• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化狀態(tài)對(duì)其分子內(nèi)相互作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物化學(xué)研究

    2015-11-19 05:16:32徐海鳴徐彥輝
    關(guān)鍵詞:絲氨酸構(gòu)象緩沖液

    鞏 微 徐海鳴 孫 昶 徐彥輝 李 澤 王 平

    (復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

    NF2是由位于22號(hào)染色體上的抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì),NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐停╪eurofibromatosis type 2,NF2)的發(fā)生[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),NF2蛋白的異??赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生[3-9]。目前的研究表明,NF2可以在細(xì)胞質(zhì)中以及細(xì)胞核中發(fā)揮不同功能。在成角質(zhì)細(xì)胞和皮膚上皮中,NF2可以被招募到α-catenin處并促進(jìn)α-catenin與Par3(pulmonary adenoma resistance 3)的相互結(jié)合,起到幫助黏附連接成熟的作用[10]。在緊密連接處,NF2通過(guò)與血管動(dòng)蛋白結(jié)合釋放Rich(GTPaseRac激活蛋白)來(lái)使Rac失活,調(diào)節(jié)細(xì)胞的接觸抑制進(jìn)而減弱有絲分裂信號(hào),甚至可能有抑制腫瘤的作用[11-12]。在細(xì)胞核內(nèi),NF2可以與CRL4DCAF1結(jié)合并抑制其E3泛素連接酶活性,因?yàn)镃RL4DCAF1可以調(diào)節(jié)許多與轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳有關(guān)的蛋白質(zhì),NF2被認(rèn)為在進(jìn)入細(xì)胞核后可以對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[13-21]。另外,最新研究發(fā)現(xiàn),NF2還可以通過(guò) CRL4DCAF1調(diào)控 Lats1/2[22](large tumor suppressor kinase 1)或直接調(diào)控 Lats1/2[23],達(dá)到調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路活性的目的。

    NF2與 ERM(Ezrin,Radixin,Moesin)蛋白為同源蛋白,均屬于Band 4.1超級(jí)家族[24]。這4種蛋白質(zhì)的 N-端均有一個(gè) FERM(Four-point one,Ezrin,Radixin,Moesin)結(jié)構(gòu)域,C-端為一段親水的尾巴,其間為coiled coil結(jié)構(gòu)。這類蛋白質(zhì)生物活性的調(diào)控可通過(guò)其分子內(nèi)相互作用的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。與ERM蛋白相似,NF2特定位點(diǎn)的氨基酸被磷酸化后,其活性狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變,如NF2 C-端第518位絲氨酸可以被激活后的 PAK(P21-activated kinase)磷酸化,導(dǎo)致其分子內(nèi)相互作用改變從而使蛋白失活[25]。雖然NF2活性的調(diào)節(jié)方式已經(jīng)被研究得十分清楚,但是由于缺少全長(zhǎng)結(jié)構(gòu),目前仍無(wú)法從原子水平證實(shí)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制。

    在NF2的十余種亞型中,關(guān)于NF2-1和NF2-2兩種亞型的研究最多,其中NF2-1為主要表達(dá)的亞型(以下均稱 NF2)[26]。自1997年起,多項(xiàng)研究認(rèn)為,NF2-2不具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性,且其N端的FERM結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)相互作用很弱,即其構(gòu)象一直處于“開(kāi)放”狀態(tài);有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性的 NF2與之相反,為“閉合”構(gòu)象,即 N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合,而失活的NF2為“開(kāi)放”構(gòu)象[25,27]。而較新的研究結(jié)果恰與此相反,研究認(rèn)為,518位絲氨酸未被磷酸化的NF2與NF2-2均處于“開(kāi)放”的構(gòu)象,且具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性,而518位絲氨酸被磷酸化從而失活的NF2則處于“閉合”構(gòu)象[28]。

    有研究表明,NF2的518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼岷罂梢阅M該位點(diǎn)的組成型磷酸化,且NF2不再具有正常的抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能[29]?;谝陨媳尘?,本研究對(duì)野生型NF2WT和突變型NF2S518D(518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔┻M(jìn)行了表達(dá)與純化,希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段,直接觀察兩種NF2的構(gòu)象,進(jìn)一步通過(guò)體外Pull-down實(shí)驗(yàn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)NF2的分子內(nèi)相互作用,對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出解釋。

    材料和方法

    材料來(lái)源 NF2全長(zhǎng)cDNA由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院MCB實(shí)驗(yàn)室管坤良教授饋贈(zèng);CFP和YFP熒光蛋白基因由華東理工大學(xué)楊弋教授提供;大腸埃希菌Top10和BL21(DE3)感受態(tài)菌株、原核表達(dá)載體pGEX6p-1-His、用于FRET實(shí)驗(yàn)的載體pET28-FRET、3C蛋白酶等均由本實(shí)驗(yàn)室制備;PCR引物購(gòu)自Invitrogen公司;Phanta DNA聚合酶購(gòu)自諾唯贊生物公司;KOD plus DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Solarbio公司;膠回收、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;蛋白純化使用層析柱及柱材均購(gòu)自GE Healthcare公司;結(jié)晶初篩商業(yè)試劑盒分別購(gòu)自Hampton Research公司和Emerald BioStructures公司;各類試劑分別購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、AMRESCO公司、Sigma公司。

    野生型NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 全長(zhǎng)NF2共有595個(gè)氨基酸。通過(guò)Gene Runner軟件分析cDNA序列并設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。以人源NF2 cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收DNA片段,使用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)DNA片段及載體進(jìn)行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物。片段和載體用T4酶連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中,在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng),挑取單克隆以PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)DNA測(cè)序的方法(上海鉑尚生物技術(shù)有限公司)鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

    表1 針對(duì)野生型NF2不同蛋白表達(dá)片段的引物序列Tab 1 Primers used for different protein expression in wild type NF2constructs

    突變體NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 將NF2的518位絲氨酸(Serine,S)突變?yōu)樘於彼幔ˋsp,D)以模擬518位絲氨酸的磷酸化狀態(tài),重組蛋白稱為NF2S518D。以測(cè)序正確的野生型NF2重組質(zhì)粒為模板,用含有突變序列的PCR引物(表2)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。用限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化模板質(zhì)粒,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中,在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng),挑取單克隆通過(guò)DNA測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

    表2 用于突變體NF2結(jié)構(gòu)的引物序列Tab 2 Primers used in mutate NF2constructs

    NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá),經(jīng)反復(fù)測(cè)試,使用2×YT培養(yǎng)基、低溫(15℃)誘導(dǎo)表達(dá)的條件下,蛋白產(chǎn)量較高、性質(zhì)較好。37℃培養(yǎng)至菌液的D值為0.6~0.8,降溫至15℃,加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),低溫培養(yǎng)16 h后收集菌體。菌體用裂解緩沖液充分重懸后高壓破碎,細(xì)菌裂解液使用高速離心機(jī)30 996×g低溫(4℃)離心40 min,收集上清液。接下來(lái)的步驟均在4℃冷庫(kù)中進(jìn)行。

    將上清液緩緩?fù)ㄟ^(guò)Ni2+親和層析柱,上樣完畢后,使用洗滌緩沖液沖走非特異性吸附的雜蛋白。向吸附了目的蛋白的柱內(nèi)加入1 mL濃度為0.5 mg/mL的3C蛋白酶,與柱材充分混勻,酶切過(guò)夜。不同的是,NF2 513-595和 NF2 513-595 S518D 為GST Pull-down的餌蛋白,親和層析后直接用洗脫緩沖液洗脫,進(jìn)行純化及緩沖條件的更換。

    用洗脫緩沖液洗脫充分酶切后的蛋白,稀釋后使用AKTA Purifier蛋白純化儀進(jìn)行陰離子交換柱層析,用SDS-PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處的蛋白樣品,收集濃度較高且雜帶較少的蛋白樣品,濃縮至1 mL以內(nèi)。

    利用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,同時(shí)更換緩沖液。用SDS-PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處蛋白樣品,收集純度高的目的蛋白樣品濃縮至適合的濃度,分裝于1.5 mL離心管中,液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。

    NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 本研究采用氣相懸滴法篩選和優(yōu)化蛋白晶體,初篩使用商業(yè)化緩沖液(WizardⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,Crystal screenⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,Index 96個(gè)結(jié)晶條件,Salt 96個(gè)結(jié)晶條件,PEG/IonⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件,PEG/RxⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件),將NF2 18~595蛋白、NF2 18~595 S518D蛋白(均為10 mg/mL)與池液1:1混合。晶體在4℃或者18℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)。3天后在倒置顯微鏡下觀察液滴內(nèi)是否有晶體長(zhǎng)出,篩選到質(zhì)量較好的晶體的初始生長(zhǎng)條件后,根據(jù)初始生長(zhǎng)條件分別對(duì)沉淀劑濃度、緩沖液pH進(jìn)行變動(dòng),以上述相同方法篩選晶體。

    對(duì)晶體進(jìn)行防凍處理時(shí),防凍液成分為晶體生長(zhǎng)緩沖液加20%的甘油,采用慢平衡的方法處理,平衡好的晶體迅速轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

    晶體數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析 在上海同步輻射光源SSRF-BL17U線站內(nèi)CentOS操作系統(tǒng)中運(yùn)行的Bluice控制系統(tǒng)控制收集晶體衍射數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)收集采用回?cái)[法。

    衍射數(shù)據(jù)收集完成后,使用HKL2000軟件包[30]處理。采用分子置換法解析相位,依次用CCP4軟件包[31]中scalepack2mtz、matthews_coef、phaser_M(jìn)R用搜索模型進(jìn)行分子置換,找到對(duì)應(yīng)的解。隨后在PHENIX軟件包[32]中使用phenix.refine中剛體修正、擬退火修的測(cè)率進(jìn)行修正。在COOT[33]中根據(jù)對(duì)應(yīng)的電子密度圖進(jìn)行手動(dòng)的搭建與修正,并用phenix.refine進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過(guò)多輪的手動(dòng)搭建和軟件優(yōu)化確定最終的結(jié)構(gòu)模型。最終根據(jù)R-work值和R-free值來(lái)評(píng)價(jià)模型搭建的質(zhì)量并使用PROCHECK[34]來(lái)確定二面角等立體化學(xué)參數(shù)是否合理。

    GST Pull-down實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)于NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響,將有GST融合標(biāo)簽的 NF2蛋白 GST-NF2 513-595、GST-NF2 513-595 S518D作為餌蛋白,與不含GST標(biāo)簽的靶蛋白(NF2 18~344)按照1∶10的摩爾比混合。結(jié)合緩沖液成分為20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),110 mmol/L NaCl,體積分?jǐn)?shù)分別為0.3%的Triton X-100和5%的甘油。4℃孵育2 h,12 000×g離心2 min后將上清與10μL用結(jié)合緩沖液平衡過(guò)的GST柱材混合孵育1 h。用緩沖液清洗GST柱材4~5次,用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)合情況。

    體外熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響,將供體CFP熒光蛋白融合于NF2蛋白的N端,受體YFP熒光蛋白融合于蛋白的C端,檢測(cè)NF2蛋白的熒光強(qiáng)度。CFP、YFP熒光蛋白距離在10 nm以內(nèi)時(shí),CFP被激發(fā)后的發(fā)射光與YFP吸收光光譜重疊,因而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,供體CFP的熒光強(qiáng)度會(huì)大大降低,僅可檢測(cè)到Y(jié)FP發(fā)射光;若YFP與CFP相距較遠(yuǎn),則YFP無(wú)法吸收CFP的發(fā)射光,因而只能檢測(cè)到CFP的發(fā)射光。

    實(shí)驗(yàn)組為融合有CFP和YFP的NF2蛋白,陰性對(duì)照組使用終濃度0.1%的SDS處理(使蛋白變性而構(gòu)象開(kāi)放),以430 nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)CFP并測(cè)量455~600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的數(shù)值,每個(gè)孔的數(shù)值由Synergy4酶標(biāo)儀讀取,數(shù)據(jù)使用軟件Microsoft Office Excel處理。

    結(jié) 果

    NF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以往研究結(jié)果表明,NF2蛋白第518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2的構(gòu)象及生物功能均有重要影響。本研究采用518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼嵋阅MS518磷酸化狀態(tài)的策略,設(shè)計(jì)了用于晶體篩選、GST Pull-down實(shí)驗(yàn)和FRET實(shí)驗(yàn)的不同重組質(zhì)粒(表3)。

    表3 用于不同實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒Tab 3 Recombinant plasmids designed for different experimental purposes

    NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 經(jīng)過(guò)對(duì)緩沖液pH、鹽濃度、添加劑以及純化方式的反復(fù)優(yōu)化,本研究最終選取Ni2+親和層析-陰離子交換柱層析-凝膠過(guò)濾層析的純化策略,各種緩沖液成分如下:

    裂解緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl (pH =8.0),300 mmol/L NaCl;洗滌緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl (pH =8.0),300 mmol/L NaCl,25 mmol/L 咪唑;洗脫緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),300 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑;離子交換層析緩沖液 A:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),2 mmol/L DTT;離子交換層析緩沖液B:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),1 mol/L NaCl,2 mmol/L DTT;凝膠過(guò)濾層析緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),150 mmol/L NaCl,及 2 mmol/L的DTT。

    Ni2+-NTA對(duì)NF2-N蛋白有較強(qiáng)的吸附性,3C酶切除 His-GST標(biāo)簽。蛋白樣品上樣電導(dǎo)4.5 ms/cm,鹽濃度線性梯度洗脫時(shí),該蛋白的紫外吸收峰出現(xiàn)在電導(dǎo)12 ms/cm處,SDS-PAGE檢測(cè)樣品較為純凈。凝膠過(guò)濾層析后得到性質(zhì)較好、純度較高的蛋白樣品。

    NF2WT和NF2S518D蛋白用于晶體的篩選。點(diǎn)突變后的NF2蛋白性質(zhì)并未發(fā)生明顯的變化。Ni2+親和層析后,3C酶切過(guò)夜除去His-GST標(biāo)簽。離子交換層析時(shí),兩種蛋白均在電導(dǎo)23 ms/cm處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白峰。用于FRET實(shí)驗(yàn)的FRET-NF2WT(CFP-NF2 18-595-YFP)和 FRET-NF2S518D(CFPNF2 18-595 S518D-YFP)使用凝膠過(guò)濾層析純化。

    NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 分別使用純度和濃度均較高的NF2WT和NF2S518D蛋白樣品,依照前文所述方法,用576個(gè)商業(yè)化初篩條件篩選。最終兩種蛋白晶體均在18℃、體積分?jǐn)?shù)為10%的異丙醇、0.1 mol/L Tris(pH=8.5)的條件下產(chǎn)生。根據(jù)初始結(jié)晶條件,分別調(diào)整沉淀劑異丙醇的濃度(8%、10%、12%、14%)和緩沖液的pH(8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0),最終得到的晶體呈粗棒狀(圖1),經(jīng)慢平衡防凍處理后凍于液氮中保存。防凍液條件為體積分?jǐn)?shù)10%的異丙醇,0.1 mol/L Tris(pH=8.5),體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油。

    圖1 NF2WT和NF2S518D的晶體照片F(xiàn)ig 1 Crystals of NF2WT and NF2S518D

    NF2晶體數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析 晶體衍射數(shù)據(jù)在上海同步輻射光源(SSRF)BL17U線站收集。衍射數(shù)據(jù)用HKL2000軟件包進(jìn)行處理,NF2WT和NF2S518D晶體最終衍射分辨率分別為3.60?和3.90?(圖2)。

    由于同家族蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已有報(bào)道,本課題采用FERM結(jié)構(gòu)域(PDB:1ISN)作為模型進(jìn)行分子置換。NF2WT和NF2S518D晶體的一個(gè)不對(duì)稱單位均含有一個(gè)分子。采用上文所述方法對(duì)結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化,數(shù)據(jù)收集、處理與結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

    圖2 NF2WT和NF2S518D的晶體衍射圖及局部放大圖Fig 2 X-ray diffraction pattern and enlarged images from crystals of NF2WT and NF2S518D

    NF2蛋白的C-端在結(jié)晶過(guò)程中發(fā)生降解 結(jié)構(gòu)中顯示的氨基酸殘基序列為20-361,其整體結(jié)構(gòu)如圖3A/B所示,兩個(gè)結(jié)構(gòu)均由FERM結(jié)構(gòu)域和一段延伸在外的α螺旋組成。與以往文獻(xiàn)[35-36]所述相似,F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域由3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成(圖3C):第1個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與泛素蛋白相似,由5條β折疊和1條α螺旋組成;第2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與乙酰輔酶A結(jié)合蛋白相似,由4個(gè)α螺旋組成;第3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域則與PTB結(jié)構(gòu)域相似,由1對(duì)正交的反向平行β折疊和1條α螺旋組成。

    圖3 NF2WT和NF2S518D的晶體結(jié)構(gòu)及FERM結(jié)構(gòu)域示意圖Fig 3 Crystal structures and FERM domain of NF2WT and NF2S518D

    對(duì)兩種蛋白的晶體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩者均有降解,且主帶對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)與20-361片段的(Mr)接近。同樣地,純化好的NF2蛋白樣品也發(fā)生了不同程度的降解(圖4A、B)。根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果(圖4C),NF2蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域十分保守,NF2結(jié)構(gòu)中延伸在外的α螺旋也較為保守,而其C端氨基酸序列則并不保守。實(shí)驗(yàn)證明,正是這段不保守的區(qū)域發(fā)生了降解。518位絲氨酸所在的C端蛋白片段并未出現(xiàn)在所解析結(jié)構(gòu)中,可能是蛋白自身性質(zhì)所造成的降解導(dǎo)致的,本課題未能成功解析2個(gè)蛋白的18~595序列的完整結(jié)構(gòu)。

    圖4 NF2晶體及蛋白樣品SDS-PAGE圖與NF2蛋白序列比對(duì)Fig 4 SDS-PAGE of NF2crystals and proteins versus sequence alignment of NF2family proteins

    NF2蛋白FERM結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域相似 通過(guò)NF2WT結(jié)構(gòu)與NF2S518D結(jié)構(gòu)的比對(duì)(圖5A),發(fā)現(xiàn)兩者的分子構(gòu)象相似,因而后續(xù)結(jié)構(gòu)比對(duì)僅使用NF2WT的結(jié)構(gòu)。將本研究中所解析的結(jié)構(gòu)NF2WT分別與已有的人源NF2 FERM 結(jié)構(gòu)域(PDB:1H4R)、鼠源 Merlin FERM結(jié)構(gòu)(PDB:1ISN)、人源 MOESIN部分結(jié)構(gòu)(PDB:1E5 W)分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)(圖5B~D)。NF2WT的結(jié)構(gòu)較之人源FERM結(jié)構(gòu)域,其C端多一段向外延伸的α螺旋;與鼠源Merlin FERM結(jié)構(gòu)域構(gòu)象相似,C末端α螺旋長(zhǎng)度不同,且其走向稍有不同;與人源MOESIN的FERM結(jié)構(gòu)域、C末端α螺旋構(gòu)象基本相似。

    表4 NF2WT和NF2S518D蛋白晶體數(shù)據(jù)處理及結(jié)構(gòu)解析參數(shù)Tab 4 Statistics of data collection,processing and refinement

    綜上所述,NF2蛋白N端的FERM結(jié)構(gòu)域蛋白序列保守,三維結(jié)構(gòu)亦與該家族中其他蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域相似,C末端α螺旋結(jié)構(gòu)走向一致,提示該螺旋在NF2結(jié)構(gòu)中的保守性,可能對(duì)C端結(jié)構(gòu)域的走向起重要作用。

    體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模擬磷酸化突變體調(diào)節(jié)NF2相互作用 采用GST Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究NF2 N端和C端的相互作用。SDS-PAGE顯示(圖6),N端蛋白NF2-N與GST并無(wú)非特異性的結(jié)合,GST-NF2WT蛋白和GST-NF2S518D蛋白均可與N端序列有較強(qiáng)的結(jié)合,然而,在相同的蛋白用量時(shí),GST-NF2S518D蛋白較 GST-NF2WT蛋白可以結(jié)合更多的NF2-N蛋白。該結(jié)果提示518位絲氨酸磷酸化后,NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合可能更加緊密,分子內(nèi)相互作用更強(qiáng),因而NF2S518D的構(gòu)象呈“閉合”狀態(tài),無(wú)模擬磷酸化突變的NF2相對(duì)而言呈“開(kāi)放”構(gòu)象。

    圖5 NF2的結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig 5 Structure alignment of NF2proteins

    圖6 GST Pull-down的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 6 SDS-PAGE result of GST Pull-down assay

    FRET檢測(cè)磷酸化模擬突變?cè)斐傻腘F2內(nèi)部構(gòu)象變化 為了進(jìn)一步研究NF2蛋白分子內(nèi)相互作用,我們開(kāi)展了FRET實(shí)驗(yàn)。由標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)生成的圖顯示(圖7),在激發(fā)光的作用下,經(jīng)SDS變性解鏈的 FRET-NF2WT和 FRET-NF2S518D均未檢測(cè)到FRET信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)組中,相較FRET-NF2WT而言,F(xiàn)RET-NF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào),即CFP和YFP距離更為接近。該結(jié)果與上文所述GST Pull-down結(jié)果一致,進(jìn)一步表明:518位絲氨酸被磷酸化的NF2蛋白N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明,NF2的518位絲氨酸被磷酸化后,蛋白處于“閉合”構(gòu)象,與最新的研究結(jié)果[28]一致。

    圖7 FRET標(biāo)準(zhǔn)化曲線Fig 7 Standardized curve of FRET

    討 論

    NF2是由抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì),NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐偷陌l(fā)生。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),NF2蛋白的異??赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生,且其參與眾多體內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)途徑如Hippo信號(hào)途徑的調(diào)控。自1997年至2012年以來(lái),多項(xiàng)研究認(rèn)為,有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的NF2為“閉合”構(gòu)象,即N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合,而518位磷酸化后失活的NF2分子內(nèi)相互作用變?nèi)酰省伴_(kāi)放”構(gòu)象。直至2012年有研究提出并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了完全相反的結(jié)論。

    為了澄清磷酸化對(duì)NF2調(diào)節(jié)構(gòu)象變化的機(jī)制,本研究構(gòu)建了野生型NF2WT和模擬518位絲氨酸組成型磷酸化的突變型NF2S518D兩種重組質(zhì)粒,并對(duì)兩者進(jìn)行了表達(dá)純化和晶體的篩選,希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段,從原子水平解讀NF2蛋白的構(gòu)象變化方式,對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出更為直觀的解釋。除此之外,本研究進(jìn)一步采用體外Pull-down實(shí)驗(yàn)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),檢測(cè)兩種NF2蛋白的分子內(nèi)相互作用,進(jìn)而從生化水平驗(yàn)證兩種蛋白的構(gòu)象變化,對(duì)結(jié)論給予佐證。

    實(shí)驗(yàn)證明,NF2蛋白與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域無(wú)論在序列還是結(jié)構(gòu)上均有很高的相似度。然而,其序列不保守的362~595段序列在純化與結(jié)晶的過(guò)程中均發(fā)生很大程度的降解,致使18~595段完整序列的結(jié)構(gòu)無(wú)法解析。解析出的部分結(jié)構(gòu)與人源或鼠源同家族蛋白的N-端FERM結(jié)構(gòu)域基本相似。

    由于無(wú)法從原子水平看到518位絲氨酸磷酸化前后NF2蛋白構(gòu)象的不同,本研究采用GST Pulldown及FRET的研究方法,在體外檢測(cè)NF2蛋白N端和C端的分子間相互作用強(qiáng)度,從側(cè)面求證蛋白內(nèi)部相互作用關(guān)系。GST Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:518位模擬磷酸化突變后,NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合更加緊密,分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。在FRET實(shí)驗(yàn)中,相較 FRET-NF2WT而言,F(xiàn)RETNF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào),即CFP和YFP距離更為接近,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步支持上述推斷:溶液狀態(tài)下的NF2蛋白在518位絲氨酸被磷酸化后,N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。

    綜上所述,處于活性狀態(tài)的NF2蛋白,其N端和C端分子內(nèi)相互作用強(qiáng)度較弱,蛋白質(zhì)整體呈“開(kāi)放”狀態(tài),而518位絲氨酸被磷酸化后,NF2蛋白活性喪失,此時(shí)分子內(nèi)相互作用較強(qiáng),蛋白質(zhì)處于“閉合”構(gòu)象,這與最新的研究結(jié)果一致[28]。今后的研究中,我們擬進(jìn)行突變體篩選以提高NF2蛋白自身穩(wěn)定性,避免其分子內(nèi)降解,有望從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度揭示NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化對(duì)其構(gòu)象調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

    致謝上海光源BL17U線站工作人員在晶體數(shù)據(jù)采集過(guò)程中提供了幫助。

    [1] Rouleau GA,Merel P,Lutchman M,et al.Alteration in a new gene encoding aputative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2[J].Nature,1993,363(6429):515-521.

    [2] Trofatter JA,MacCollin MM,Rutter JL,et al.A novel moesin-,ezrin-,radixin-like gene is a candidate for the neurofibromatosis 2 tumor suppressor[J].Cell,1993,72(5):791-800.

    [3] Bianchi AB,Hara T,Ramesh V,et al.Mutations in transcript isoforms of the neurofibromatosis 2 gene in multiple human tumour types[J].Nat Genet,1994,6(2):185-192.

    [4] Dalgliesh GL,F(xiàn)urge K,Greenman C,et al.Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes[J].Nature,2010,463(7279):360-363.

    [5] Lau YK,Murray LB,Houshmandi SS,et al.Merlin is a potent inhibitor of glioma growth[J].Cancer Res,2008,68(14):5733-5742.

    [6] Morrow KA,Das S,Metge BJ,et al.Loss of tumor suppressor Merlin in advanced breast cancer is due to post-translational regulation[J].J Biol Chem,2011,286(46):40376-40385.

    [7] Papi L,De Vitis LR,Vitelli F,et al.Somatic mutations in the neurofibromatosis type 2 gene in sporadic meningiomas[J].Hum Genet,1995,95(3):347-351.

    [8] Roche PH,Bouvier C,Chinot O,et al.Genesis and biology of vestibular schwannomas[J].Prog Neurol Surg,2008,21:24-31.

    [9] Rustgi AK,Xu L,Pinney D,et al.Neurofibromatosis 2 gene in human colorectal cancer[J].Cancer Genet Cytogenet,1995,84(1):24-26.

    [10] Gladden AB,Hebert AM,Schneeberger EE,et al.The NF2 tumor suppressor,Merlin,regulates epidermal development through the establishment of a junctional polarity complex[J].Dev Cell,2010,19(5):727-739.

    [11] Okada T,Lopez-Lago M,Giancotti FG.Merlin/NF-2 mediates contact inhibition of growth by suppressing recruitment of Rac to the plasma membrane[J].J Cell Biol,2005,171(2):361-371.

    [12] Yi C,Troutman S,F(xiàn)era D,et al.A tight junctionassociated Merlin-angiomotin complex mediates Merlin's regulation of mitogenic signaling and tumor suppressive functions[J].Cancer Cell,2011,19(4):527-540.

    [13] Angers S,Li T,Yi X,et al.Molecular architecture and assembly of the DDB1-CUL4A ubiquitin ligase machinery[J].Nature,2006,443(7111):590-593.

    [14] Kassmeier MD,Mondal K,Palmer VL,et al.VprBP binds full-length RAG1 and is required for B-cell development and V(D)J recombination fidelity[J].EMBO J,2012,31(4):945-958.

    [15] Kaur M,Khan MM,Kar A,et al.CRL4-DDB1-VPRBP ubiquitin ligase mediates the stress triggered proteolysis of Mcm10[J].Nucleic Acids Res,2012,40(15):7332-7346.

    [16] Kim K,Heo K,Choi J,et al.Vpr-binding protein antagonizes p53-mediated transcription via direct interaction with H3 tail[J].Mol Cell Biol,2012,32(4):783-796.

    [17] Kressel M,Schmucker B.Nucleocytoplasmic transfer of the NF2 tumor suppressor protein merlin is regulated by exon 2 and a CRM1-dependent nuclear export signal in exon 15[J].Hum Mol Genet,2002,11(19):2269-2278.

    [18] Lee JM,Lee JS,Kim H,et al.EZH2 generates a methyl degron that is recognized by the DCAF1/DDB1/CUL4 E3 ubiquitin ligase complex[J].Mol Cell,2012,48(4):572-586.

    [19] Li W,You L,Cooper J,et al.Merlin/NF2 suppresses tumorigenesis by inhibiting the E3 ubiquitin ligase CRL4(DCAF1)in the nucleus[J].Cell,2010,140(4):477-490.

    [20] Tamori Y,Bialucha CU,Tian AG,et al.Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition[J].PLoS Biol,2010,8(7):e1000422.

    [21] Yu C,Zhang YL,Pan WW,et al.CRL4 complex regulates mammalian oocyte survival and reprogramming by activation of TET proteins[J].Science,2013,342(6165):1518-1521.

    [22] Li W,Cooper J,Zhou L,et al.Merlin/NF2 loss-driven tumorigenesis linked to CRL4 (DCAF1)-mediated inhibition of the hippo pathway kinases Lats1 and 2in the nucleus[J].Cancer Cell,2014,26(1):48-60.

    [23] Yin F,Yu J,Zheng Y,et al.Spatial organization of Hippo signaling at the plasma membrane mediated by the tumor suppressor Merlin/NF2[J].Cell,2013,154(6):1342-1355.

    [24] Bretscher A,Edwards K,F(xiàn)ehon RG.ERM proteins and merlin:integrators at the cell cortex[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(8):586-599.

    [25] Rong R,Surace EI,Haipek CA,et al.Serine 518 phosphorylation modulates merlin intramolecular association and binding to critical effectors important for NF2 growth suppression[J].Oncogene,2004,23(52):8447-8454.

    [26] Stamenkovic I,Yu Q.Merlin,a"magic"linker between extracellular cues and intracellular signaling pathways that regulate cell motility,proliferation,and survival[J].Curr Protein Pept Sci,2010,11(6):471-484.

    [27] Sherman L,Xu HM,Geist RT,et al.Interdomain binding mediates tumor growth suppression by the NF2 gene product[J].Oncogene,1997,15(20):2505-2509.

    [28] Sher I,Hanemann CO,Karplus PA,et al.The tumor suppressor merlin controls growth in its open state,and phosphorylation converts it to a less-active more-closed state[J].Dev Cell,2012,22(4):703-705.

    [29] Surace EI,Haipek CA,Gutmann DH.Effect of merlin phosphorylation on neurofibromatosis 2 (NF2)gene function[J].Oncogene,2004,23(2):580-587.

    [30] Otwinowski Z,Minor W.Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode[J].Methods Enzymol,1997,276(1):307-326.

    [31] Winn MD,Ballard CC,Cowtan KD,et al.Overview of the CCP4 suite and current developments [J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2011,67(Pt 4):235-242.

    [32] Adams PD,Afonine PV,Bunkoczi G,et al.PHENIX:a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution [J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010,66(Pt 2):213-221.

    [33] Emsley P,Lohkamp B,Scott WG,et al.Features and development of Coot[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010,66(Pt 4):486-501.

    [34] Laskowski RA,MacArthur MW,Moss DS,et al.PROCHECK:aprogram to check the stereochemical quality of protein structures[J].J Appl Crystallogr,1993,26(2):283-291.

    [35] Hamada K,Shimizu T,Matsui T,et al.Structural basis of the membrane-targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain[J].EMBO J,2000,19(17):4449-4462.

    [36] Kang BS,Cooper DR,Devedjiev Y,et al.The structure of the FERM domain of merlin,the neurofibromatosis type 2 gene product[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2002,58(Pt 3):381-391.

    猜你喜歡
    絲氨酸構(gòu)象緩沖液
    D-絲氨酸與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究進(jìn)展
    D-絲氨酸在抑郁癥中的作用研究進(jìn)展
    富硒酵母對(duì)長(zhǎng)期缺硒和正常大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    一種一枝黃花內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的計(jì)算研究
    玉米麩質(zhì)阿拉伯木聚糖在水溶液中的聚集和構(gòu)象
    Cu2+/Mn2+存在下白花丹素對(duì)人血清白蛋白構(gòu)象的影響
    2種緩沖液對(duì)血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對(duì)比研究
    修飾改性β-葡聚糖溶液構(gòu)象研究進(jìn)展
    国产精品秋霞免费鲁丝片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成在线人永久免费视频| 交换朋友夫妻互换小说| 黄频高清免费视频| 天天添夜夜摸| 一级,二级,三级黄色视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 天天添夜夜摸| 18美女黄网站色大片免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 香蕉丝袜av| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品美女久久av网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 精品电影一区二区在线| 老司机在亚洲福利影院| 精品国产亚洲在线| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 欧美日韩亚洲高清精品| 18禁观看日本| 三上悠亚av全集在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一本综合久久免费| 国产亚洲欧美98| 久久久久久久精品吃奶| 国产黄色免费在线视频| 国产成人欧美在线观看| av天堂久久9| 黄色毛片三级朝国网站| 一本大道久久a久久精品| 国产精品99久久99久久久不卡| 多毛熟女@视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 两个人看的免费小视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 水蜜桃什么品种好| 女同久久另类99精品国产91| 日韩欧美国产一区二区入口| 两个人免费观看高清视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 十八禁人妻一区二区| 美女 人体艺术 gogo| 另类亚洲欧美激情| 日本五十路高清| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 丰满的人妻完整版| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产男靠女视频免费网站| 在线观看66精品国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩黄片免| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲熟妇熟女久久| 国产国语露脸激情在线看| 黄色 视频免费看| 国产高清videossex| 在线天堂中文资源库| 又紧又爽又黄一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 两人在一起打扑克的视频| 88av欧美| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲 国产 在线| 1024视频免费在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 满18在线观看网站| 亚洲人成77777在线视频| 国产一卡二卡三卡精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩av在线大香蕉| 国产精品99久久99久久久不卡| 两性夫妻黄色片| 美女 人体艺术 gogo| 中文字幕最新亚洲高清| 岛国在线观看网站| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩三级视频一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 淫秽高清视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 热re99久久精品国产66热6| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美免费精品| av视频免费观看在线观看| 久久国产精品影院| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲国产精品sss在线观看 | 丝袜人妻中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| 精品人妻1区二区| 久久久久久人人人人人| 一本综合久久免费| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产看品久久| 免费在线观看完整版高清| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 性欧美人与动物交配| 又大又爽又粗| 成人亚洲精品av一区二区 | 久久天堂一区二区三区四区| 国产成年人精品一区二区 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 一区二区三区激情视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩三级视频一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 美女 人体艺术 gogo| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美中文综合在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 999精品在线视频| 亚洲片人在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产高清videossex| 老司机亚洲免费影院| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲国产精品合色在线| 成人三级黄色视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品久久蜜臀av无| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 12—13女人毛片做爰片一| 精品国产美女av久久久久小说| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 超色免费av| 欧美色视频一区免费| 咕卡用的链子| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品影院6| 欧美乱妇无乱码| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av电影中文网址| 99国产精品一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 在线永久观看黄色视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲视频免费观看视频| 99久久人妻综合| 免费在线观看完整版高清| 人成视频在线观看免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 久久精品国产综合久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av成人一区二区三| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩黄片免| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品av久久久久免费| 麻豆国产av国片精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 正在播放国产对白刺激| 女人精品久久久久毛片| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| √禁漫天堂资源中文www| 免费在线观看日本一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久亚洲真实| 后天国语完整版免费观看| 人人澡人人妻人| 久久国产精品影院| 日本 av在线| 大型av网站在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜免费成人在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日韩有码中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产激情欧美一区二区| 99久久人妻综合| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久久久大精品| x7x7x7水蜜桃| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费高清视频大片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品一区av在线观看| 香蕉丝袜av| 国产亚洲欧美98| 热re99久久国产66热| 波多野结衣高清无吗| 国产免费现黄频在线看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品福利观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| www.www免费av| 免费av中文字幕在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女之事视频高清在线观看| 人妻久久中文字幕网| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 香蕉国产在线看| 一级毛片女人18水好多| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲第一青青草原| 午夜免费激情av| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费不卡黄色视频| 亚洲色图av天堂| 久久亚洲精品不卡| 日韩人妻精品一区2区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品二区激情视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一级黄色大片毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黄片大片在线免费观看| 人人澡人人妻人| 热re99久久国产66热| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品免费一区二区三区在线| 久99久视频精品免费| 午夜老司机福利片| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av成人一区二区三| 在线永久观看黄色视频| 人人妻人人澡人人看| 黑人操中国人逼视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本五十路高清| 国产精品av久久久久免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜免费鲁丝| 黄片播放在线免费| 黄色 视频免费看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲人成电影免费在线| 99国产精品一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕高清在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美激情高清一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 黄色 视频免费看| 国产一区二区三区综合在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 最新美女视频免费是黄的| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲九九香蕉| 99久久综合精品五月天人人| 又黄又粗又硬又大视频| 国产主播在线观看一区二区| 青草久久国产| 热re99久久国产66热| 美女午夜性视频免费| 视频在线观看一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 在线观看一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 久久久国产成人精品二区 | 中文欧美无线码| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲午夜理论影院| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 久久 成人 亚洲| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 露出奶头的视频| 国产97色在线日韩免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久香蕉国产精品| 日本vs欧美在线观看视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲专区国产一区二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 不卡一级毛片| av在线天堂中文字幕 | 黄片大片在线免费观看| 丝袜美足系列| 日本欧美视频一区| 欧美日韩视频精品一区| 久久久国产一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 搡老乐熟女国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| cao死你这个sao货| 中文字幕高清在线视频| 精品人妻在线不人妻| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美中文综合在线视频| 97人妻天天添夜夜摸| 天天影视国产精品| 一二三四社区在线视频社区8| 丰满饥渴人妻一区二区三| 男女下面进入的视频免费午夜 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 99国产精品免费福利视频| av网站免费在线观看视频| 久久草成人影院| 成年版毛片免费区| 国产野战对白在线观看| 日本免费a在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 麻豆一二三区av精品| 女同久久另类99精品国产91| 午夜a级毛片| 免费高清在线观看日韩| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产激情欧美一区二区| ponron亚洲| 男女午夜视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 一级作爱视频免费观看| 我的亚洲天堂| 两个人看的免费小视频| 69精品国产乱码久久久| 大香蕉久久成人网| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一区在线观看完整版| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品人妻1区二区| 成年人免费黄色播放视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久久久久午夜电影 | 男女床上黄色一级片免费看| 国产成年人精品一区二区 | 欧美成人性av电影在线观看| www.999成人在线观看| 黄片大片在线免费观看| x7x7x7水蜜桃| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看免费高清a一片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 一级片'在线观看视频| 欧美久久黑人一区二区| www.精华液| 久久人妻av系列| 欧美精品亚洲一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 日韩大码丰满熟妇| 黄片播放在线免费| 男男h啪啪无遮挡| 日日爽夜夜爽网站| av网站在线播放免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲三区欧美一区| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产一区二区激情短视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 多毛熟女@视频| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲国产精品合色在线| 91在线观看av| 99国产精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 国产精品九九99| 久久草成人影院| 亚洲精品久久午夜乱码| 不卡一级毛片| 天堂√8在线中文| 极品人妻少妇av视频| 日韩国内少妇激情av| 日韩免费高清中文字幕av| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲伊人色综图| 国产在线观看jvid| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 麻豆国产av国片精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线观看www视频免费| 激情在线观看视频在线高清| 老司机深夜福利视频在线观看| 9热在线视频观看99| 欧美精品亚洲一区二区| 日本五十路高清| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 久99久视频精品免费| 国产成人av激情在线播放| 国产精品免费视频内射| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美一级毛片孕妇| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日韩乱码在线| 最新美女视频免费是黄的| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产深夜福利视频在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 91成年电影在线观看| 高清在线国产一区| 国产在线观看jvid| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 不卡一级毛片| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品二区激情视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产又爽黄色视频| 高清在线国产一区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 搡老熟女国产l中国老女人| а√天堂www在线а√下载| 黄色成人免费大全| 中文字幕人妻熟女乱码| 丁香欧美五月| xxx96com| 淫秽高清视频在线观看| 9热在线视频观看99| 成人手机av| 999久久久国产精品视频| 极品人妻少妇av视频| 一a级毛片在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产人伦9x9x在线观看| 成人免费观看视频高清| 美女国产高潮福利片在线看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 91国产中文字幕| 欧美成人午夜精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 波多野结衣av一区二区av| 国产成人欧美在线观看| av天堂在线播放| 极品人妻少妇av视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩高清综合在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 大码成人一级视频| 不卡一级毛片| 极品教师在线免费播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜视频精品福利| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 最新在线观看一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 中文字幕高清在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品永久免费网站| 国产精品九九99| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美在线一区亚洲| 激情视频va一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 精品一品国产午夜福利视频| 黑人猛操日本美女一级片| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 乱人伦中国视频| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 深夜精品福利| 亚洲免费av在线视频| 18禁观看日本| 三级毛片av免费| 午夜激情av网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | aaaaa片日本免费| 亚洲专区国产一区二区| 欧美日韩黄片免| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色怎么调成土黄色| 搡老岳熟女国产| 成年女人毛片免费观看观看9| 黄色成人免费大全| 香蕉丝袜av| 精品国产国语对白av| 精品国产美女av久久久久小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 自线自在国产av| 69精品国产乱码久久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品高清国产在线一区| 日韩视频一区二区在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 青草久久国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 精品久久久久久电影网| 黄色女人牲交| 欧美中文综合在线视频| 露出奶头的视频| 欧美成人午夜精品| 一级作爱视频免费观看| 亚洲少妇的诱惑av| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲午夜理论影院| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久久国产成人精品二区 | 国产亚洲欧美精品永久| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品福利观看| 国产成人影院久久av| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久久久久免费视频了| 午夜亚洲福利在线播放| a级毛片黄视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品一区二区在线不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91精品国产国语对白视频| av在线天堂中文字幕 | 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产欧美网| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| a级毛片在线看网站| 在线观看www视频免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久热爱精品视频在线9| 超色免费av| 99re在线观看精品视频| 丁香六月欧美| 又大又爽又粗| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 丝袜美足系列| 久久久久久久精品吃奶| 精品国产亚洲在线| 99在线视频只有这里精品首页| 波多野结衣av一区二区av| 成人18禁在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 免费在线观看日本一区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 99国产精品99久久久久| 欧美日韩乱码在线| 九色亚洲精品在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美乱色亚洲激情| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久精品91蜜桃| 18美女黄网站色大片免费观看| 少妇粗大呻吟视频|