NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化狀態(tài)對(duì)其分子內(nèi)相互作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物化學(xué)研究

鞏 微 徐海鳴 孫 昶 徐彥輝 李 澤 王 平

（復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032）

NF2是由位于22號(hào)染色體上的抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì)，NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐停╪eurofibromatosis type 2，NF2）的發(fā)生［1－2］。研究發(fā)現(xiàn)，NF2蛋白的異?？赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生［3－9］。目前的研究表明，NF2可以在細(xì)胞質(zhì)中以及細(xì)胞核中發(fā)揮不同功能。在成角質(zhì)細(xì)胞和皮膚上皮中，NF2可以被招募到α－catenin處并促進(jìn)α－catenin與Par3（pulmonary adenoma resistance 3）的相互結(jié)合，起到幫助黏附連接成熟的作用［10］。在緊密連接處，NF2通過(guò)與血管動(dòng)蛋白結(jié)合釋放Rich（GTPaseRac激活蛋白）來(lái)使Rac失活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的接觸抑制進(jìn)而減弱有絲分裂信號(hào)，甚至可能有抑制腫瘤的作用［11－12］。在細(xì)胞核內(nèi)，NF2可以與CRL4DCAF1結(jié)合并抑制其E3泛素連接酶活性，因?yàn)镃RL4DCAF1可以調(diào)節(jié)許多與轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳有關(guān)的蛋白質(zhì)，NF2被認(rèn)為在進(jìn)入細(xì)胞核后可以對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［13－21］。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)，NF2還可以通過(guò) CRL4DCAF1調(diào)控 Lats1／2［22］（large tumor suppressor kinase 1）或直接調(diào)控 Lats1／2［23］，達(dá)到調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路活性的目的。

NF2與 ERM（Ezrin，Radixin，Moesin）蛋白為同源蛋白，均屬于Band 4．1超級(jí)家族［24］。這4種蛋白質(zhì)的 N－端均有一個(gè) FERM（Four－point one，Ezrin，Radixin，Moesin）結(jié)構(gòu)域，C－端為一段親水的尾巴，其間為coiled coil結(jié)構(gòu)。這類蛋白質(zhì)生物活性的調(diào)控可通過(guò)其分子內(nèi)相互作用的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。與ERM蛋白相似，NF2特定位點(diǎn)的氨基酸被磷酸化后，其活性狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，如NF2 C－端第518位絲氨酸可以被激活后的 PAK（P21－activated kinase）磷酸化，導(dǎo)致其分子內(nèi)相互作用改變從而使蛋白失活［25］。雖然NF2活性的調(diào)節(jié)方式已經(jīng)被研究得十分清楚，但是由于缺少全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，目前仍無(wú)法從原子水平證實(shí)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制。

在NF2的十余種亞型中，關(guān)于NF2－1和NF2－2兩種亞型的研究最多，其中NF2－1為主要表達(dá)的亞型（以下均稱 NF2）［26］。自1997年起，多項(xiàng)研究認(rèn)為，NF2－2不具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性，且其N端的FERM結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)相互作用很弱，即其構(gòu)象一直處于“開(kāi)放”狀態(tài)；有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性的 NF2與之相反，為“閉合”構(gòu)象，即 N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合，而失活的NF2為“開(kāi)放”構(gòu)象［25，27］。而較新的研究結(jié)果恰與此相反，研究認(rèn)為，518位絲氨酸未被磷酸化的NF2與NF2－2均處于“開(kāi)放”的構(gòu)象，且具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，而518位絲氨酸被磷酸化從而失活的NF2則處于“閉合”構(gòu)象［28］。

有研究表明，NF2的518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼岷罂梢阅M該位點(diǎn)的組成型磷酸化，且NF2不再具有正常的抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能［29］?；谝陨媳尘?，本研究對(duì)野生型NF2WT和突變型NF2S518D（518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔┻M(jìn)行了表達(dá)與純化，希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段，直接觀察兩種NF2的構(gòu)象，進(jìn)一步通過(guò)體外Pull－down實(shí)驗(yàn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NF2的分子內(nèi)相互作用，對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出解釋。

材料和方法

材料來(lái)源 NF2全長(zhǎng)cDNA由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院MCB實(shí)驗(yàn)室管坤良教授饋贈(zèng)；CFP和YFP熒光蛋白基因由華東理工大學(xué)楊弋教授提供；大腸埃希菌Top10和BL21（DE3）感受態(tài)菌株、原核表達(dá)載體pGEX6p－1－His、用于FRET實(shí)驗(yàn)的載體pET28－FRET、3C蛋白酶等均由本實(shí)驗(yàn)室制備；PCR引物購(gòu)自Invitrogen公司；Phanta DNA聚合酶購(gòu)自諾唯贊生物公司；KOD plus DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；膠回收、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；蛋白純化使用層析柱及柱材均購(gòu)自GE Healthcare公司；結(jié)晶初篩商業(yè)試劑盒分別購(gòu)自Hampton Research公司和Emerald BioStructures公司；各類試劑分別購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、AMRESCO公司、Sigma公司。

野生型NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 全長(zhǎng)NF2共有595個(gè)氨基酸。通過(guò)Gene Runner軟件分析cDNA序列并設(shè)計(jì)PCR引物（表1）。以人源NF2 cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收DNA片段，使用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)DNA片段及載體進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。片段和載體用T4酶連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中，在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng)，挑取單克隆以PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)DNA測(cè)序的方法（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

表1 針對(duì)野生型NF2不同蛋白表達(dá)片段的引物序列Tab 1 Primers used for different protein expression in wild type NF2constructs

突變體NF2蛋白表達(dá)片段的構(gòu)建 將NF2的518位絲氨酸（Serine，S）突變?yōu)樘於彼幔ˋsp，D）以模擬518位絲氨酸的磷酸化狀態(tài)，重組蛋白稱為NF2S518D。以測(cè)序正確的野生型NF2重組質(zhì)粒為模板，用含有突變序列的PCR引物（表2）對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。用限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化模板質(zhì)粒，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Top10中，在含相應(yīng)抗生素的固體平板上培養(yǎng)，挑取單克隆通過(guò)DNA測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒的序列是否完全正確。

表2 用于突變體NF2結(jié)構(gòu)的引物序列Tab 2 Primers used in mutate NF2constructs

NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)，經(jīng)反復(fù)測(cè)試，使用2×YT培養(yǎng)基、低溫（15℃）誘導(dǎo)表達(dá)的條件下，蛋白產(chǎn)量較高、性質(zhì)較好。37℃培養(yǎng)至菌液的D值為0．6～0．8，降溫至15℃，加入終濃度1 mmol／L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，低溫培養(yǎng)16 h后收集菌體。菌體用裂解緩沖液充分重懸后高壓破碎，細(xì)菌裂解液使用高速離心機(jī)30 996×g低溫（4℃）離心40 min，收集上清液。接下來(lái)的步驟均在4℃冷庫(kù)中進(jìn)行。

將上清液緩緩?fù)ㄟ^(guò)Ni2＋親和層析柱，上樣完畢后，使用洗滌緩沖液沖走非特異性吸附的雜蛋白。向吸附了目的蛋白的柱內(nèi)加入1 mL濃度為0．5 mg／mL的3C蛋白酶，與柱材充分混勻，酶切過(guò)夜。不同的是，NF2 513－595和 NF2 513－595 S518D 為GST Pull－down的餌蛋白，親和層析后直接用洗脫緩沖液洗脫，進(jìn)行純化及緩沖條件的更換。

用洗脫緩沖液洗脫充分酶切后的蛋白，稀釋后使用AKTA Purifier蛋白純化儀進(jìn)行陰離子交換柱層析，用SDS－PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處的蛋白樣品，收集濃度較高且雜帶較少的蛋白樣品，濃縮至1 mL以內(nèi)。

利用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，同時(shí)更換緩沖液。用SDS－PAGE檢測(cè)紫外吸收峰處蛋白樣品，收集純度高的目的蛋白樣品濃縮至適合的濃度，分裝于1．5 mL離心管中，液氮速凍后保存于－80℃冰箱中備用。

NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 本研究采用氣相懸滴法篩選和優(yōu)化蛋白晶體，初篩使用商業(yè)化緩沖液（WizardⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件，Crystal screenⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件，Index 96個(gè)結(jié)晶條件，Salt 96個(gè)結(jié)晶條件，PEG／IonⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件，PEG／RxⅠ、Ⅱ96個(gè)結(jié)晶條件），將NF2 18～595蛋白、NF2 18～595 S518D蛋白（均為10 mg／mL）與池液1：1混合。晶體在4℃或者18℃恒溫箱內(nèi)生長(zhǎng)。3天后在倒置顯微鏡下觀察液滴內(nèi)是否有晶體長(zhǎng)出，篩選到質(zhì)量較好的晶體的初始生長(zhǎng)條件后，根據(jù)初始生長(zhǎng)條件分別對(duì)沉淀劑濃度、緩沖液pH進(jìn)行變動(dòng)，以上述相同方法篩選晶體。

對(duì)晶體進(jìn)行防凍處理時(shí)，防凍液成分為晶體生長(zhǎng)緩沖液加20%的甘油，采用慢平衡的方法處理，平衡好的晶體迅速轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

晶體數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析 在上海同步輻射光源SSRF－BL17U線站內(nèi)CentOS操作系統(tǒng)中運(yùn)行的Bluice控制系統(tǒng)控制收集晶體衍射數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)收集采用回?cái)[法。

衍射數(shù)據(jù)收集完成后，使用HKL2000軟件包［30］處理。采用分子置換法解析相位，依次用CCP4軟件包［31］中scalepack2mtz、matthews＿coef、phaser＿M(jìn)R用搜索模型進(jìn)行分子置換，找到對(duì)應(yīng)的解。隨后在PHENIX軟件包［32］中使用phenix．refine中剛體修正、擬退火修的測(cè)率進(jìn)行修正。在COOT［33］中根據(jù)對(duì)應(yīng)的電子密度圖進(jìn)行手動(dòng)的搭建與修正，并用phenix．refine進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過(guò)多輪的手動(dòng)搭建和軟件優(yōu)化確定最終的結(jié)構(gòu)模型。最終根據(jù)R－work值和R－free值來(lái)評(píng)價(jià)模型搭建的質(zhì)量并使用PROCHECK［34］來(lái)確定二面角等立體化學(xué)參數(shù)是否合理。

GST Pull－down實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)于NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響，將有GST融合標(biāo)簽的 NF2蛋白 GST－NF2 513－595、GST－NF2 513－595 S518D作為餌蛋白，與不含GST標(biāo)簽的靶蛋白（NF2 18～344）按照1∶10的摩爾比混合。結(jié)合緩沖液成分為20 mmol／L Tris－HCl（pH＝8．0），110 mmol／L NaCl，體積分?jǐn)?shù)分別為0．3%的Triton X－100和5%的甘油。4℃孵育2 h，12 000×g離心2 min后將上清與10μL用結(jié)合緩沖液平衡過(guò)的GST柱材混合孵育1 h。用緩沖液清洗GST柱材4～5次，用SDS－PAGE檢測(cè)結(jié)合情況。

體外熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2蛋白分子內(nèi)相互作用的影響，將供體CFP熒光蛋白融合于NF2蛋白的N端，受體YFP熒光蛋白融合于蛋白的C端，檢測(cè)NF2蛋白的熒光強(qiáng)度。CFP、YFP熒光蛋白距離在10 nm以內(nèi)時(shí)，CFP被激發(fā)后的發(fā)射光與YFP吸收光光譜重疊，因而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，供體CFP的熒光強(qiáng)度會(huì)大大降低，僅可檢測(cè)到Y(jié)FP發(fā)射光；若YFP與CFP相距較遠(yuǎn)，則YFP無(wú)法吸收CFP的發(fā)射光，因而只能檢測(cè)到CFP的發(fā)射光。

實(shí)驗(yàn)組為融合有CFP和YFP的NF2蛋白，陰性對(duì)照組使用終濃度0．1%的SDS處理（使蛋白變性而構(gòu)象開(kāi)放），以430 nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)CFP并測(cè)量455～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的數(shù)值，每個(gè)孔的數(shù)值由Synergy4酶標(biāo)儀讀取，數(shù)據(jù)使用軟件Microsoft Office Excel處理。

結(jié) 果

NF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以往研究結(jié)果表明，NF2蛋白第518位絲氨酸的磷酸化對(duì)NF2的構(gòu)象及生物功能均有重要影響。本研究采用518位絲氨酸突變?yōu)樘於彼嵋阅MS518磷酸化狀態(tài)的策略，設(shè)計(jì)了用于晶體篩選、GST Pull－down實(shí)驗(yàn)和FRET實(shí)驗(yàn)的不同重組質(zhì)粒（表3）。

表3 用于不同實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒Tab 3 Recombinant plasmids designed for different experimental purposes

NF2重組蛋白的表達(dá)與純化 經(jīng)過(guò)對(duì)緩沖液pH、鹽濃度、添加劑以及純化方式的反復(fù)優(yōu)化，本研究最終選取Ni2＋親和層析－陰離子交換柱層析－凝膠過(guò)濾層析的純化策略，各種緩沖液成分如下：

裂解緩沖液：50 mmol／L Tris－HCl （pH ＝8．0），300 mmol／L NaCl；洗滌緩沖液：50 mmol／L Tris－HCl （pH ＝8．0），300 mmol／L NaCl，25 mmol／L 咪唑；洗脫緩沖液：50 mmol／L Tris－HCl（pH＝8．0），300 mmol／L NaCl，250 mmol／L咪唑；離子交換層析緩沖液 A：20 mmol／L Tris－HCl（pH＝8．0），2 mmol／L DTT；離子交換層析緩沖液B：20 mmol／L Tris－HCl（pH＝8．0），1 mol／L NaCl，2 mmol／L DTT；凝膠過(guò)濾層析緩沖液：20 mmol／L Tris－HCl（pH＝8．0），150 mmol／L NaCl，及 2 mmol／L的DTT。

Ni2＋－NTA對(duì)NF2－N蛋白有較強(qiáng)的吸附性，3C酶切除 His－GST標(biāo)簽。蛋白樣品上樣電導(dǎo)4．5 ms／cm，鹽濃度線性梯度洗脫時(shí)，該蛋白的紫外吸收峰出現(xiàn)在電導(dǎo)12 ms／cm處，SDS－PAGE檢測(cè)樣品較為純凈。凝膠過(guò)濾層析后得到性質(zhì)較好、純度較高的蛋白樣品。

NF2WT和NF2S518D蛋白用于晶體的篩選。點(diǎn)突變后的NF2蛋白性質(zhì)并未發(fā)生明顯的變化。Ni2＋親和層析后，3C酶切過(guò)夜除去His－GST標(biāo)簽。離子交換層析時(shí)，兩種蛋白均在電導(dǎo)23 ms／cm處出現(xiàn)目標(biāo)蛋白峰。用于FRET實(shí)驗(yàn)的FRET－NF2WT（CFP－NF2 18－595－YFP）和 FRET－NF2S518D（CFPNF2 18－595 S518D－YFP）使用凝膠過(guò)濾層析純化。

NF2重組蛋白晶體的篩選和優(yōu)化 分別使用純度和濃度均較高的NF2WT和NF2S518D蛋白樣品，依照前文所述方法，用576個(gè)商業(yè)化初篩條件篩選。最終兩種蛋白晶體均在18℃、體積分?jǐn)?shù)為10%的異丙醇、0．1 mol／L Tris（pH＝8．5）的條件下產(chǎn)生。根據(jù)初始結(jié)晶條件，分別調(diào)整沉淀劑異丙醇的濃度（8%、10%、12%、14%）和緩沖液的pH（8．0、8．2、8．4、8．6、8．8、9．0），最終得到的晶體呈粗棒狀（圖1），經(jīng)慢平衡防凍處理后凍于液氮中保存。防凍液條件為體積分?jǐn)?shù)10%的異丙醇，0．1 mol／L Tris（pH＝8．5），體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油。

圖1 NF2WT和NF2S518D的晶體照片F(xiàn)ig 1 Crystals of NF2WT and NF2S518D

NF2晶體數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析 晶體衍射數(shù)據(jù)在上海同步輻射光源（SSRF）BL17U線站收集。衍射數(shù)據(jù)用HKL2000軟件包進(jìn)行處理，NF2WT和NF2S518D晶體最終衍射分辨率分別為3．60?和3．90?（圖2）。

由于同家族蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已有報(bào)道，本課題采用FERM結(jié)構(gòu)域（PDB：1ISN）作為模型進(jìn)行分子置換。NF2WT和NF2S518D晶體的一個(gè)不對(duì)稱單位均含有一個(gè)分子。采用上文所述方法對(duì)結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化，數(shù)據(jù)收集、處理與結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

圖2 NF2WT和NF2S518D的晶體衍射圖及局部放大圖Fig 2 X－ray diffraction pattern and enlarged images from crystals of NF2WT and NF2S518D

NF2蛋白的C－端在結(jié)晶過(guò)程中發(fā)生降解 結(jié)構(gòu)中顯示的氨基酸殘基序列為20－361，其整體結(jié)構(gòu)如圖3A／B所示，兩個(gè)結(jié)構(gòu)均由FERM結(jié)構(gòu)域和一段延伸在外的α螺旋組成。與以往文獻(xiàn)［35－36］所述相似，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域由3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成（圖3C）：第1個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與泛素蛋白相似，由5條β折疊和1條α螺旋組成；第2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與乙酰輔酶A結(jié)合蛋白相似，由4個(gè)α螺旋組成；第3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域則與PTB結(jié)構(gòu)域相似，由1對(duì)正交的反向平行β折疊和1條α螺旋組成。

圖3 NF2WT和NF2S518D的晶體結(jié)構(gòu)及FERM結(jié)構(gòu)域示意圖Fig 3 Crystal structures and FERM domain of NF2WT and NF2S518D

對(duì)兩種蛋白的晶體進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者均有降解，且主帶對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）與20－361片段的（Mr）接近。同樣地，純化好的NF2蛋白樣品也發(fā)生了不同程度的降解（圖4A、B）。根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果（圖4C），NF2蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域十分保守，NF2結(jié)構(gòu)中延伸在外的α螺旋也較為保守，而其C端氨基酸序列則并不保守。實(shí)驗(yàn)證明，正是這段不保守的區(qū)域發(fā)生了降解。518位絲氨酸所在的C端蛋白片段并未出現(xiàn)在所解析結(jié)構(gòu)中，可能是蛋白自身性質(zhì)所造成的降解導(dǎo)致的，本課題未能成功解析2個(gè)蛋白的18～595序列的完整結(jié)構(gòu)。

圖4 NF2晶體及蛋白樣品SDS－PAGE圖與NF2蛋白序列比對(duì)Fig 4 SDS－PAGE of NF2crystals and proteins versus sequence alignment of NF2family proteins

NF2蛋白FERM結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域相似 通過(guò)NF2WT結(jié)構(gòu)與NF2S518D結(jié)構(gòu)的比對(duì)（圖5A），發(fā)現(xiàn)兩者的分子構(gòu)象相似，因而后續(xù)結(jié)構(gòu)比對(duì)僅使用NF2WT的結(jié)構(gòu)。將本研究中所解析的結(jié)構(gòu)NF2WT分別與已有的人源NF2 FERM 結(jié)構(gòu)域（PDB：1H4R）、鼠源 Merlin FERM結(jié)構(gòu)（PDB：1ISN）、人源 MOESIN部分結(jié)構(gòu)（PDB：1E5 W）分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)（圖5B～D）。NF2WT的結(jié)構(gòu)較之人源FERM結(jié)構(gòu)域，其C端多一段向外延伸的α螺旋；與鼠源Merlin FERM結(jié)構(gòu)域構(gòu)象相似，C末端α螺旋長(zhǎng)度不同，且其走向稍有不同；與人源MOESIN的FERM結(jié)構(gòu)域、C末端α螺旋構(gòu)象基本相似。

表4 NF2WT和NF2S518D蛋白晶體數(shù)據(jù)處理及結(jié)構(gòu)解析參數(shù)Tab 4 Statistics of data collection，processing and refinement

綜上所述，NF2蛋白N端的FERM結(jié)構(gòu)域蛋白序列保守，三維結(jié)構(gòu)亦與該家族中其他蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域相似，C末端α螺旋結(jié)構(gòu)走向一致，提示該螺旋在NF2結(jié)構(gòu)中的保守性，可能對(duì)C端結(jié)構(gòu)域的走向起重要作用。

體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模擬磷酸化突變體調(diào)節(jié)NF2相互作用 采用GST Pull－down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究NF2 N端和C端的相互作用。SDS－PAGE顯示（圖6），N端蛋白NF2－N與GST并無(wú)非特異性的結(jié)合，GST－NF2WT蛋白和GST－NF2S518D蛋白均可與N端序列有較強(qiáng)的結(jié)合，然而，在相同的蛋白用量時(shí)，GST－NF2S518D蛋白較 GST－NF2WT蛋白可以結(jié)合更多的NF2－N蛋白。該結(jié)果提示518位絲氨酸磷酸化后，NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合可能更加緊密，分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)，因而NF2S518D的構(gòu)象呈“閉合”狀態(tài)，無(wú)模擬磷酸化突變的NF2相對(duì)而言呈“開(kāi)放”構(gòu)象。

圖5 NF2的結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig 5 Structure alignment of NF2proteins

圖6 GST Pull－down的SDS－PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 6 SDS－PAGE result of GST Pull－down assay

FRET檢測(cè)磷酸化模擬突變?cè)斐傻腘F2內(nèi)部構(gòu)象變化 為了進(jìn)一步研究NF2蛋白分子內(nèi)相互作用，我們開(kāi)展了FRET實(shí)驗(yàn)。由標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)生成的圖顯示（圖7），在激發(fā)光的作用下，經(jīng)SDS變性解鏈的 FRET－NF2WT和 FRET－NF2S518D均未檢測(cè)到FRET信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)組中，相較FRET－NF2WT而言，F(xiàn)RET－NF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào)，即CFP和YFP距離更為接近。該結(jié)果與上文所述GST Pull－down結(jié)果一致，進(jìn)一步表明：518位絲氨酸被磷酸化的NF2蛋白N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明，NF2的518位絲氨酸被磷酸化后，蛋白處于“閉合”構(gòu)象，與最新的研究結(jié)果［28］一致。

圖7 FRET標(biāo)準(zhǔn)化曲線Fig 7 Standardized curve of FRET

討 論

NF2是由抑癌基因NF2所編碼的蛋白質(zhì)，NF2基因的失活會(huì)造成神經(jīng)性纖維瘤?、蛐偷陌l(fā)生。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，NF2蛋白的異?？赡軐?dǎo)致散發(fā)性的許旺氏細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤以及腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生，且其參與眾多體內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)途徑如Hippo信號(hào)途徑的調(diào)控。自1997年至2012年以來(lái)，多項(xiàng)研究認(rèn)為，有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的NF2為“閉合”構(gòu)象，即N端FERM結(jié)構(gòu)域與C端尾巴緊密結(jié)合，而518位磷酸化后失活的NF2分子內(nèi)相互作用變?nèi)酰省伴_(kāi)放”構(gòu)象。直至2012年有研究提出并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了完全相反的結(jié)論。

為了澄清磷酸化對(duì)NF2調(diào)節(jié)構(gòu)象變化的機(jī)制，本研究構(gòu)建了野生型NF2WT和模擬518位絲氨酸組成型磷酸化的突變型NF2S518D兩種重組質(zhì)粒，并對(duì)兩者進(jìn)行了表達(dá)純化和晶體的篩選，希望通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段，從原子水平解讀NF2蛋白的構(gòu)象變化方式，對(duì)NF2的分子內(nèi)相互作用機(jī)制及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制作出更為直觀的解釋。除此之外，本研究進(jìn)一步采用體外Pull－down實(shí)驗(yàn)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)兩種NF2蛋白的分子內(nèi)相互作用，進(jìn)而從生化水平驗(yàn)證兩種蛋白的構(gòu)象變化，對(duì)結(jié)論給予佐證。

實(shí)驗(yàn)證明，NF2蛋白與同家族蛋白FERM結(jié)構(gòu)域無(wú)論在序列還是結(jié)構(gòu)上均有很高的相似度。然而，其序列不保守的362～595段序列在純化與結(jié)晶的過(guò)程中均發(fā)生很大程度的降解，致使18～595段完整序列的結(jié)構(gòu)無(wú)法解析。解析出的部分結(jié)構(gòu)與人源或鼠源同家族蛋白的N－端FERM結(jié)構(gòu)域基本相似。

由于無(wú)法從原子水平看到518位絲氨酸磷酸化前后NF2蛋白構(gòu)象的不同，本研究采用GST Pulldown及FRET的研究方法，在體外檢測(cè)NF2蛋白N端和C端的分子間相互作用強(qiáng)度，從側(cè)面求證蛋白內(nèi)部相互作用關(guān)系。GST Pull－down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：518位模擬磷酸化突變后，NF2蛋白的C端與N端的結(jié)合更加緊密，分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。在FRET實(shí)驗(yàn)中，相較 FRET－NF2WT而言，F(xiàn)RETNF2S518D組檢測(cè)到了更強(qiáng)的FRET信號(hào)，即CFP和YFP距離更為接近，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步支持上述推斷：溶液狀態(tài)下的NF2蛋白在518位絲氨酸被磷酸化后，N端和C端的分子內(nèi)相互作用更強(qiáng)。

綜上所述，處于活性狀態(tài)的NF2蛋白，其N端和C端分子內(nèi)相互作用強(qiáng)度較弱，蛋白質(zhì)整體呈“開(kāi)放”狀態(tài)，而518位絲氨酸被磷酸化后，NF2蛋白活性喪失，此時(shí)分子內(nèi)相互作用較強(qiáng)，蛋白質(zhì)處于“閉合”構(gòu)象，這與最新的研究結(jié)果一致［28］。今后的研究中，我們擬進(jìn)行突變體篩選以提高NF2蛋白自身穩(wěn)定性，避免其分子內(nèi)降解，有望從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度揭示NF2蛋白518位絲氨酸磷酸化對(duì)其構(gòu)象調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

致謝上海光源BL17U線站工作人員在晶體數(shù)據(jù)采集過(guò)程中提供了幫助。

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