白的紫外吸收峰出現(xiàn)在電導(dǎo)12 ms/cm處,SDS-PAGE檢測(cè)樣品較為純凈。凝膠過(guò)濾層析后得到性質(zhì)較好、純度較高的蛋白樣品。

    NF2WT和NF2S518D蛋白用于晶體的篩選。點(diǎn)突變后的NF2蛋白性質(zhì)并未發(fā)生明顯的變化。Ni2+親和層析后,3C酶切過(guò)夜除去His-GST標(biāo)簽。離子交換層析時(shí),兩種蛋白均在電導(dǎo)23 ms/cm處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白峰。用于FRET實(shí)驗(yàn)的FRET-NF2WT(CFP-NF2 18-595-YFP)和 FRET-NF2S518D(CFPNF2 18-595 S518D-YFP)使用凝膠過(guò)濾層析純化。

    NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 分別使用純度和濃度均較高的NF2WT和NF2S518D蛋白樣品,依照前文所述方法,用576個(gè)商業(yè)化初篩條件篩選。最終兩種蛋白晶體均在18℃、體積分?jǐn)?shù)為10%的異丙醇、0.1 mol/L Tris(pH=8.5)的條件下產(chǎn)生。根據(jù)初始結(jié)晶條件,分別調(diào)整沉淀劑異丙醇的濃度(8%、10%、12%、14%)和緩沖液的pH(8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0),最終得到的晶體呈粗棒狀(圖1),經(jīng)慢平衡防凍處理后凍于液氮中保存。防凍液條件為體積分?jǐn)?shù)10%的異丙醇,0.1 mol/L Tris(pH=8.5),體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油。

    圖1 NF2WT和NF2S518D的晶體照片F(xiàn)ig 1 Crystals of NF2WT and NF2S518D

    NF2晶體數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析 晶體衍射數(shù)據(jù)在上海同步輻射光源(SSRF)BL17U線站收集。衍射數(shù)據(jù)用HKL2000軟件包進(jìn)行處理,NF2WT和NF2S518D晶體最終衍射分辨率分別為3.60?和3.90?(圖2)。

    由于同家族蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已有報(bào)道,本課題采用FERM結(jié)構(gòu)域(PDB:1ISN)作為模型進(jìn)行分子置換。NF2WT和NF2S518D晶體的一個(gè)不對(duì)稱單位均含有一個(gè)分子。采用上文所述方法對(duì)結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化,數(shù)據(jù)收集、處理與結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

    圖2 NF2WT和NF2S518D的晶體衍射圖及局部放大圖Fig 2 X-ray diffraction pattern and enlarged images from crystals of NF2WT and NF2S518D

    NF2蛋白的C-端在結(jié)晶過(guò)程中發(fā)生降解 結(jié)構(gòu)中顯示的氨基酸殘基序列為20-361,其整體結(jié)構(gòu)如圖3A/B所示,兩個(gè)結(jié)構(gòu)均由FERM結(jié)構(gòu)域和一段延伸在外的α螺旋組成。與以往文獻(xiàn)[35-36]所述相似,F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域由3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成(圖3C):第1個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與泛素蛋白相似,由5條β折疊和1條α螺旋組成;第2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與乙酰輔酶A結(jié)合蛋白相似,由4個(gè)α螺旋組成;第3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域則與PTB結(jié)構(gòu)域相似,由1對(duì)正交的反向平行β折疊和1條α螺旋組成。

    圖3 NF2WT和NF2S518D的晶體結(jié)構(gòu)及FERM結(jié)構(gòu)域示意圖Fig 3 Crystal structures and FERM domain of NF2WT and NF2S518D

    對(duì)兩種蛋白的晶體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩者均有降解,且主帶對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)與20-361片段的(Mr)接近。同樣地,純化好的NF2蛋白樣品也發(fā)生了不同程度的降解(圖4A、B)。根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果(圖4C),NF2蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域十分保守,NF2結(jié)構(gòu)中延伸在外的α螺旋也較為保守,而其C端氨基酸序列則并不保守。實(shí)驗(yàn)證明,正是這段不保守的區(qū)域發(fā)生了降解。518位絲氨酸所在的C端蛋白片段并未出現(xiàn)在所解析結(jié)構(gòu)中,可能是蛋白自身性質(zhì)所造成的降解導(dǎo)致的,本課題未能成功解析2個(gè)蛋白的18~595序列的完整結(jié)構(gòu)。

    圖4 NF2晶體及蛋白樣品SDS-PAGE圖與NF2蛋白序列比對(duì)Fig 4 SDS-PAGE of NF2crystals and proteins versus sequence alignment of NF2family proteins

    NF2蛋白FERM結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域相似 通過(guò)NF2WT結(jié)構(gòu)與NF2S518D結(jié)構(gòu)的比對(duì)(圖5A),發(fā)現(xiàn)兩者的分子構(gòu)象相似,因而后續(xù)結(jié)構(gòu)比對(duì)僅使用NF2WT的結(jié)構(gòu)。將本研究中所解析的結(jié)構(gòu)NF2WT分別與已有的人源NF2 FERM 結(jié)構(gòu)域(PDB:1H4R)、鼠源 Merlin FERM結(jié)構(gòu)(PDB:1ISN)、人源 MOESIN部分結(jié)構(gòu)(PDB:1E5 W)分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)(圖5B~D)。NF2WT的結(jié)構(gòu)較之人源FERM結(jié)構(gòu)域,其C端多一段向外延伸的α螺旋;與鼠源Merlin FERM結(jié)構(gòu)域構(gòu)象相似,C末端α螺旋長(zhǎng)度不同,且其走向稍有不同;與人源MOESIN的FERM結(jié)構(gòu)域、C末端α螺旋構(gòu)象基本相似。

    表4 NF2WT和NF2S518D蛋白晶體數(shù)據(jù)處理及結(jié)構(gòu)解析參數(shù)Tab 4 Statistics of data collection,processing and refinement

    綜上所述,NF2蛋白N端的FERM結(jié)構(gòu)域蛋白序列保守,三維結(jié)構(gòu)亦與該家族中其他蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域相似,C末端α螺旋結(jié)構(gòu)走向一致,提示該螺旋在NF2結(jié)構(gòu)中的保守性,可能對(duì)C端結(jié)構(gòu)域的走向起重要作用。

    體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模擬磷酸化突變體調(diào)節(jié)NF2相互作用 采用GST Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究NF2 N端和C端的相互作用。SDS-PAGE顯示(圖6),N端蛋白NF2-N與GST并無(wú)非特異性的結(jié)合,GST-NF2WT蛋白和GST-NF2S518D蛋白均可與N端序列有較強(qiáng)的結(jié)合,然而,在相同的蛋白用量時(shí),GST-NF2S518D蛋白較 GST-NF2WT蛋白可以結(jié)合更多的NF2-N蛋白。該結(jié)果提示518位絲氨酸磷酸化后,NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合可能更加緊密,分子內(nèi)相互作用更強(qiáng),因而NF2S518D的構(gòu)象呈“閉合”狀態(tài),無(wú)模擬磷酸化突變的NF2相對(duì)而言呈“開(kāi)放”構(gòu)象。

    圖5 NF2的結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig 5 Structure alignment of NF2proteins

    圖6 GST Pull-down的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 6 SDS-PAGE result of GST Pull-down assay

    FRET檢測(cè)磷酸化模擬突變?cè)斐傻腘F2內(nèi)部構(gòu)象變化 為了進(jìn)一步研究NF2蛋白分子內(nèi)相互作用,我們開(kāi)展了FRET實(shí)驗(yàn)。由標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)生成的圖顯示(圖7),在激發(fā)光的作用下,經(jīng)SDS變性解鏈的 FRET-NF2WT和 FRET-NF2S518D均未檢測(cè)到FRET信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)組中,相較FRET-NF2WT而言,F(xiàn)RET-NF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào),即CFP和YFP距離更為接近。該結(jié)果與上文所述GST Pull-down結(jié)果一致,進(jìn)一步表明:518位絲氨酸被磷酸化的NF2蛋白N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明,NF2的518位絲氨酸被磷酸化后,蛋白處于“閉合”構(gòu)象,與最新的研究結(jié)果[28]一致。

    圖7 FRET標(biāo)準(zhǔn)化曲線Fig 7 Standardized curve of FRET

    討 論

    NF2是由抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì),NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐偷陌l(fā)生。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),NF2蛋白的異??赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生,且其參與眾多體內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)途徑如Hippo信號(hào)途徑的調(diào)控。自1997年至2012年以來(lái),多項(xiàng)研究認(rèn)為,有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的NF2為“閉合”構(gòu)象,即N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合,而518位磷酸化后失活的NF2分子內(nèi)相互作用變?nèi)酰省伴_(kāi)放”構(gòu)象。直至2012年有研究提出并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了完全相反的結(jié)論。

    為了澄清磷酸化對(duì)NF2調(diào)節(jié)構(gòu)象變化的機(jī)制,本研究構(gòu)建了野生型NF2WT和模擬518位絲氨酸組成型磷酸化的突變型NF2S518D兩種重組質(zhì)粒,并對(duì)兩者進(jìn)行了表達(dá)純化和晶體的篩選,希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段,從原子水平解讀NF2蛋白的構(gòu)象變化方式,對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出更為直觀的解釋。除此之外,本研究進(jìn)一步采用體外Pull-down實(shí)驗(yàn)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)兩種NF2蛋白的分子內(nèi)相互作用,進(jìn)而從生化水平驗(yàn)證兩種蛋白的構(gòu)象變化,對(duì)結(jié)論給予佐證。

    實(shí)驗(yàn)證明,NF2蛋白與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域無(wú)論在序列還是結(jié)構(gòu)上均有很高的相似度。然而,其序列不保守的362~595段序列在純化與結(jié)晶的過(guò)程中均發(fā)生很大程度的降解,致使18~595段完整序列的結(jié)構(gòu)無(wú)法解析。解析出的部分結(jié)構(gòu)與人源或鼠源同家族蛋白的N-端FERM結(jié)構(gòu)域基本相似。

    由于無(wú)法從原子水平看到518位絲氨酸磷酸化前后NF2蛋白構(gòu)象的不同,本研究采用GST Pulldown及FRET的研究方法,在體外檢測(cè)NF2蛋白N端和C端的分子間相互作用強(qiáng)度,從側(cè)面求證蛋白內(nèi)部相互作用關(guān)系。GST Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:518位模擬磷酸化突變后,NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合更加緊密,分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。在FRET實(shí)驗(yàn)中,相較 FRET-NF2WT而言,F(xiàn)RETNF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào),即CFP和YFP距離更為接近,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步支持上述推斷:溶液狀態(tài)下的NF2蛋白在518位絲氨酸被磷酸化后,N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。

    綜上所述,處于活性狀態(tài)的NF2蛋白,其N端和C端分子內(nèi)相互作用強(qiáng)度較弱,蛋白質(zhì)整體呈“開(kāi)放”狀態(tài),而518位絲氨酸被磷酸化后,NF2蛋白活性喪失,此時(shí)分子內(nèi)相互作用較強(qiáng),蛋白質(zhì)處于“閉合”構(gòu)象,這與最新的研究結(jié)果一致[28]。今后的研究中,我們擬進(jìn)行突變體篩選以提高NF2蛋白自身穩(wěn)定性,避免其分子內(nèi)降解,有望從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度揭示NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化對(duì)其構(gòu)象調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

    致謝上海光源BL17U線站工作人員在晶體數(shù)據(jù)采集過(guò)程中提供了幫助。

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