液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中法莫替丁膠囊含量及其生物等效性評(píng)價(jià)

何承霖 陸 燁 莊曉珺 梁建英

（1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院藥劑科 上海 200011）

法莫替丁屬于第3代組胺H2受體拮抗劑，具有拮抗胃黏膜壁細(xì)胞的組胺H2受體并抑制胃酸分泌的作用，與其結(jié)構(gòu)類似物雷尼替丁或西米替丁相比，具有更好的療效［1］。目前臨床上主要用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及由胃酸分泌過(guò)多所引起的疾病。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)已有數(shù)種常見(jiàn)的血漿中法莫替丁含量的測(cè)定方法，包括毛細(xì)管電泳法［2－3］，高效液相色譜－紫外檢測(cè)法［4］以及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［5－6］等。文獻(xiàn)中血樣前處理大多采用液液提取或固相萃取，方法相對(duì)繁瑣；樣品測(cè)定采用HPLC法，靈敏度較差；報(bào)道的液質(zhì)聯(lián)用法樣品制備繁瑣［7］或者基質(zhì)效應(yīng)較大［8］。本文以甲醇沉淀蛋白上清液用水1∶1稀釋，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定血漿中法莫替丁的含量，方法更加準(zhǔn)確、快速。運(yùn)用建立的方法，以上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的法莫替丁膠囊為參比制劑，對(duì)福建三愛(ài)藥業(yè)有限公司研制的法莫替丁膠囊進(jìn)行相對(duì)生物利用度及其生物等效性評(píng)價(jià)的研究。通過(guò)測(cè)定23名健康志愿者交叉口服給藥后的經(jīng)時(shí)過(guò)程的血藥濃度，對(duì)計(jì)算所得的相對(duì)生物利用度以及有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax、tmax、AUC0－t、AUC0－∞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理并作出是否具有生物等效性的評(píng)價(jià)。

材料和方法

藥品與試劑 試驗(yàn)?zāi)z囊（T）（法莫替丁膠囊，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：120601，福建三愛(ài)藥業(yè)有限公司）；參比膠囊（R）（法莫替丁膠囊，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：51120105，上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司）；法莫替丁對(duì)照品（批號(hào)：10305－0001，中國(guó)生物制品檢定所）；內(nèi)標(biāo)鹽酸雷尼替?。ㄅ?hào)：100163－2041006，中國(guó)生物制品檢定所）；甲醇（HPLC級(jí)，批號(hào)：1586807117，德國(guó)默克公司）；甲酸（批號(hào)：14105，北京迪馬科技公司）；去離子純水均取自 Millipore Direct－Q純凈水發(fā)生器。

儀器 API－3000質(zhì)譜檢測(cè)器（美國(guó)Applied Biosystems公司）以及 Analyst色譜工作站（1．4．1版本，美國(guó)Applied Biosystems公司），Agilent公司1100型高效液相色譜儀，包括G1312A四元泵，G1316A柱溫箱，G1379A在線脫氣機(jī)和CTC HTS型控溫自動(dòng)進(jìn)樣器（瑞士CTC Analytics公司）；離心機(jī)：型號(hào)TGL－16G型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋渦混合器：型號(hào)KW－80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

色譜條件 色譜柱為Venusil XBP苯基柱（100 mm×2．1 mm，5μm）；流動(dòng)相為0．1%甲酸水溶液－甲醇（體積分?jǐn)?shù)為60∶40）；流速為0．30 mL／min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μL。

質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源（Electronic Spray Ion，ESI）；正離子方式檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴射電壓為5 000 V；離子源溫度為500℃；氣簾氣流速為10 L／min，霧化氣流速為8 L／min，碰撞氣流速為4L／min，掃描時(shí)間為0．2 s。

LC／MS／MS條件的優(yōu)化 采用正離子方式檢測(cè)，按擬訂的優(yōu)化程序分別優(yōu)化法莫替丁與雷尼替丁的測(cè)定條件，在一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中得到法莫替丁的準(zhǔn)分子離子峰（Q1）［M＋H］＋（m／z：338．3），然后選擇性對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析得到主要碎片離子（Q3）（m／z：189．2），最后再通過(guò)法莫替丁的Q1／Q3對(duì)CE、DP等參數(shù)逐一優(yōu)化。內(nèi)標(biāo)物雷尼替丁的LC／MS／MS條件優(yōu)化步驟與法莫替丁相同。用于定量和定性分析的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)表Tab 1 Parameters of mass spectrum

血漿樣品處理 精密移取血漿200μL，置于1．5 mL EP管內(nèi)，加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液與800μL甲醇渦旋1 min，于12 000×g離心10 min，取上清液1∶1純水稀釋后進(jìn)樣10μL，進(jìn)行 LC／MS／MS分析。

藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

受試者的選擇 本試驗(yàn)選擇24名男性健康志愿受試者，年齡為（25．42±3．72）歲，身高為（173．04±4．12）cm，體重為（67．08±4．22）kg，體重指數(shù)（body mass index，BMI）為18～24。經(jīng)詢問(wèn)病史并進(jìn)行臨床檢查及生化檢查證實(shí)心、肺、肝、腎功能均正常，無(wú)消化道、代謝異常病史，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病史及過(guò)敏史，無(wú)藥物依賴史，身體健康志愿參加法莫替丁生物利用度試驗(yàn)。受試者在試驗(yàn)前2周至整個(gè)試驗(yàn)期間禁服任何其他藥物，并簽署知情同意書(shū)。后1人因自身原因退出試驗(yàn)，因此實(shí)際完成試驗(yàn)人數(shù)為23人。

圖1 空白血樣色譜圖Fig 1 Chromatograms of blank plasma

試驗(yàn)方案 24名男性健康志愿受試者禁食過(guò)夜（10 h以上），于次日早晨單劑量空腹服用等劑量試驗(yàn)?zāi)z囊或參比膠囊40 mg，用250 mL溫開(kāi)水送服。本試驗(yàn)采用隨機(jī)、單盲、交叉試驗(yàn)的方法，將24名受試者隨機(jī)編號(hào)分為兩組，交叉口服給藥進(jìn)行試驗(yàn)。血樣采集前，埋置肝素留置針頭，服藥前取空白血樣（0h），給藥后于0．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5、4、6、8、12、16 h共13個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別于前臂肘正中靜脈采集靜脈血3 mL，收集于加有肝素的離心管內(nèi)，4 000×g離心10 min，分離出血漿置于－20℃冰箱中保存。用藥期間和用藥過(guò)后，受試者均未發(fā)生任何不良反應(yīng)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用DAS 2．1．1軟件對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)（cmax、AUC0－t、AUC0－∞等）進(jìn)行計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié) 果

方法學(xué)驗(yàn)證

分析方法特異性 在本試驗(yàn)條件下，法莫替丁的保留時(shí)間約為1．30 min，內(nèi)標(biāo)（雷尼替丁）的保留時(shí)間約為1．38 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與測(cè)定藥物分離完全，不干擾藥物測(cè)定。其典型圖譜見(jiàn)圖1～3。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取若干只1．5 mL EP管，各加入空白血漿190μL，加入法莫替丁對(duì)照品溶液10μL，使血漿中藥物濃度分別為2．5、5．0、10．0、25．0、50．0、100．0、250．0ng／mL，每個(gè)濃度5管，按“血樣處理”項(xiàng)下的方法操作后，作LC／MS／MS分析。以樣品峰面積（Ai）與內(nèi)標(biāo)峰面積（As）比值對(duì)藥物濃度（C，ng／mL）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算結(jié)果為Y＝0．002 102X＋0．001 837（r＝0．999 9，n＝7）。線性范圍：2．5～250 ng／mL。

圖2 空白血樣加法莫替丁與內(nèi)標(biāo)雷尼替丁的色譜圖Fig 2 Chromatograms of control of Famotidine and control of Ranitidine

圖3 志愿者血樣加內(nèi)標(biāo)雷尼替丁色譜圖Fig 3 Chromatograms of sample plasma with Ranitidine

精密度試驗(yàn) 配制定量限、低、中、高4個(gè)點(diǎn)（2．5、5．0、50．0、250．0ng／mL）的標(biāo)準(zhǔn)血樣各6份，于同一天按血樣預(yù)處理的方法操作后進(jìn)樣10μL，作LC／MS／MS分析，計(jì)算批內(nèi)精密度連續(xù)3天，同法作LC／MS／MS分析，綜合3天的數(shù)據(jù)，計(jì)算批間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

準(zhǔn)確度試驗(yàn)-方法回收率 取健康人的空白血漿190μL若干，分別加入法莫替丁對(duì)照品溶液，使法莫替丁濃度分別為2．5、5．0、50．0、250．0ng／mL，再按“血樣預(yù)處理”項(xiàng)下的方法操作后，作LC／MS／MS分析。將藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算所得的濃度除以理論濃度，即得方法回收率，分別為99．64%、97．23%、99．18%、99．47%，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

提取回收率試驗(yàn) 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對(duì)照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、50．0、250．0ng／mL，按血樣預(yù)處理后作LC／MS／MS分析，記錄藥物峰面積。另取相同量的法莫替丁對(duì)照液，用流動(dòng)相稀釋后，進(jìn)相同量的法莫替丁，記錄峰面積，計(jì)算提取回收率，分別為89．29%、93．37%、87．10%，計(jì)算 RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Tab 2 Result of method validation （RSD%）

結(jié)果表明該法莫替丁血樣測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，精密度好，適用于臨床研究中法莫替丁血樣的分離分析。

樣品穩(wěn)定性考察

樣品冰凍穩(wěn)定性 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對(duì)照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、60．0、300．0ng／mL，放置在－20℃冰箱中，分別于冷凍后的0、30及45天后取出測(cè)定，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

樣品凍融穩(wěn)定性 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對(duì)照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、60．0、300．0ng／mL，放置在－20℃冰箱中，然后分別凍融3次測(cè)定其峰面積比值，計(jì)算RSD，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。

復(fù)溶溶液穩(wěn)定性 取5．0、60．0、300．0ng／mL 3種濃度的復(fù)溶溶液數(shù)份，室溫放置，并分別于0、8、24 h測(cè)定其峰面積比值，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 3 Stability of samples （RSD%）

結(jié)果表明法莫替丁血樣冰凍穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性良好，復(fù)溶溶液在24 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。

基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿直接經(jīng)甲醇蛋白沉淀前處理，取上清液，即得空白基質(zhì)溶液。在50%甲醇溶液和經(jīng)過(guò)處理的空白基質(zhì)溶液中精確加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3種濃度測(cè)試溶液，取10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行分析，比較甲醇溶液和空白基質(zhì)溶液中被測(cè)組分的峰面積，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

各被測(cè)組分的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4，可知各濃度血樣基質(zhì)效應(yīng)為89．01%～95．73%，基質(zhì)效應(yīng)較小。

表4 各濃度樣品的基質(zhì)效應(yīng)Tab 4 Matrix effect of samples （n＝5）

測(cè)定方法的質(zhì)量控制 取健康人空白血漿190 μL數(shù)份，分別加法莫替丁對(duì)照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、50．0、250．0ng／mL，其余同血樣的預(yù)處理項(xiàng)下步驟操作，作為質(zhì)控樣品。每天志愿者血樣測(cè)定時(shí)，隨行進(jìn)行質(zhì)控樣品測(cè)定，以考察方法可靠性。

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及生物等效性評(píng)價(jià)

藥－時(shí)曲線 23名受試者分別口服法莫替丁的參比膠囊和試驗(yàn)?zāi)z囊后，血漿中法莫替丁的平均血藥濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖4。

圖4 23名健康受試者口服法莫替丁參比膠囊或試驗(yàn)?zāi)z囊的藥－時(shí)曲線Fig 4 Plasma concentrations－time curve of Famotidine after oral administration of Famotidine reference capsules and tested capsules in 23healthy subjects

藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 本實(shí)驗(yàn)采用DAS 2．1．1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，23名受試者口服法莫替丁參比膠囊或試驗(yàn)?zāi)z囊后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 23名健康受試者口服法莫替丁參比膠囊和試驗(yàn)?zāi)z囊后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 5 Pharmacokinetic parameters of Famotidine after oral administration of Famotidine reference capsules and tested capsules in 23healthy subjects

生物等效性分析 經(jīng)方差分析，兩種膠囊cmax、AUC0－t、AUC0－∞藥劑間、周期間的F 值均小于相應(yīng)的F臨界值，說(shuō)明兩者在藥劑間與周期間無(wú)顯著性差異；雙向單側(cè)t檢驗(yàn)和（1－2α）置信區(qū)間法計(jì)算所得結(jié)果表明，兩種膠囊cmax、AUC0－t、AUC0－∞的tL≥t（1－0．05）與tH≥t（1－0．05）同時(shí)成立，并且試驗(yàn)?zāi)z囊和參比膠囊 AUC0－t幾何均值比的90%CI（80．7%～97．4%）以 及 AUC0－∞的 90%CI（80．0% ～96．5%）均落在等效標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（80%～125%），cmax幾何均值比的90%CI（80．4%～100．6%）也落在等效標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（75%～133%），試驗(yàn)?zāi)z囊與參比膠囊的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。因此，生物等效性分析結(jié)果表明兩種膠囊間主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩者具有生物等效性。

討 論

法莫替丁分子結(jié)構(gòu)中含有一強(qiáng)極性胍基，水溶性較大，文獻(xiàn)中即使采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定樣品，前處理亦大多采用有機(jī)溶劑提取或固相萃取法［7］，前處理所需時(shí)間較長(zhǎng)且操作繁瑣。本文采用甲醇以水相與有機(jī)相1∶4沉淀蛋白，方法簡(jiǎn)便快速，可在約10 min時(shí)同時(shí)處理多達(dá)12份血樣。同時(shí)在進(jìn)樣前用純水1∶1稀釋上清液，與同樣采用蛋白沉淀液質(zhì)聯(lián)用的測(cè)定方法［8］相比大大降低了試驗(yàn)的基質(zhì)效應(yīng)，低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)可達(dá)到89．01%～95．73%，而且也能得到令人滿意的提取回收率，平均可達(dá)85%以上，提取效果優(yōu)于已有的文獻(xiàn)報(bào)道［8］。本試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快速，樣品的分析時(shí)間較短，可滿足臨床研究中大量樣品的快速分析。

另外，本文選擇結(jié)構(gòu)與法莫替丁比較相似的雷尼替丁作為內(nèi)標(biāo)，在樣品的前處理過(guò)程中具有相近的提取回收率，可以為定量方法提供更好的準(zhǔn)確度和精密度。

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